KR102670660B1 - Hhdp 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법 - Google Patents

Hhdp 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 메틸 갈레이트(methyl gallate) 및 배 유래 산화효소원을 혼합한 후, 산화 반응시켜 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물은 HHDP 디메틸 에스테르 화합물을 포함하고, 상기 메틸 갈레이트 산화 반응물 및 이로부터 분리된 HHDP 디메틸 에스테르는 티로시나아제 저해 활성과 멜라닌 합성 억제 활성이 메틸 갈레이트에 비해 우수하므로, 피부 미백용 기능성 화장품, 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 이의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법{Manufacturing method of methyl gallate oxidation reactant containing hexahydroxydiphenic acid dimethyl ester}
본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
표피 기저층의 멜라닌 세포는 피부의 다양한 자극 요인에 의해 멜라닌이 생성되고, 이 멜라닌이 각질층에 도달하여 과색소 침착증을 유발하면 피부가 검게 보인다. 멜라닌 합성에 관여하는 요인으로는 난포 호르몬, 황체 호르몬, 색소 세포 자극 호르몬, 자외선, 스트레스 그리고 유전 등이 있다.
불필요해진 멜라닌 색소를 재빨리 배출해서 그 사람이 지니고 있는 본래 피부의 투명함을 되찾는 것을 피부 미백이라 한다. 식품의약품안전청에 미백 성분으로 등록된 물질은 닥나무 추출물, 알부틴, 에틸아스코빌에텔, 유용성 감초 추출물, 아스코빌글루코사이드, 나이아신아마이드, 알파-비사볼올 및 아스코빌테트라이소팔미테이트 등이 있으며, 이와 같은 물질을 이용해 로션이나 액제, 크림, 마스크팩 등으로 만드는 것이 미백 화장품이다.
닥나무 추출물, 알부틴, 알파-비사볼올 및 유용성 감초 추출물은 멜라닌 합성에 관여하는 티로시나아제 효소가 활성화되는 것을 억제하고, 아스코빌글루코사이드, 에틸아스코빌에텔 및 아스코빌테트라이소팔미테이트는 티로시나아제 효소에 자극받은 티로신이 산화되는 것을 억제하며, 나이아신아마이드는 이미 생성된 멜라닌이 멜라닌 세포에서 각질형성세포로 넘어가는 단계를 억제하여 멜라닌이 실제 피부 세포에 들어가는 마지막 단계를 막는다.
미용이 아닌 의료 목적으로 사용되는 대표적인 물질은 의약품으로 처방되는 하이드로퀴논이며, 주로 피부 연고로 사용된다. 한국에서 이 물질이 4% 이상 함유된 연고를 구입하려면 반드시 의사의 처방이 있어야 하며, 2% 연고는 처방전 없이도 약국에서 구입할 수 있다. 의료 목적으로 사용되는 하이드로퀴논 연고는 미백 화장품과는 다르게 멜라닌이 있는 피부 세포를 직접 파괴해 새로운 피부 세포가 자라도록 돕는다.
하지만, 상기 물질들은 비교적 높은 농도에서만 티로시나아제 활성 저해 효과가 나타나거나, 안정성이 낮아 효과가 오래 지속되지 못하는 등 제품의 적용 범위가 좁다는 문제점이 있으며, 하이드로퀴논은 피부자극 및 안정성 문제로 인하여 화장료에서의 사용이 제한되고 있다.
한편, 메틸 갈레이트(methyl gallate, MG)는 methyl-3,4,5-trihydroxybenzoic acid로 일반명으로 갈리신(gallicin)이라고도 한다. 메틸 갈레이트에 대한 생리 활성 연구로는 항바이러스성 활성, 항산화 활성 및 항균효과, 구강암세포의 성장 억제효과 등이 보고되고 있다.
한편, 한국공개특허 제1999-0086660호에 메틸 갈레이트를 함유하는 미백 화장료 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0907685호에 노근으로부터 분리한 페놀성 화합물(메틸 갈레이트 포함)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 메틸 갈레이트에 배 유래의 산화효소를 첨가하여 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 메틸 갈레이트 산화 반응물 및 이로부터 분리된 화합물인 HHDP 디메틸 에스테르가 멜라닌 세포에서 티로시나아제 저해 활성 및 멜라닌 합성 억제 활성이 메틸 갈레이트에 비해 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 메틸 갈레이트(methyl gallate) 및 배 유래 산화효소원을 혼합한 후, 산화 반응시키는 단계;를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 메틸 갈레이트(methyl gallate) 및 배 유래 산화효소원을 혼합한 후, 산화 반응시켜 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물은 HHDP 디메틸 에스테르 화합물을 포함하고, 상기 메틸 갈레이트 산화 반응물 및 이로부터 분리된 HHDP 디메틸 에스테르는 티로시나아제 저해 활성과 멜라닌 합성 억제 활성이 메틸 갈레이트에 비해 우수하므로, 피부 미백, 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 메틸 갈레이트(A), 메틸 갈레이트 산화 반응물(B) 및 MGP-1(C)의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 메틸 갈레이트 산화 반응물(Oxidation reactant) 처리에 따른 멜라닌 세포(B16F10)에서의 티로시나아제 활성을 나타낸 결과이다. α-MSH를 처리하여 티로시나아제 활성을 유도하였다. *, **은 메틸 갈레이트 처리군에 비해 티로시나아제 활성이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01이다.
도 3은 본 발명의 메틸 갈레이트 산화 반응물(Oxidation reactant) 처리에 따른 세포(B16F10)에서의 멜라닌 합성량을 나타낸 결과이다. α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도하였다. *, **은 메틸 갈레이트 처리군에 비해 멜라닌 합성이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01이다.
도 4는 본 발명의 MGP-1(HHDP 디메틸 에스테르) 처리에 따른 멜라닌 세포(B16F10)에서의 티로시나아제 활성을 나타낸 결과이다. α-MSH를 처리하여 티로시나아제 활성을 유도하였다. MG는 메틸 갈레이트 처리군이고, 알부틴(arbutin)은 양성 대조군이다.
도 5는 본 발명의 MGP-1(HHDP 디메틸 에스테르) 처리에 따른 멜라닌 세포(B16F10)에서의 멜라닌 합성량을 나타낸 결과이다. α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도하였다. MG는 메틸 갈레이트 처리군이고, 알부틴(arbutin)은 양성 대조군이다. *, **은 메틸 갈레이트 처리군에 비해 멜라닌 합성이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01이다.
도 6은 본 발명의 MGP-1(HHDP 디메틸 에스테르) 처리에 따른 미백 효능 관련 인자의 단백질 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과(A) 및 이를 정량한 결과(B)이다. 알부틴(arbutin)은 양성 대조군이다. *, **은 α-MSH 단독 처리군 대비 단백질 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01이다.
도 7은 본 발명의 메틸 갈레이트 산화 반응물 및 MGP-1(HHDP 디메틸 에스테르)의 멜라닌 세포(B16F10)에서의 세포 독성을 나타낸 결과이다.
도 8은 산화 반응시간(A), 메틸 갈레이트 농도(B), 효소원 농도(C) 및 반응온도(D)에 따른 MGP-1 생성량을 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메틸 갈레이트(methyl gallate) 및 배 유래 산화효소원을 혼합한 후, 산화 반응시키는 단계;를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법을 제공한다.
상기 메틸 갈레이트 산화 반응물은 하기 화학식 1로 표시되는 HHDP 디메틸 에스테르(hexahydroxydiphenic acid dimethyl ester)를 포함할 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 배 유래 산화효소원은 배 유래의 폴리페놀 산화효소를 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 제조방법은 구체적으로
1) 배 과육과 물을 혼합한 후, 분쇄한 다음 여과하여 여액인 배 유래 산화효소원을 획득하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 획득한 배 유래 산화효소원과 에탄올에 용해된 메틸 갈레이트를 혼합한 후, 10~50℃에서 20~200분 동안 교반하며 산화 반응시키는 단계;를 포함할 수 있고,
더 구체적으로
1) 200g의 배 과육과 100~400mL의 물을 혼합한 후, 분쇄한 다음 여과하여 여액인 배 유래 산화효소원을 획득하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 획득한 배 유래 산화효소원과 10mL의 에탄올에 100~400mg의 메틸 갈레이트가 용해된 용해물을 혼합한 후, 20~40℃에서 110~140분 동안 교반하며 산화 반응시키는 단계;를 포함할 수 있고,
더욱더 구체적으로
1) 200g의 배 과육과 200mL의 물을 혼합한 후, 분쇄한 다음 여과하여 여액인 배 유래 산화효소원을 획득하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 획득한 배 유래 산화효소원과 10mL의 에탄올에 200mg의 메틸 갈레이트가 용해된 용해물을 혼합한 후, 30℃에서 120분 동안 교반하며 산화 반응시키는 단계;를 포함할 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 제공한다.
메틸 갈레이트는 배 유래 산화효소원과의 산화 반응에 의해 HHDP 디메틸 에스테르로 전환되는 특징이 있다.
또한, 본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 메틸 갈레이트 산화 반응물은 티로시나아제의 활성 억제능과 멜라닌 합성 억제능이 우수하여 피부 미백에 대한 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 티로시나아제 활성 저해능 및 멜라닌 합성 저해능이 우수한 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하고 있어, 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선에 효과가 있다.
본 명세서에서 용어 "멜라닌 색소 과다 침착(hyperpigmentation)"은 피부 또는 손·발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다. 상기 멜라닌 색소 과다침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다색소침착, 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 또는 임신성 갈색반(gravidic chloasma) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 이너뷰티 푸드(inner beauty food)의 형태로 섭취함으로써 더욱 우수한 효과를 갖는 장점을 가진다. 상기 이너뷰티는 '먹는 화장품 또는 뷰티 푸드'로 일컬어지는 푸드로, 피부에 좋은 여러 가지 성분을 몸속으로 흡수시켜 피부 체질을 건강하게 바꾸는 식품을 지칭하며, 피부 타입에 맞는 화장품을 고르듯 피부 컨디션과 라이프스타일을 고려해 개개인에게 맞는 이너뷰티 푸드를 선택하여 섭취할 수 있다. 전술한 화장료 조성물을 포함하는 화장품과 본 발명의 화합물을 포함하는 이너뷰티 푸드를 혼용할 경우, 화장품만 사용하는 것에 비해 피부 미백 효과가 월등히 높아져 멜라닌 색소 과다 침착 질환에 더욱 효과적일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 상기 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 "멜라닌 색소 과다 침착 질환"은 전술한 것과 같다.
본 발명의 약학 조성물은 티로시나아제 활성 저해능 및 멜라닌 합성 저해능이 우수한 본 발명의 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 포함하고 있어, 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 HHDP 디메틸 에스테르는 본원 발명의 제조방법으로부터 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물로 부터 분리된 것을 특징으로 하지만, 이에 제한하는 것은 아니며, 다른 천연물로부터 분리하거나 합성하는 것이 얼마든지 가능하다.
본 명세서에서 용어 "이의 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생물학적 특성을 유지하면서 독성을 나타내지 않거나 제약 용도로 부적절하지 않은 임의의 본 발명 화합물의 염을 나타낸다. 이러한 염은 당업계에 공지된 다양한 유기 및 무기 반대이온으로부터 유래할 수 있으며, 이들을 포함한다. 이러한 염으로는 유기 또는 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 술팜산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로 펜틸프로피온산, 글리콜산, 글루타르산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 소르브산, 아스코르브산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 크르산, 신남산, 만델산, 프탈산, 라우르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄-디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠 술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 캄포르산, 캄포르술폰산, 4-메틸비시클로 [2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 테르트-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 시클로헥실술팜산, 퀸산 또는 뮤콘산 등과 형성된 산 부가염; 또는 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온(예를 들면, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온 또는 알루미늄 이온), 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속수산화물(예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 리튬, 아연 및 바륨 수산화물), 암모니아로 치환되거나, 또는 유기 염기, 예컨대 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민, 예를 들면 암모니아, 메틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민, 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질페네틸아민, N-메틸글루카민 피페라진, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 또는 테트라메틸암모늄 히드록시드와 배위 결합한 경우에 형성된 염 등을 포함할 수 있다.
또한, 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 또는 테트라알킬암모늄 염 등이 있으며, 화합물이 염기성 관능기를 함유하는 경우에는 비독성유기산 또는 무기산과의 염, 예컨대 히드로할라이드(예를 들면, 히드로클로라이드 또는 히드로브로마이드), 술페이트, 포스페이트, 술파메이트, 니트레이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 프로피오네이트, 헥사노에이트, 시클로펜틸프로피오네이트, 글리콜레이트, 글루타레이트, 루베이트, 락테이트, 말로네이트, 숙시네이트, 소르베이트, 아스코르베이트, 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 시트레이트, 벤조에이트, 3-(4-히드록시벤조일푸마레이트, 타르타레이트, 시트레이트, 벤조에이트, 3-(4-히드록시벤조일)벤조에이트, 피크레이트, 신나메이트, 만델레이트, 프탈레이트, 라우레이트, 메탄술포네이트 메실레이트), 에탄술포네이트, 1,2-에탄-디술포네이트, 2-히드록시에탄술포네이트, 벤젠술포네이트(베실레이트), 4-클로로벤젠술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 4-톨루엔술포네이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실레이트, 글루코헵토네이트, 3-페닐프로피오네이트, 트리메틸아세테이트, 테르트-부틸아세테이트, 라우릴 술페이트, 글루코네이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 히드록시나프토에이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 시클로헥실술파메이트, 퀴네이트 또는 뮤코네이트 염 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조
1) 배 유래 산화효소원 제조
배(korean pear) 유래의 효소원을 제조하여 메틸 갈레이트 산화 반응물 제조에 사용하였다. 2020년 10월에 경상북도 영천시에서 수확한 배의 과육 200g에 증류수 200mL를 첨가하고 믹서기로 분쇄한 후, 5겹 거즈를 이용해 여과하여 여액인 배 유래 산화효소원을 제조하였다. 상기 배 유래 산화효소원의 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidase) 활성은 피로갈롤(pyrogallol)을 기질로 사용하여 산화 반응 후 생성되는 벤조트로폴론(benzotropolone)의 양을 UV 분광기를 이용하여 360nm에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다. 상기 효소원 1.5mL와 50mM 인산나트륨 완충 버퍼(pH 7.2)에 희석된 200mM 피로갈롤 1.5mL를 혼합하여 석영셀에 넣고 5분 동안 산화 반응을 유도한 후, 흡광도를 측정하였고, OD360=0.71~0.75인 산화효소원을 이후 산화물 제조에 이용하였다. Blank군은 1.5mL의 기질용액과 증류수 1.5mL를 첨가하여 측정하였다.
2) 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조
100%(v/v) 에탄올 10mL에 순도 99% 이상의 메틸 갈레이트(methyl gallate) 100mg을 희석하고, 상기 제조된 배 유래 산화효소원(OD360=0.71~0.75) 300mL와 함께 1L 비이커에 담은 후, 교반기를 이용하여 상온(20±5℃)에서 120분 동안 반응시켰다. 이후, 저온감압 농축기를 이용하여 건조하였고, 상기와 같은 방법을 총 20회 반복하여 메틸 갈레이트 산화 반응물(1.6g)을 수득하였다.
실시예 1. 메틸 갈레이트 산화 반응물로부터 신규 생성된 화합물의 분리 및 동정
1) 메틸 갈레이트 산화 반응물로부터 신규 생성된 화합물의 분리
상기 제조예 1에서 제조한 메틸 갈레이트 산화 반응물의 성분 변화를 확인하기 위해, HPLC를 수행하였다. HPLC 분석 조건은 하기 표 1에 개시된 바와 같다. 이동상 용매 A로는 0.1%(v/v) 포름산(formic acid, HCOOH)을 사용하였고, 용매 B로는 아세토니트릴(acetonitrile, MeCN)을 사용하였으며, 구배 용리(gradient elution)를 100% 용매 A로 분석을 시작하여 최종 100% 용매 B로 30분 동안, 이동상의 유속 1.0mL/min을 유지하며 280nm에서 화합물을 검출하였다.
HPCL 결과, 도 1A 및 1B에 개시된 바와 같이 메틸 갈레이트 산화 반응물에서는 메틸 갈레이트에서는 검출되지 않은 신규 생성된 피크가 존재하는 것을 확인하였다.
매개변수 조건
기기 Shimadzu LC20AD
검출기 Shimadzu SPD-M20A photodiode-array detector(PDA)
파장 280nm
컬럼 YMC-Pack ODS A-302 컬럼(4.6mm i.d.x150mm)
오븐 온도 40℃
유속 1.0mL/min
주입 부피 5㎕
이동상 시간(분) 용매 A: 0.1% HCOOH 용매 B: MeCN
0 100 0
10 80 20
15 50 50
20 30 70
25 0 100
30 0 100-종료
신규 생성물은 칼럼크로마토그래피법을 이용하여 분리, 정제를 수행하였다. 메틸 갈레이트 산화 반응물을 직경 2.5cm의 칼럼에 Toyoperal HW-40 겔을 40cm의 높이까지 충진한 후, MeOH을 이용하여 단단하게 채웠다. 이후 메틸 갈레이트 산화 반응물(1.5g)을 MeOH 5mL에 녹인 후 용액을 칼럼에 흡착하였으며, MeOH을 용출시켜 subfration KM01에서 KM06까지 수득하였다. 6개의 subfraction은 HPLC 분석으로 생성된 피크를 확인하였다. 그중 subfracation KM03 및 KM06에 신규 생성된 피크가 검출되었으며 상대적으로 풍부하게 함유되어 있음을 확인하였다. 이에 KM03을 YMC ODS 겔을 충진제로 활용한 칼럼크로마토그래피를 수행하였으며, 신규 생성 화합물인 MGP-1을 분리 정제하였다. MGP-1은 545mg을 수득하였다. 분리된 단일 물질의 순도는 HPLC 분석을 통해 확인하였다(도 1C).
정제된 단일물질은 UV, NMR 및 FABMS 스펙트럼 측정을 통해 화합물의 구조를 동정하였다.
2) 메틸 갈레이트 산화 반응물로부터 신규 생성된 화합물(MGP-1)의 동정
분리된 화합물 MGP-1은 갈색의 무결정형 분말상 형태로 화합물을 수득하였으며, ESIMS 스펙트럼 측정결과 m/z 389 [M+Na]+의 base peak를 확인하여 화합물의 분자량을 추정하였으며, 분자식은 C16H14O10으로 확인하였다.
1H NMR 스펙트럼 측정한 결과 aromatic proton에 해당하는 시그널이 δ 7.08(2H, s, H-2, 2')에서 관찰되었으며 그 외 aromatic 영역에 해당하는 시그널은 관찰되지 않았다. 추가적으로 δ 3.50(6H, s, 7/7'-OCH3)에 해당하는 methoxy 그룹이 관찰되어 메틸 갈레이트의 고유 시그널을 확인하였다.
13C-NMR 및 HSQC 스펙트럼 해석으로 carbonyl carbon에 해당하는 시그널이 δ 168.4(C-7, 7')에서 관찰되었으며, 12개의 aromatic 영역에 해당하는 carbon 시그널이 관찰되어 메틸 갈레이트의 이량체 화합물임을 추정하였다. 특히 C-6 및 6'에 해당하는 시그널인 δ 109.4로 관찰되어 C-C 결합임을 확인하였다.
정확한 관능기의 결합을 확인하기 위하여 2D NMR을 측정하였다. HMBC 스펙트럼에서 H-2/2'는 C-1, 3, 4, 6, 7까지 HMBC 상관관계가 나타났고, methoxy 그룹은 C-7까지 상관관계를 나타내어 methoxy 그룹은 C-7에 결합되어 있음을 확인하였다. NMR 및 ESIMS 스펙트럼 결과로 MGP-1은 메틸 갈레이트가 C-C 결합으로 이량체화된 HHDP 디메틸 에스테르로 구조를 결정하였다.
화합물 MGP-1의 biphenyl에 해당하는 절대배열을 증명하기 위하여 CD 스펙트럼을 측정하였으며, 225nm 부근에서 positive Cotton effect를, 250nm 부근에서 negative Cotton effect를 나타내어 S-배열로 증명하였다.
이상의 결과로 MGP-1은 메틸 갈레이트가 폴리페놀 산화효소에 의하여 이량체화된 화합물로 (S)-HHDP dimethyl ester로 구조 결정(화학식 1)하였으며, 산화 반응물의 주요 화합물임을 확인하였다.
실시예 2. 메틸 갈레이트 산화 반응물의 미백 효과
1) 티로시나아제 저해 활성 측정
본 발명의 제조방법으로 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물의 미백 효능을 평가하기 위하여 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 티로시나아제의 저해 활성을 측정하였다. 마우스 유래의 멜라닌 세포(B16F10)를 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, 100U/mL)이 첨가된 DMEM(Dulbeco's modified eagle’medium) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에 적응시키며 계대 배양하였다. 그 후 안정화된 세포를 100mm 컬처 디쉬에 2×106 세포/디쉬가 되도록 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 제조예 1의 시료를 농도별로 조제하여 2mL씩 첨가하여 1시간 동안 전처리하였다. 이후, 각 웰에 1nM의 α-MSH를 48시간 동안 처리하여 티로시나아제 활성을 유도하였다. 48시간 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척하고 세포에 용해 버퍼(lysis buffer)를 200㎕씩 분주한 후 세포를 수거하여 얼음에서 30분 동안 용해시켰다. 이후, 원심분리하여 얻은 상층액에 100mM의 소듐포스페이트(Sodium Phosphate, NaH2PO4)를 처리하고 37℃에서 5분 동안 반응시킨 다음, 100 mM의 카테콜 솔루션(catechol solution)을 첨가하고 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 본 발명의 메틸 갈레이트 산화 반응물은 α-MSH에 의해 증가된 티로시나아제 활성을 농도 의존적으로 저해하였고, 메틸 갈레이트에 비해 티로시나아제 저해 활성이 우수하였다.
2) 멜라닌 합성 억제 활성 측정
본 발명의 메틸 갈레이트 산화 반응물의 미백 효능을 평가하기 위하여 멜라닌 합성 억제 활성을 측정하였다. 마우스 유래의 멜라닌 세포(B16F10)를 12웰 플레이트에 1×106 세포/㎖가 되도록 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 제조예 1의 산화 반응물을 농도별로 1시간 동안 각각 전처리하였다. 이후, 각 웰에 1nM의 α-MSH를 48시간 동안 처리하여 멜라닌 합성을 유도하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 PBS로 세척하고 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 얻었다. 1N NaOH에 DMSO가 10%(v/v)가 되도록 제조한 용액 200㎕를 침전된 멜라닌 세포에 첨가하여 60℃에서 1시간 동안 용해시켰으며, 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 합성량은 α-MSH 단독 처리군 대비 백분율(%)로 표기하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 본 발명의 메틸 갈레이트 산화 반응물은 α-MSH에 의해 증가된 멜라닌의 합성을 농도 의존적으로 억제하였고, 메틸 갈레이트에 비해 메틸 갈레이트 산화 반응물의 멜라닌 합성 억제 활성이 현저하였다.
실시예 3. 메틸 갈레이트 산화 반응물로부터 분리된 화합물 MGP-1[( S )-HHDP dimethyl ester]의 미백 효과
1) 티로시나아제 저해 활성 측정
상기 실시예 2에 개시된 방법과 동일한 방법으로 실험을 진행하되, 실험의 시료로 메틸 갈레이트 산화 반응물로부터 분리된 화합물인 MGP-1을 사용하여 티로시나아제 저해 활성을 확인하였다. 양성대조군으로는 알부틴(Arbutin)을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 MGP-1의 티로시나아제 저해 활성은 메틸 갈레이트에 비해 현저하였고, 양성대조군인 알부틴에 비해서도 효과가 우수하였다.
2) 멜라닌 합성 억제 활성 측정
상기 실시예 2에 개시된 방법과 동일한 방법으로 실험을 진행하되, 실험의 시료로 메틸 갈레이트 산화 반응물로부터 분리된 화합물인 MGP-1을 사용하여 멜라닌 합성 억제 활성을 확인하였다. 양성대조군으로는 알부틴(Arbutin)을 사용하였다.
그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 MGP-1의 멜라닌 합성 억제 활성은 메틸 갈레이트에 비해 현저하였고, 양성대조군인 알부틴에 비해서도 효과가 우수하였다.
3) 미백 관련 단백질 발현량 측정
미백 관련 인자인 MITF(microphthalmia transcription factor), TRP-1(dihydroxy indole carboxylic acid oxidase), TRP-2(DOPA Chrome tautomerase) 및 티로시나아제 단백질 발현 정도를 보기 위해, B16F10 세포를 2×104 cells/mL로 희석한 후, 100mm 배양 접시(culture dish)에 분주하고, 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 그 후, 배지를 제거하고, MGP-1 또는 양성대조군을 1시간 동안 전처리한 다음 α-MSH(10nM/mL)를 처리하였고, 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거한 다음 PBS로 2번 세척하였고, 용해 버퍼(Lysis buffer) 100㎕를 첨가하여 용해한 다음 4℃ 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 상층액의 단백질 함량은 브래드포드 분석법(Bradford assay)으로 정량하였고, 실험 시료별 동량의 단백질을 10%의 SDS-폴리아크릴아마이드(polyacryamide)에 로딩한 후, 전기 영동하여 단백질을 크기별로 분리하였다. 분리된 단백질은 전달 장치를 이용하여 PVDF 멤브레인(membrane)으로 옮긴 다음 실온에서 1시간 동안 블로킹 버퍼[blocking buffer, 5%(w/v) skim milk]에서 반응시켰다. 반응 후, TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척한 다음, MITF(Santacruz, 1:1000), TRP-1(Santacruz, 1:1000), TRP-2(Santacruz, 1:1000), 티로시나아제(Santacruz, 1:1000), β-액틴(Santacruz, 1:1000) 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 후, 다시 TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척하고, 마우스 항-토끼 IgG HRP 또는 보바인 항-염소(bovine anti-goat) IgG HRP의 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST를 이용하여 10분 간격으로 총 3회 세척한 다음 암실에서 ECL(Amersham Pharmacia, England) 용액으로 반응시키고, LAS4000 화학발광 검출기(LAS4000 chemiluminescence detection system, Fuji, Tokyo, Japan)를 이용하여 밴드를 확인한 후, 밀도(density)를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 α-MSH 처리에 의해 증가된 티로시나아제, MITF, TRP-1 및 TRP-2 단백질 발현이 MGP-1 처리에 의해 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 세포 독성 분석
MTT 분석을 통해 메틸 갈레이트 산화 반응물 및 MGP-1의 세포 독성을 확인하였다. MTT 분석은 탈수소 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움(tetrazolium)을 청자색의 비수용성 MTT 포르마잔[formazan, (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide]으로 환원시키는 미트콘드리아의 능력을 이용한 검사법으로, 540nm에서 ELISA 플레이트 리더기(Tecan Austria GmBH, Grodig, Austria)를 이용하여 MTT 포르마잔의 농도를 측정하였다.
마우스 유래의 멜라닌 세포(B16F10)를 세포배양용 96-웰 플레이트에 5×104 세포/웰로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 시료를 농도별로 조제하여 0.02mL 첨가하여 1시간 동안 전처리한 후, α-MSH를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02mL를 첨가하여 4시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 각 웰당 DMSO 0.15mL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA 리더기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포독성은 α-MSH 단독 처리군의 생존율을 100%로 하여 본 발명의 메틸 갈레이트 산화 반응물 및 이로부터 분리된 화합물 MGP-1의 상대적인 세포 생존율을 계산하였다.
그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 본 발명의 메틸 갈레이트 산화 반응물(Oxidation reactant) 및 이로부터 분리된 화합물 MGP-1은 멜라닌 세포에서 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
실시예 5. MGP-1 함량을 증진시키는 메틸 갈레이트 산화 반응물 제조방법의 최적 조건 확립
상기 실시예를 통해 본 발명의 제조방법으로 제조된 메틸 갈레이트 산화 반응물에서 분리된 MGP-1은 메틸 갈레이트 대비 증가된 미백효과를 가지므로, MGP-1 함량을 극대화 시키는 제조방법을 확립하고자 하였다.
최적 조건의 확인을 위해, 산화 반응시간, 효소(배 유래 산화효소원) 농도, 기질(메틸 갈레이트) 농도 및 반응 온도 조절에 따른 MGP-1의 함량을 확인하였다.
제조예 1의 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법과 동일하되, 산화 반응시간을 20분~180분 까지 조절한 결과, 도 8A에 개시된 바와 같이 반응시간이 증가함에 따라 MGP-1 함량이 증가하다가 120분 이후 함량의 변화가 거의 없었다. 따라서 최적의 반응시간은 120분으로 설정하였다.
다음으로 기질로 사용된 메틸 갈레이트 함량에 따른 MGP-1 함량 변화를 확인하였다. 제조예 1의 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법과 동일하되, 메틸 갈레이트의 농도를 1.25, 5, 10, 20, 40, 80 및 160mg/mL로 제조한 후, 산화반응을 수행하였다. 그 결과, 도 8B에 개시된 바와 같이 20mg/mL 농도의 메틸 갈레이트를 이용한 산화 반응물에서 가장 많은 MGP-1이 생성되는 것을 확인하였다. 따라서 최적 기질 농도는 20mg/mL로 설정하였다.
다음으로 효소원의 농도에 따른 MGP-1 생성량을 확인하였다. 제조예 1의 메틸 갈레이트 산화 반응물의 제조방법과 동일하되, 상기 최적 조건으로 확인된 120분 동안 반응시키고, 메틸 갈레이트 농도는 20mg/mL로 고정하였으며, 배 유래 산화효소원 제조과정 중 배 과육의 양을 조절하여 효소원의 농도를 변화시켰다. 배 과육은 물 100mL에 대하여 각각 12.5, 25, 50, 100, 200 및 400g을 첨가하여 제조하였으며, 각 효소원의 폴리페놀 산화효소의 활성은 0.65, 0.68, 0.74, 0.73, 0.72 및 0.73으로 확인하였다. 효소원 농도에 따른 MGP-1 생성량을 비교한 결과, 도 8C에 개시된 바와 같이 효소원의 농도가 증가함에 따라 MGP-1의 생성량이 증가하였고, 100g/100mL 이상의 농도를 첨가하여도 MGP-1의 생성량에는 변화가 거의 없었다. 따라서 최적 효소원 농도는 100g/100mL 로 설정하였다.
산화 반응 온도에 따른 MGP-1 생성량을 확인하였다. 제조예 1의 메틸 갈레이트 산화 반응물 제조방법과 동일하게 제조하되, 상기 최적 조건으로 확인된 반응시간, 기질농도 및 효소원 농도를 사용하였다. 산화 반응 온도는 10, 20, 30, 50, 70 및 90℃로 설정하였으며, 반응 온도에 따른 MGP-1 생성량을 확인한 결과, 도 8D에 개시된 바와 같이 30℃에서 반응한 경우 MGP-1 생성량이 가장 많았다.
상기 결과를 종합하였을 때, 최적 산화 조건은 하기 표 2에 개시하였다.
조건 결과
최적 산화 반응시간 120분
최적 기질 농도 20mg/mL(에탄올 기준)
최적 효소 농도 100g/100mL(물 기준)
온도 30℃

Claims (12)

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  5. HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물로서,
    상기 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물은
    1) 200g의 배 과육과 100~400mL의 물을 혼합한 후, 분쇄한 다음 여과한 여액인 배 유래 산화효소원을 획득하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 획득한 배 유래 산화효소원과, 10mL의 에탄올에 100~400mg의 메틸 갈레이트가 용해된 용해물을 혼합한 후, 20~40℃에서 110~140분 동안 교반하며 산화 반응시키는 단계;를 포함하여 제조된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  6. HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
    상기 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물은
    1) 200g의 배 과육과 100~400mL의 물을 혼합한 후, 분쇄한 다음 여과한 여액인 배 유래 산화효소원을 획득하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 획득한 배 유래 산화효소원과, 10mL의 에탄올에 100~400mg의 메틸 갈레이트가 용해된 용해물을 혼합한 후, 20~40℃에서 110~140분 동안 교반하며 산화 반응시키는 단계;를 포함하여 제조된 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다색소침착, 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 또는 임신성 갈색반(gravidic chloasma)인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 HHDP 디메틸 에스테르를 포함하는 메틸 갈레이트 산화 반응물은
    1) 200g의 배 과육과 100~400mL의 물을 혼합한 후, 분쇄한 다음 여과한 여액인 배 유래 산화효소원을 획득하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 획득한 배 유래 산화효소원과, 10mL의 에탄올에 100~400mg의 메틸 갈레이트가 용해된 용해물을 혼합한 후, 20~40℃에서 110~140분 동안 교반하며 산화 반응시키는 단계;를 포함하여 제조된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  10. 삭제
  11. HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. HHDP 디메틸 에스테르 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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