JP2015013828A - コラーゲン産生促進用、エラスチン産生促進用および/またはケラチノサイト遊走促進用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
また、本発明の組成物が皮膚外用組成物の形態にある場合は、投与量は、成人1日あたりのセサミノール量として1〜1000μg、好ましくは10〜500μgの範囲内である。なお、本発明の組成物の投与回数も特に限定されず、1日に1回または複数回投与することができる。
また、創傷治癒のための皮膚外用組成物の形態としては、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、外用スプレー剤、貼付剤、テープ剤、パップ剤、外用散剤などが挙げられる。
なお、これらの形態の組成物の製造自体は、当該技術において公知の方法により行うことができる。
本実施例では、特開2008−167712号公報に記載の方法に準じて、Paenibacillus sp. KB0549株(寄託番号:FERM P-21057)を、ゴマ脱脂粕を含む培地中で培養することにより、ゴマ脱脂粕中に含まれるセサミノール配糖体から得られたセサミノールを用いた。具体的には、以下のようにして、セサミノールを調製した。
HPLC:HITACHI LaChrom
カラム:Wakosil-II 5C18HG(φ4.6*250 mm、和光純薬工業株式会社)
展開溶媒:A;10%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、B;80%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、Bを10%〜100%の直線勾配(40分間)で展開。
流速:0.8 ml/min
分析波長:280 nm
(1)細胞培養
ヒト正常皮膚由来角化細胞株HaCaTを、あらかじめ底面にしるしをつけた直径35 mmのプラスチックディッシュに5.0×105 cells/dishの濃度で播種し、コンフルエントになるまで37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。なお、培養培地として、10%牛胎児血清(FBS:株式会社ニチレイバイオサイエンス)、ペニシリン(50 units/ml、明治製菓株式会社)およびストレプトマイシン(50 mg/ml、明治製菓株式会社)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:日水製薬株式会社)を用いた。また、培地交換は2日おきにおこなった。
細胞をコンフルエントになるまで培養した後、ディッシュ中の細胞をチップ先端でかき取って、直線状の創傷パターンを形成した。その直後、倒立顕微鏡(OLYMPUS IX-70:オリンパス株式会社)を用いて、創傷パターンの観察および写真撮影をした。そして、セサミノール溶液を、セサミノールの終濃度が15または30μg/mlとなるよう添加した培養培地を加えて、37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間インキュベートした。OLYMPUS IX-70を用いて、創傷パターンの観察および写真撮影をした。なお、対照として、セサミノール溶液を含まない培地を用いて、同様にスクラッチ法を行った。
撮影した写真から、各検体における創傷パターンの幅を測定した。なお、各検体の写真を図1に示す。また、測定結果に基づいて、セサミノールによる創傷部の修復率を算出した。各検体の修復率は、コントロールを100として、次のとおりである。
・コントロール:100.0±34.5
・セサミノール15μg/ml添加群:121.7±25.6
・セサミノール30μg/ml添加群:139.1±20.6
(1)細胞培養
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞株CCD-10595K(DSファーマバイオメディカル株式会社より購入)を、直径35 mmのプラスチックディッシュに3.0×104 cells/mlの濃度で播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。なお、培養培地として、実施例1と同じ培地を用いた。1〜2日後、セサミノール溶液を、セサミノールの終濃度が15または30μg/mlとなるよう添加した培養培地に交換して、37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間インキュベートした。なお、対照として、セサミノール溶液を含まない培地を用いて、同様にインキュベートした。
インキュベート後、細胞をPBSで3回洗浄した。そして、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定して、4℃にて一晩保存した。固定した細胞を、PBSで希釈した0.1% Triton(登録商標)-X100で5分間処理し、PBSで5分間洗浄した。処理した細胞を3% H2O2でブロッキング処理し、PBSで5分間洗浄した。さらに、10% 正常ヤギ血清でブロッキング処理し、PBSで5分間洗浄した。そして、カバーガラス上の細胞に、PBSで200倍に希釈したウサギ抗I型コラーゲン抗体(LSL社)を添加して1時間反応させた後、細胞をPBSで5分間洗浄した。さらに、PBSで400倍に希釈したビオチンコンジュゲート抗ウサギIgG抗体(Dako A/S社)を細胞に添加して30分間反応させた後、細胞をPBSで5分間洗浄した。そして、PBSで400倍に希釈したストレプトアビジンコンジュゲートHRP(Dako A/S社)を細胞に添加して30分間反応させた後、細胞をPBSで5分間洗浄した。細胞を、DAB溶液(3,3'-ジアミノベンジジンテトラハイドロクロリド(30 mg)、蒸留水(75 ml)、0.2 M PBS(75 ml)、30% H2O2(100μl)および8%塩化ニッケル(1ml))を添加して5分間反応させた。その後、PBSで5分間洗浄し、カバーガラスに水溶性封入剤(Aquatex、MERCK社)を少量塗布して、スライドガラスに貼り付けた。得られたプレパラートをOLYMPUS IX-70を用いて観察し、染色した細胞の画像を取得した。画像を図2に示す。
(1)細胞培養
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞株CCD-10595K(DSファーマバイオメディカル株式会社より購入)を、直径35 mmのプラスチックディッシュに播種し、コンフルエントになるまで37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。その後、培地を、セサミノール溶液を、セサミノールの終濃度が15または30μg/mlとなるよう添加した培養培地に交換して、37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間インキュベートした。なお、培養培地として、実施例1と同じ培地を用いた。細胞がコンフルエントになるまで、2日おきに培地を交換した。また、対照として、セサミノール溶液を含まない培地を用いて、同様にインキュベートした。
インキュベート後、細胞をPBSで2回洗浄し、セルスクレイパーを用いて1.5 mlチューブ中に回収した。そして、該チューブを遠心分離(15000 rpm、4℃、15秒間)に付して、上清を除き、沈殿(細胞)を回収した。回収した細胞に、可溶化バッファー(1%NP-40および1%Triton(登録商標)-X100、1mM PMSF、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlアプロチニン)を適量添加して、ボルテックスミキサーにより混合した。そして、チューブを30分間氷冷した後、超音波処理(3分間の処理および20秒間のインターバルを4回繰り返す)で細胞を破砕した。チューブを遠心分離(15000 rpm、4℃、20分間)に付して、可溶性の細胞溶解物を含む上清を回収した。回収した上清の一部について、Serva Blue G(Serva Electrophoresis GmbH社)を用いて595 nmの吸収に基づいてタンパク質の定量を行い、電気泳動に付すサンプル量を算出した。
(1次抗体)
・ウサギ抗COL1A抗体(C-18)(sc-8784-R:Santa Cruz社)
・マウス抗エラスチン抗体(Acris Antibodies GmbH社)
・マウス抗ヒト平滑筋アクチン抗体(1A4)(Dako A/S社)
(2次抗体)
・ビオチンコンジュゲート抗ウサギIgG抗体(Dako A/S社)
・ビオチンコンジュゲート抗マウスIgG抗体(Dako A/S社)
Claims (4)
- セサミノールを有効成分として含む、コラーゲン産生促進用、エラスチン産生促進用および/またはケラチノサイト遊走促進用組成物。
- 美容または創傷治癒のための皮膚外用組成物である請求項1に記載の組成物。
- 化粧品、医薬部外品または医薬品の形態にある請求項1または2に記載の組成物。
- 化粧品が、化粧水、クリーム、乳液、ローション、ファンデーション、エッセンス、パック、マスクまたはクレンジング料である請求項3に記載の組成物。
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