KR101578403B1

KR101578403B1 - 생물전환기법으로 추출한 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 함유하는 피부보습용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101578403B1
Application number: KR1020150071208A
Authority: KR
Inventors: 김동욱; 이대우; 최성규; 목소현; 임채미
Original assignee: 주식회사 더마랩; 한국콜마주식회사
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-05-21
Publication date: 2015-12-21

Abstract

본 발명은 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 함유하는 피부보습 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 효소처리 혼합추출물은 Tgase-1의 발현, HAS-3의 발현, 콜라겐 및 TIMP-1의 발현, 트로포엘라스틴의 발현 및 MMP-1의 발현 억제 효과가 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 피부보습 및 주름개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생물전환기법으로 추출한 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 함유하는 피부보습용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing sea horse, sea cucumber and abalone extracts by Bioconversion for skin moisturizing}

본 발명은 효소처리 해마(Sea horse), 해삼(Sea cucumber) 및 전복(Abalone) 혼합 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 함유하여 우수한 피부보습 및 주름개선 활성을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽 기능은 화학 물질, 대기오염 물질, 건조한 환경, 자외선 등과 같은 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층(Stratum corneum, horney layer)이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다. 이와 같은 피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 이에 따라 피부미용면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있는 것이 바로 표피이다.

표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질로서 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 이와 같은 피부의 장벽기능은 각질의 세포분열과 분화를 조절하여 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능이라고 할 수 있다.

피부지질 중에서도 피부장벽기능을 담당하는 주된 지질은 표피의 각화세포(keratinocytes)가 분화되면서 생성되는 지질로서, 이 지질은 분화한 각질세포(corneocytes) 사이의 공간을 채우고 있어서 세포간의 결합력을 부여하는 역할도 하고 있는데, 이러한 지질은 주로 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리지방산으로 구성되어 있고 이들은 각각 지질층 지질 전체의 약 40~65%, 10% 및 25%를 차지한다. 또한 소량의 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑고신(sphingosine)이 함께 존재하는 조성을 가진다.

세라마이드는 스핑고신에 지방산이 연결되어 있는 구조를 가지고 있는 스핑고지질의 일종이다. 세라마이드는 피부각질층을 구성하는 각질세포간지질 중 약 40% 이상을 차지하며, 수분증발을 억제하는 방어벽 역할과 각질층의 정연한 구조를 유지하게 하는 기능을 가지고 있다. 피부 각질층은 각화된 세포가 벽돌모양의 다층구조로 구성되어 있으며 이러한 각화세포는 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리 지방산에 의해 견고히 결합되어 있어 피부 장벽기능 및 피부보습에 도움이 된다.

최근 노화의 원인으로 밝혀진 활성산소종은 세포막 지방질을 과산화시키고 세포막투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시켜 노화현상을 촉진한다. 그리고 사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타나게 된다. 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다. 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 MAP 키나제 경로(stress-activated mitogen-activated protein(MAP) kinase pathway)가 관여 한다고 보고되어 있으며, MAP 키나제 경로(MAP kinase pathway)에서 가장 많은 영향을 받는 AP-1(activator protein-1) 인자는 세포의 성장과 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력하게 조절한다. MMPs는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비되고, 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 α2-acroglobulin이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며, 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다.

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하고자 천연소재로부터 세라마이드 생합성촉진 및 피부장벽강화 효능을 평가 확인하고 이에 따라 피부 안전성이 확보된 새로운 천연 화장료 조성물을 개발하고자 하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2008-0111813호 (208.12.24) 대한민국 공개특허 제10-2013-0142379호 (2013.12.30) 대한민국 공개특허 제10-2009-0043656호 (2009.05.07)

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 함유하여 피부보습 및 주름개선 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매로 추출 후, β-글루코시다아제 효소처리하여 제조되는 것이다.

바람직하게는 상기 혼합추출물의 제조에 있어서, 추출용매는 에탄올이며, 더욱 바람직하게는 30% 에탄올이다. 그리고 상기 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 제조에 있어서, 상기 해마, 해삼 및 전복은 그 건조중량 기준으로 각각 1~10 : 1~10 : 1~10의 비로 혼합하여 추출되는 것이며, 더욱 바람직하게는 동일 중량비로 혼합되어 추출되는 것이다.

상기 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 포함되는 것이 바람직하다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, A)건조 후 분쇄된 해마, 해삼 및 전복을 각각 1~10:1~10:1~10의 비율로 혼합하는 단계; B)물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매로 추출하는 단계; C)상기 용매추출물에 β-글루코시다아제 효소를 가하여 효소반응시키는 단계; 및 D)상기 효소반응 완료 후 여과하는 단계를 포함하는 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 B)단계는 30% 에탄올을 추출용매로 하여 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출하는 것으로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은 인간 피부에서 피부장벽 강화, 피부보습 및 주름개선 효과(세포내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과)활성이 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 피부보습 및 주름개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 Tgase-1 mRNA 유전자 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 HAS-3 mRNA 유전자 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 Collagen mRNA 유전자 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 TIMP-1 mRNA 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 Tropoelastin mRNA 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 MMP-1 mRNA 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부보습 및 주름개선용 화장료에 관한 것이다.

본 발명 화장료 조성물에 함유되는 추출물 원료인 해마(Sea horse)는 몸길이 6~10.5cm이고 몸 빛은 갈색이다. 전 세계에 54종이 있다. 몸이 골판으로 덮이고, 머리는 말 머리 비슷하다. 입은 관 모양으로 작은 동물을 빨아들여 먹는다. 꼬리는 길고 유연하여 다른 물체를 감을 수 있다. 어린 해마는 흔히 서로 꼬리를 묶어 작은 무리를 짓는다. 큰 부레가 있어서 일정한 수심에 머무를 수 있으며, 등지느러미와 가슴지느러미를 이용하여 느리게 헤엄친다. 가슴지느러미는 머리의 양쪽에 붙어 있어서 한 쌍의 귀처럼 보인다. 수컷에는 육아낭이 있어서 암컷이 낳은 알을 넣어 부화시킨다. 한국 연해와 일본 각지에 분포하는데, 한방에서는 소화제 원료로도 사용한다.

해삼(Sea Cucumber)는 극피동물 해삼강에 속하는 해삼류의 총칭이다. 약효가 인삼과 같다고 하여 이름 지어졌다. 몸은 앞뒤로 긴 원통 모양이고, 등에 혹 모양의 돌기가 여러 개 있다. 대부분 암수의 구별이 있으나, 겉모습으로는 구별하기 힘들다. 수온 17 이하에서 식욕이 왕성하고 운동이 활발하며, 17 이상이 되면 먹는 것을 중지하고, 25 이상이 되면 여름 잠을 잔다. 효능으로는 비만 예방, 치아 및 골격 형성이 알려져 있다.

전복(Abalone)은 복족류에 속하며, 한자어로 복(鰒) 또는 포(鮑)라고도 한다. 우리 나라의 전 연안에 분포되어 있다. 이 종의 북방형에 대한 수산상의 명칭으로서 참전복이 있는데, 이것은 겨울의 저층수온이 12 되는 등온선인 한국해협과 거문도 북쪽을 동서로 달리는 경계수역을 중심으로 한 북쪽 연안의 남해안과 동해안 및 서해안에 분포한다. 칼로리가 낮고 지방 함량이 적어 다이어트에 좋으며 각종 무기질이 풍부해 부족한 영양을 보충하는데 효과적이다.

본 발명에서 사용되는 해마, 해삼 및 전복은 오프라인 또는 인터넷 마켓에서 구입할 수 있다.

본 발명의 추출물의 제조에 있어서 해마, 해삼 및 전복을 정제수로 깨끗이 세척하여 사용하며, 추출 방법에 따라 건조시켜 세절하거나 가루로 만들어 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를 들어, 물, 에탄올 등 2개의 용매혼합 또는 2개 이상의 용매혼합)중에서 선택된 하나 이상의 용매가 사용될 수 있다.

본 발명에서는 상기 용매추출 후 효소처리 공정을 추가하여 유효성분을 더욱 효율적으로 추출한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은 다음과 같이 제조된다. 먼저, 해마, 해삼, 전복을 건조 후 세절하고, 그 건조 중량의 1~80배 부피량의 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 부틸렌글라이콜 및 프로필렌글라이콜로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 추출용매로 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출한다. 이 후 상기 용매추출물에 β-글루코시다아제 효소를 넣어 50~55℃에서 100rpm 정도로 교반하면서 4~5시간 동안 반응시킨다. 90℃로 5분 정도 가온하여 효소반응을 정지시킨 후, 여과하고 감압농축기로 농축하여 혼합추출물을 제조한다.

본 발명의 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은 각각의 추출물을 제조한 후 혼합하거나, 원료를 혼합한 후 추출하여 제조된다. 본 발명의 추출물은 추출 용매 및 효소처리로 추출한 추출액을 감압 농축한 농축액, 농축액을 동결 건조한 분말 또는 농축액을 분무 건조하여 건조한 분말일 수 있다.

상기 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물의 제조에 있어서, 해마, 해삼 및 전복을 각각 1:1:1로 혼합하여 추출하는 경우에 가장 우수한 피부보습 및 주름개선 활성을 나타내었다.

본 발명의 화장료 조성물에서 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.001~10 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.01∼5 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.

본 발명의 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은 그 상승작용에 의하여 각각의 추출물에 비하여 우수한 인간 피부에서 피부장벽 강화 효과(시험예 2), 피부보습 효과(시험예 3), 피부 주름 개선효과(시험예 4)를 나타내었다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물 이외에 피부보습 및 주름개선 효과를 나타내는 다른 유효 성분을 1가지 이상 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[ 실시예 ]

제조예 1: 효소처리 해마추출물의 제조

건조 후 분쇄된 해마(Hippocampus coronatus) 100.0g에 10배 중량의 추출용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하였으며 함께 95℃에서 1시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 β-글루코시다아제 효소 10g을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 효소처리한 추출물을 얻었다.

제조예 2: 효소처리 해삼추출물의 제조

건조 후 분쇄된 해삼 100.0g에 추출용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하였으며 함께 95℃에서 1시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 β-글루코시다아제 효소 10g을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 효소처리한 추출물을 얻었다.

제조예 3: 효소처리 전복추출물의 제조

건조 후 분쇄된 전복 100.0g에 추출용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하였으며 함께 95℃에서 1시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 β-글루코시다아제 효소 10g을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 효소처리한 추출물을 얻었다.

비교예 1: 효소 무처리 혼합추출물의 제조

하기 표 1의 중량비로 각 성분을 혼합하고 제조예 1의 방법과 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다.

실시예 1 내지 8: 효소처리 혼합추출물의 제조

중량비	해마	해삼	전복
실시예 1	1	1	-
실시예 2	1	-	1
실시예 3	-	1	1
실시예 4	1	1	1
실시예 5	8	1	1
실시예 6	1	8	1
실시예 7	1	1	8
비교예 1	1	1	1

효능을 확인 하고자 각각의 추출물은 농축 후 동결 건조하여 샘플을 준비하였다.

시험예 1: 세포 생존율 측정 시험

세포 배양

트랜스글루타미네이즈-1(transglutaminase-1, Tgase-1)은 각질형성세포가 각질 생성 또는 각질 분화시에 증가하는 대표적인 각질분화인자이다. 각질형성세포의 Tgase-1 발현량이 증가하면, 각질형성촉진에 따른 피부장벽이 강화되는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 효소처리 해양심층수, 다시마, 파래, 스피루리나, 미역 및 우뭇가사리 혼합추출물의 효능을 확인하기 위해 Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과는 각질형성세포 HaCaT Cell을 Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과는 CCD-986Sk 세포를 사용하였다. 또한 세포내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과도 HaCaT와 CCD-986Sk 세포를 사용하였다.

세포 생존율 측정 실험( MTT assay)

MTT assay법은 MTT [3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 유전자 발현을 확인 하기 위해 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO_2,37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3간 동안 5% CO₂및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

구분	세포 생존율(%)
구분	0.1 %	0.5 %	1 %	5.0 %
실시예 1	101	101	100	101
실시예 2	100	101	100	100
실시예 3	101	100	101	100
실시예 4	101	100	100	100
실시예 5	101	101	101	100
실시예 6	100	100	101	101
실시예 7	101	100	101	100
비교예 1	100	101	100	100
대조군 Adenosine	100	100	101	101

구분	세포 생존율(%)
구분	0.001 %	0.005 %	0.01 %	0.05 %
대조군 Hyaluronic Acid	100	100	101	101

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 실시예 1 내지 7, 비교예 1 모두 세포독성을 나타내지 않았다.

시험예 2: 피부장벽 강화 시험

Transglutaminase -1의 유전자 발현 효과

실시예 1 내지 7 및 비교예 1의 혼합추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 3에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
Tgase-1	Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT
Tgase-1	Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT

그 결과는 도 1에 나타내었다. PT-PCR 수행 후 관찰결과, 효소처리를 하지 않은 비교예 1보다 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물 실시예 4가 Transglutaminase-1의 유전자 발현이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

시험예 3: 피부보습 효과

Hyaluronan Synthase -3의 유전자 발현 효과

실시예 1 내지 7, 비교예 1의 혼합추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-3의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 4에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
HAS-3	Forward : ACTGCCTTCAAGGCCCTTGG
HAS-3	Reverse : AATGTTCCAGATGCGGCCAC

그 결과는 도 2에 나타내었다. PT-PCR 수행 후 관찰결과, 효소처리를 하지 않은 비교예 1 보다 효소처리 해마 및 전복 혼합추출물 실시예 4가 Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4: 주름개선 효과

세포내 Collagenase , Timp -1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP -1의 유전자 발현 억제 효과

HaCaT와 CCD-986Sk 세포는 세포의 수를 5×10⁵cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% CO₂및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음, 추출물을 세포 생존률 100% 이상으로 나타난 농도로 첨가하였다.

실시예 1 내지 7의 혼합추출물, 비교예 1을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 COL1A1, TIMP-1 및 Tropoelastin의 발현과 MMP-1의 발현 억제를 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 5에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 5분 변성후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
COL1A1	Forward : AGCCAGCAGATCGAGAACAT
COL1A1	Reverse : TCTTGTCCTTGGGGTTCTTG
TIMP-1	Forward : TGCTGGGTGGTAACTCTTTATTTCA
TIMP-1	Reverse : ATCCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAG
Tropoelastin	Forward : AAAGCAGCAGCAAAGTTCGG
Tropoelastin	Reverse : ACCTGGGACAACTGGAATCC
MMP-1	Forward : AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT
MMP-1	Reverse : CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA

그 결과는 각각 도 3 내지 6에 나타내었다. PT-PCR 수행 후 관찰결과, 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물인 실시예 4가 비교예 1 혼합추출물 보다 collagen 및 TIMP-1의 발현이 증가하였고, MMP-1의 발현은 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 대조군인 아데노신(Adenosine)과 비교했을 때 우수한 결과를 확인할 수 있었다. 또한 트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 피부 탄력을 나타내는 탄력 섬유 중심의 엘라스틴을 형성하고 있는 인자로 추출물은 5%에서 대조군 Adenosine 0.1%보다 우수한 결과를 확인할 수 있었다.

제형 실시예 1: 스킨로션의 제조

하기 표 6의 조성에 따라, 하기의 방법으로 혼합추출물을 함유한 스킨로션을 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	효소처리 혼합추출물(실시예 4)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

상기 표 6에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25에서 3일간 숙성시켜 표제의 스킨로션을 제조하였다.

제형 실시예 2: 영양로션의 제조

하기 표 7의 조성에 따라, 하기의 방법으로 혼합추출물을 함유한 하이드로좀 영양로션을 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	효소처리 혼합추출물(실시예 4)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표 7에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반하면서, 80~85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80~85사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35에서 1번 물질을 투입하여 25까지 냉각한 뒤 25에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

지금까지 본 발명에 대해서 상세히 설명하였으나, 그 과정에서 언급한 실시예는 예시적인 것일 뿐이며, 한정적인 것이 아님을 분명히 하고, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 기술적 사상이나 분야를 벗어나지 않는 범위내에서, 균등하게 대처될 수 있는 정도의 구성요소 변경은 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

Claims

β-글루코시다아제 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물을 함유하는 피부보습용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 β-글루코시다아제 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은 해마, 해삼 및 전복을 건조 중량 기준으로 각각 1~10:1~10:1~10의 비로 혼합하여 추출되는 것임을 특징으로 하는 피부보습용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 β-글루코시다아제 효소처리 해마, 해삼 및 전복 혼합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 피부보습용 화장료 조성물.
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