KR101534557B1

KR101534557B1 - 마키아신을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR101534557B1
Application number: KR1020140044815A
Authority: KR
Inventors: 박귀교; 김보윤; 박병준; 김진준
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2014-04-15
Publication date: 2015-07-09
Also published as: WO2015160030A1

Abstract

본 발명은 마키아신(Maackiasin)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 마키아신이 멜라닌 생성과 관련된 효소들의 발현을 억제하는 효과를 이용한 마키아신을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 마키아신은 알부틴(arbutin)과 비교해 봤을 때, 훨씬 적은 농도에서도 멜라닌 합성 저해효과가 더 큰 바, 피부 미백 효과가 뛰어난 화장료 조성물 및 기능성 화장품을 제조하는데 효과적이다.
[화학식 1]

Description

마키아신을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물{Skin-whitening composition containing Maackiasin thereof as an active ingredient}

본 발명은 마키아신(Maackiasin)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 마키아신이 멜라닌 생성과 관련된 인자들의 발현을 억제하는 효과를 이용한 마키아신을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부, 모발, 눈 등에서 발현하는 색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈에 의해 결정되며 특히 피부에 있어 색깔을 결정하는 가장 중요한 요인은 멜라닌으로, 멜라닌의 양과 성질 그리고 분포의 정도에 따라 피부색이 결정된다.

멜라닌의 주요한 기능은 이러한 유해 라디칼을 제거함으로써, 유해 라디칼에 의한 손상으로부터 피부를 보호하는 것이다. 따라서, 멜라닌이 많다는 것은 물리적, 화학적 독성물질로부터 피부를 보호하기 위한 효과적인 대응체계를 가지고 있다는 것을 의미한다. 이러한 멜라닌의 생성을 촉진하는 요인들로서는 햇빛 (자외선) 뿐만 아니라 에스트로겐, 프로스타글라딘 등과 같은 호르몬이 있다.

멜라닌은 햇빛 (자외선)에 의해 멜라노사이트 (melanocyte)에서 티로신이 티로시나제라는 효소에 의해 도파와 도파크롬으로 변환된 뒤 복잡한 산화와 축합 반응을 거쳐 생성된다. 생성된 멜라닌은 피부 세포에 전달되고 표피 박리와 함께 멜라닌이 상실되어 소멸되는 순환 작용을 한다. 멜라닌 생성 메카니즘의 특징은 티로시나제라는 단 한개의 효소가 관여하는 것이기 때문에 티로시나제 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 막아줌으로서 미백 효과를 기대할 수 있다.

미백 화장품에 있어 멜라닌 생성을 억제하는 방법은 크게 다음과 같이 나눌 수 있다. 첫번째 방법은 멜라닌 생성의 주원인인 자외선을 차단하여 제거하는 것으로써, 이 방법은 화장품 조성물에 광 산란제 또는 광 차단제를 함유시킴으로써 효과적으로 멜라닌 생성을 억제할 수 있다. 두 번째 방법은 글루코사민과 같이 티로시나제가 활성을 나타내기 위해 필요한 코어 탄수화물의 합성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시키는 것이다. 세 번째 방법은 효소산 (코직산) 또는 알부틴과 같이 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나제의 기능을 방해하는 것이다. 네 번째 방법은 하이드로퀴논과 같이 멜라닌을 생성하는 세포인 멜라노사이트에 대하여 특이적인 독성을 가지고 있어 세포 분열을 방해하는 것이다. 다섯 번째 방법은 비타민 C와 같이 티로신이 도파와 도파크롬을 거쳐 복잡한 산화와 축합반응을 거치는 동안에 강한 항산화 효과를 발휘함으로써 미백효과를 기대하는 것이다.

최근들어 가장 이상적으로 여겨지는 미백 화장료는 일차적으로 자외선을 차단해주고, 체내에 생성되는 라디칼을 소거해주면서 자외선 등에 의해 발생할 수 있는 염증 유발 물질 생성을 억제해주며 궁극적으로는 멜라닌 생합성을 억제하는 효과를 갖는 물질들을 복합적으로 사용하는 것으로 알려져 있다.

그렇지만 천연 식물들은 많은 양을 사용하는 경우에는 오히려 피부에 자극을 주어 피부색소 침착을 야기하는 등의 부작용을 야기시킬 수 있으므로 낮은 농도에서도 미백 효과를 극대화 시켜 줄 수 있는 물질 및 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 다릅나무(Maackia amurensis)로부터 추출한 마키아신이 세포독성이 적으면서도 시중에서 미백원료로 많이 쓰이는 알부틴보다도 멜라닌 합성 저해율이 훨씬 높은 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 마키아신을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 피부 미백용 기능성 화장품을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 마키아신을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 피부 미백용 기능성 화장품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 포함되는 마키아신(maackiasin)은 하기 화학식 1과 같은 화학구조를 갖고 있고, 화학구조식은 7H-Pyrano[2,3-f]-1,4-benzodioxin-7-one,2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-(3,5-dihydroxyphenyl)-2,3-dihydro-8-(4-methoxyphenyl)-(9CI) 로 표시할 수 있다.

[화학식 1]

마키아신의 미백 효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노마 세포를 이용하여 마키아신 처리 농도별 멜라닌 합성 저해 효과를 측정하였다. 측정 결과, 농도의존적으로 멜라닌의 합성이 저해되었다. 이때 알부틴(arbutin)을 500㎍/㎖ 처리한 것을 양성대조군으로 사용했다. 마키아신은 10㎍/㎖만 처리하였는데도 알부틴보다 멜라닌 합성비율이 매우 유의적으로 낮게 나왔다(실험예 2, 표 2 및 도 4 참조). 양성대조군으로 사용된 알부틴은 월귤나무열매(bearberry)에서 추출한 글라이코실레이티드 하이드로퀴논으로서 티로시나제(tyrosinase)를 저해하여 멜라닌 색소의 형성을 방해한다. 현재 시중에서 피부 미백용 원료로 많이 쓰이고 있다.

마키아신이 멜라닌 합성에 관여하는 효소들인 Tyrosinase(티로시나아제), TRP(tyrosinase related protein)-1, TRP-2 및 이를 조절하는 전사인자인 MITF(microphthalmia associated transcription factor)의 발현을 억제하는지 여부를 웨스턴블랏팅(western blotting)을 통해 밝혔다. 상기 MITF는 티로시나아제 및 TRPs에 결합하여 이 효소들의 발현을 조절하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 멜라닌 합성을 조절하는 피부 미백 성분을 개발하기 위한 주요 타깃으로서 여겨지고 있다. 웨스턴 블랏팅 결과에서 마키아신을 10㎍/㎖ 처리한 실험군은 알부틴 500㎍/㎖ 처리한 양성 대조군보다 단백질들의 발현이 억제된 것을 확인할 수 있다(실험예 3 및 도 5 참조).

따라서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 마키아신은 멜라닌 합성을 효과적으로 저해함으로써 우수한 미백효과를 나타내므로 피부 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 미백 효과를 위한 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 사용될 수 있다. 예컨대, 각종 스킨, 로션, 크림, 에센스, 영양수, 화장수 및 팩과 같은 화장품류와 비누, 샴푸, 린스, 클렌징, 전신세정제, 세안제, 트리트먼트 및 미용액 등이 있다.

본 발명의 미백용 화장료 조성물은 마키아신 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 이미 공지되어 사용되고 있는 피부 미백 효과가 있는 화합물 또는 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 마키아신은 분리 또는 합성될 수 있고, 다릅나무(Maackia amurensis)로부터 추출된 것일 수 있다. 다릅나무는 한국, 중국, 일본, 만주 등지에 분포하는 낙엽 활엽교목으로 산중턱, 산기슭, 골짜기 등 흙이 깊은 곳에서 잘 자란다. 큰 나무는 지름 1.5m, 높이 15m에 달하며 줄기는 가지를 많이 치고 성장이 빠르다. 잎은 어긋나고 1회 기수 우상복엽이며 작은 잎은 타원형 또는 장난형으로 양면에 털이 없다. 마키아신을 다릅나무로부터 분리하는 방법은 실시예 1에 자세히 기재하였다.

본 발명의 화장료 조성물은 마키아신을 이에 한정하지 않지만, 0.0001 내지 90 중량% 함유할 수 있고, 바람직하게는 0.001 내지 90중량% 함유할 수 있다. 상기 마키아신 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 피부미백 효과가 나타나지 않으며, 90중량%를 초과하게 되면 함유량 증가 대비 효과 증가 정도가 미미하며, 제형상의 안정 및 안정성에 문제가 있을 수 있고, 경제적이지 못하다. 마키아신의 이러한 조성은 적용 대상의 연령, 성별, 체중, 증상, 제품형태, 적용부위 및 기간 등에 따라 조절될 수 있으며, 따라서 본 발명의 상기 범위는 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 미백을 목적으로 하는 기능성 화장품에 광범위하게 사용될 수 있으며, 따라서 본 발명은 상기 화장료 조성물을 포함하는 기능성 화장품을 제공한다.

상기 기능성 화장품은 이에 한정하지 않지만, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤, 립스틱, 파운데이션, 아이쉐도우, 팻취, 마스크시트 및 마사지 크림으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 포함하는 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림, 팩을 제조한 제조예를 본 발명에 기재하였다. 상기 제조예는 본 발명에 따른 기능성 화장품의 일례를 보여주는 것일 뿐, 이에 한정되는 것이 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 마키아신은 알부틴(arbutin)과 비교해 봤을 때, 훨씬 적은 농도에서도 멜라닌 합성 저해효과가 더 큰 바, 피부 미백 효과가 뛰어난 화장료 조성물 및 기능성 화장품을 제조하는데 효과적이다.

도 1은 실시예 1의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1의 ¹³ C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 마키아신의 세포 독성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 마키아신의 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 그래프이다.
도 5는 마키아신의 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, 및 MITF 발현 억제 효과를 나타내는 western blotting 결과 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 다릅나무 메탄올 추출물의 용매분획물로부터 마키아신의 분리 및 구조 동정

다릅나무(Maackia amurensis Rupr. et Max.) 2800 g을 99.5 % 메탄올에 침적시켜 3 일 동안 실온에서 침출하였고, 이 침출물을 여과지로 여과하고, 침출 여과과정을 3 회 더 반복한 후, 이 여과액을 감압농축함으로써 메탄올 추출물을 수득하였다. 다릅나무의 메탄올 추출물에 대한 용매분획은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 다릅나무 메탄올 추출물(99.5% methanol extract)을 증류수에 현탁시켜 분별 깔대기를 이용해 n-hexane(n-Hex), methylene chloride(CH₂Cl₂), ethyl acetate(EtOAc), n-butanol(n-BuOH)을 사용하여 분획한 뒤 여과, 감압 농축하여 각각의 용매별 분획물 n-hexane 1.36 g, CH₂Cl₂ 4.56 g, EtOAc 92.28 g, n-BuOH 37.96 g, H₂O 36.46 g을 얻었다.

에틸아세테이트 분획물(10.0 g)을 가지고 순상 실리카겔과 메틸렌클로라이드와 메탄올을 용매기울기 조건으로 사용해 17개의 분획을 얻었다. 분획-10에 대하여 CH₃CN-Water 용매로 prep-LC를 실시하여 화합물을 분리하였다.

얻어진 화합물은 NMR을 이용해 확인한 결과 순수하게 분리되었음을 확인하였다.

핵자기공명기(Bruker Co. 400 M Hz, NMR)를 이용하여 ¹H, ¹³ C?MR 스펙트럼(도 1 및 도 2 참조)을 얻었으며, 이들 스펙트럼을 종합적으로 분석하여 구조를 결정하였다.

그 결과, 화합물은 하기 화학식 1의 마키아신(maackiasin)으로 동정하였다.

[화학식 1]

화합물 1

성상 : 백색의 무정형 분말(white and amorphous powder)

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) : 8.43 (1H, s, H-2), 7.64 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5), 7.52 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2', H-6'), 7.12 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6), 6.99 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3', H-5'), 6.71 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-2'''), 6.64 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'''), 6.56 (1H, dd, J = 8.1, 1.6 Hz, H-6'''), 6.15 (2H, brs, H-4'', H-6'') 6.13 (1H, d, J = 1.7 Hz, H-2''), 5.10 (2H, dd, J = 11.4, 8.0 Hz, H-α H-ß, 3.78 (3H, s, H-OMe)

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d ₆ ) : 174.7 (C-4), 159.0 (C-4'), 158.0 (C-3'', C-5''), 153.1 (C-2), 147.5 (C-4'''), 145.9 (C-9), 145.7 (C-7), 144.9 (C-3'''), 137.6 (C-8), 130.1 (C-2', C-6'), 126.5 (C-1'), 124.0 (C-3), 123.2 (C-5), 119.5 (C-1'''), 118.3 (C-6), 116.8 (C-6'''), 115.5 (C-5'''), 115.2 (C-2'''), 114.9 (C-3'''), 113.6 (C-3', C-5'), 106.3 (C-6''), 79.6 (C-α), 79.3 (C-ß), 55.1 (C-OMe)

실험예 1 : 세포 독성 시험 ( NRU assay )

상기 실시예의 방법으로 수득한 화합물의 세포독성을 측정하였다. 본 발명의 상기 화합물에 대한 세포독성을 측정하기 위하여 B16F1(mouse melanoma cell)을 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dubeco? Modified Eagle Medium, Hyclone)를 이용한 배지를 이용하여 96-well plate에 200㎕씩 나누어 넣고 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 상기 마키아신을 농도별로 처리하여 같은 배양 조건에서 72시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 5㎎/㎖ Neutral red 시약을 첨가한 배양액을 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 1% CaCl₂ & Formaldehyde를 처리하고 1분간 400-500 rpm으로 흔들어 준 뒤 이를 다시 제거하였다. 그리고 1% Acetic acid & 50% Ethanol을 각 well에 처리하고 10분간 잘 흔들어 준 다음 마이크로 플레이트 계수기(Microplate reader)를 이용하여 570 nm/655 nm의 흡광도 측정으로 결과를 측정하였으며, 그 결과는 표 1과 같다.

마키아신 농도에 따른 세포생존율(%)

시료	실시예1
농도(㎍/㎖)	10	5	1	0.1	0.01
세포생존율(%)	105.2	105.1	95.7	95.6	106.6

그 결과, 상기 표 1 및 도 4에 나타난 바와 같이 마키아신의 세포독성은 나타나지 않았다.

실험예 2 : 멜라닌 생합성 억제 효과 측정

상기 실시예의 방법으로 수득한 화합물의 멜라닌 합성율을 측정하였다.

마우스 유래 B16F1 멜라노마(melanoma) 내 멜라닌(melanin) 생합성을 억제하는 효과를 측정하기 위해 다음과 같이 실험을 진행하였다. B16F1(mouse melanoma cell)을 세포를 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium, Hyclone)에서 배양한 후, 이를 6 well plate에 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양 하였다. 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 α-MSH(Melanocyte stimulating hormone, 멜라닌 세포 자극 호르몬)를 배지에 혼입하여 각 well에 첨가하고 농도별 추출시료도 함께 첨가하였다. 이때 양성대조구는 500㎍/㎖ 농도의 알부틴을 사용하였다. 72시간 배양한 후 각 plate 내의 세포 내 멜라닌 생성량을 측정하기 위해 우선 plate 내 나머지 배양액을 제거하고, 1xPBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척하였다. 티로신(trypsin)을 각 well에 처리하고 5분간 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하여 세포를 떼어낸 후, 각 well에 배양액을 처리하고 2㎖ 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 이를 10,000 rpm에 10분간 원심분리한 후 튜브 안의 배양액을 제거하고 PBS 처리하고, 다시 원심분리와 제거를 통해 세척하였다. 그 후 PBS를 제거하고 70℃의 건조기에서 튜브의 뚜껑을 연 채로 1시간 보관하였다. 건조기에서 꺼낸 튜브에 각각 1N NaOH(10% DMSO)를 처리하고, 다시 70℃ 건조기에서 10분간 튜브의 뚜껑을 닫은 채 반응시켰다. 반응 후 1,000 rpm에 약 10분간 흔들어주고, 96-well plate에 분주한 후, 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 490㎚/655㎚에서 흡광도를 측정하였다.α-MSH를 첨가하지 않은 α-MSH(-) 그룹의 흡광도를 1로 놓고, 다른 그룹은 이에 대한 상대적인 비율로 측정하여 하기 표 2 및 도 4에 기재하였다. 음성대조군(α-MSH(-)로 표시)에는 α-MSH, 마키아신 등을 첨가하지 않았다.

마키아신 농도에 따른 멜라닌 합성 비율

시료	α-MSH(-)	α-MSH(+)	Arbutin	마키아신
농도(㎍/㎖)			500	10	5	2.5
멜라닌 합성 비율	1	1.6	1.01	0.86	1.67	1.72

그 결과, 상기 표 2 및 도 4 나타난 바와 같이 마키아신은 농도의존적으로 멜라닌 합성이 저해되고 있는 것을 확인하여 미백 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 3 : 멜라닌 생성 관련 효소의 생성 억제 효과

B16F1(mouse melanoma cell)을 10% FBS-DMEM에 배양하고 이를 취하여 적정 농도 세포액을 조제하였다. 이를 6-well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다. 24시간 배양 후, 배지 제거 후 배지와 농도별 시료를 혼합한 뒤, 다시 동일 조건에서 72시간 배양시켰다. Blank의 경우, 배지만을 넣었다. 72시간 배양 후, 각 플레이트 내의 세포를 회수하기 위하여 trypsine-EDTA 용액을 넣고 세포를 분리하여 microtube에 획득한 뒤 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 분리된 pellet을 1xPBS(-)로 1회 세척하고 원심분리 한 후, pellet에 PRO-PREP^TM Protein Extract Solution(Intron, Inc.)을 처리하여 -20℃에서 15분 반응시킨다. 원심분리 진행 후, 상등액을 tube로 옮겨 -20℃에 보관하였다. 상기 방법으로 정제한 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용 전기영동을 실행하고 이를 PVDF membrane으로 이전하였다. 5% skim milk가 함유된 tris 완충용액에서 1시간 blocking 과정을 거친 후에 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, B-actin 항체와 각각 반응시켰다. 반응 후, donkey anti-goat lgG-HRP 가 결합된 항체를 가하고, Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 일정 시간 동안 반응 시킨 후 현상하였다. 상기 실험 결과는 하기 도 5에 기재한 바와 같이 마키아신은 10 ㎍/㎖ 농도에서 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, 및 MITF 발현을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 마키아신은 멜라닌 생성 단계 관여 효소들의 발현이 억제되어 나타나는 것임을 알 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 마키아신은 목적에 따라 여러 형태로 제형화가 가능하다. 하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.

제조예 1 : 유연화장수의 제조

소듐히알루로네이트는 프로펠러믹서(3000rpm)로 정제수에 분산하여 1% 용액상태로 준비하였다. 소듐히알루로네이트를 제외한 원료 1내지8은 프로펠러믹서를 사용하여 수상 용해조에 500rpm으로 균일화시키고 75℃에서 가온하여 완전 용해한 후, 실온으로 냉각하였다. 이후, 별도의 용해조에 원료 9내지11을 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하고 교반 혼합하였다. 여기에 마키아신을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 유연화장수를 제조하였다.

유연화장수 제조

	성분	함량(중량%)
1	마키아신	0.001
2	폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.5
3	글리신	3.3
4	디포타슘글리시리제이트	0.1
5	1,3-부틸렌 글리콜	3.0
6	소듐히아루로네이트	0.1
7	에탄올	5.0
8	항산화제	0.1
9	트리에탄올아민	0.1
10	EDTA	0.1
11	방부제	적량
12	정제수	잔량

제조예 2 : 영양화장수의 제조

프로펠러믹서를 이용하여 카보머를 4000rpm으로 분산하여 2% 용액상태로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1내지6을 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7내지14을 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 그 다음 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 마키아신을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 영양화장수를 제조하였다.

영양화장수 제조

	성분	함량(중량%)
1	마키아신	0.001
2	글리세린	7.0
3	소르비탄스테아레이트 슈크로오즈코코에이트	2.0
4	미네랄 오일	4.0
5	트리옥타노인	1.0
6	스테아릭에씨드	1.0
7	글리세릴 스테아레이트	0.5
8	소르비탄모노스테아레이트	1.0
9	디메치콘	0.5
10	항산화제	0.3
11	트리에탄올아민	0.1
12	카보머	0.2
13	EDTA	0.1
14	방부제	적량
15	정제수	잔량

제조예 3 : 에센스의 제조

소듐히알루로네이트, 히드록시에칠셀룰로이즈는 각각 정제수에 프로펠러믹서(2000rpm)로 분산하여 1% solution상태로 준비하였다. 또 카보머는 정제수에 프로펠러믹서(4000rpm)로 분산하여 2% solution상태로 준비하였다. 한편, 수상 용해조에 원료 1내지12를 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였고, 가온된 수상을 다시 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13내지15를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 여기에 마키아신을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 에센스를 제조하였다.

에센스 제조

	성분	함량(중량%)
1	마키아신	0.001
2	글리세린	5.0
3	1,3-부틸렌 글리콜	2.0
4	폴리에칠렌 글리콜	2.0
5	카보머	1.0
6	소듐히아루로네이트	0.1
7	글리신	3.0
8	폴리아크릴아마이드	2.0
9	히드록시에칠셀룰로이즈	0.2
10	에탄올	3.0
11	항산화제	0.3
12	트리에탄올아민	0.1
13	폴리옥시에칠렌경화피마자유	1.0
14	EDTA	0.1
15	방부제	적량
16	정제수	잔량

제조예 4 : 영양크림의 제조

수상용해조에 원료 1내지8을 투입하여 호모믹서(2000 rpm)로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 별도의 유상 용해조에 원료 9내지16을 투입하여 80℃까지 가온 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000 rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 마키아신을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 영양크림을 제조하였다.

영양크림의 제조

	성분	함량(중량%)
1	마키아신	0.001
2	1,3-부틸렌글리콜	3.0
3	글리세린	3.0
4	하이드로제네이티드 레시친	1.0
5	옥틸도데카놀	3.0
6	트리옥타노인	2.0
7	스테아릭에씨드	1.5
8	세토스테아릴알콜	2.0
9	폴리솔베이트60	1.5
10	소르비탄세스퀴올레이트	2.0
11	디메치콘	3.0
12	항산화제	0.3
13	산탄검	0.2
14	트리에탄올아민	0.1
15	EDTA	0.1
16	방부제	적량
17	정제수	잔량

제조예 5 : 팩의 제조

별도의 용해조에 원료1내지8을 완전 용해시켜 교반 혼합하고, 여기에 마키아신을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 팩을 제조하였다.

마스크팩 제조

	성분	함량(중량%)
1	마키아신	0.001
2	글리세린	7.0
3	1,3-부틸렌글리콜	3.0
4	스쿠알렌	3.0
5	디메치콘	3.0
6	소듐히아루로네이트	0.1
7	글리신	2.0
8	폴리아크릴아마이드	5.0
9	항산화제	0.3
10	트리에탄올아민	0.1
11	EDTA	0.1
12	방부제	적량
13	정제수	잔량

본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 마키아신은 알부틴(arbutin)과 비교해 봤을 때, 훨씬 적은 농도에서도 멜라닌 합성 저해효과가 더 큰 바, 피부 미백 효과가 뛰어난 화장료 조성물 및 기능성 화장품을 제조할 수 있어, 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 마키아신(Maackiasin)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
<화학식 1>
제1항에 있어서, 상기 마키아신은 다릅나무(Maackia amurensis)로부터 분리됨을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 마키아신은 화장품 총중량을 기준으로 0.0001 내지 90 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화장료 조성물을 포함하는 피부 미백용 기능성 화장품.
제4항에 있어서, 상기 화장품은 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤, 립스틱, 파운데이션, 아이쉐도우, 팻취, 마스크시트 및 마사지 크림으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 기능성 화장품.