KR20170013602A - 피세아타놀이 유효성분으로 함유된 피부 미백 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피세아타놀을 유효성분으로 함유한 피부 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 피부 미백 화장료 조성물은 다릅나무(Maackia amurensis ) 식물추출물로부터 분리된 피세아타놀 성분이 멜라닌 생합성 억제활성과 멜라닌 생합성에 관여하는 효소인 티로시나아제(Tyrosinase), Trp-1, 및 Trp-2, MITF와 같은 단백질의 발현 억제효과를 보임으로써, 상기 피세아타놀을 유연화장수, 영양화장수, 에센스 또는 영양크림의 제형에 유효성분으로 함유한 피부 미백효능을 가지는 기능성 화장품에 제공할 수 있다.

Description

피세아타놀이 유효성분으로 함유된 피부 미백 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR SKIN WHITENING COMPRISING PICEATANNOL AS AN EFFECTIVE INGREDIENTS}

본 발명은 피세아타놀(Piceatannol)이 유효성분으로 함유된 피부 미백 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 다릅나무(Maackia amurensis ) 식물추출물로부터 분리된 피세아타놀 성분이 멜라닌 생합성 억제활성과 멜라닌 생합성에 관여하는 효소인 티로시나아제(Tyrosinase), Trp-1, 및 Trp-2, MITF와 같은 단백질의 발현 억제효과를 보임으로써, 상기 피세아타놀이 유효성분으로 함유된 피부 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 인간의 피부는 표피(epidermis)와 진피(dermis)로 구성되어 있으며, 표피에는 손톱, 모발이 생성되고 땀샘도 존재한다.

또한, 진피에는 신경망, 혈관, 모발샘과 땀샘이 있다. 이때, 색소 성분인 멜라닌은 인체 표피층의 멜라노사이트(melanocyte)라는 색소세포 내의 멜라노좀(Melanosome)에서 합성된다. 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등 인체 내외의 색소 함유 유무와 같은 여러 요인에 의해 결정되는데 이 중 멜라닌은 자외선 및 스트레스 등으로 인해 피부세포의 일종인 멜라노사이트 내에서 멜라닌이 합성되고 방출되어 피부 표피가 검게 된다.

구체적으로는 멜라노사이트 내에서 멜라닌이 합성되는 과정은 세포 내의 아미노산의 일종인 타이로신(tyrosine)을 기질로 하여 타이로시나제라는 효소가 작용한다. 이때 DOPA(3,4-dihydroxy-phenylalanine)또는 DOPA 퀴논(quinone)으로 산화된 후 비효소적 반응과 자동 산화 과정을 거쳐 단백질 또는 그 구성 아미노산과 중합 반응으로 흑색의 폴리머인 멜라닌으로 합성된다.

따라서 멜라닌 생성의 원인과 기작이 밝혀지면서, 멜라닌 생성 과정에 관여하는 효소인 티로시나제(tyrosinase)의 활성 저해효과를 갖는 물질들을 화장료에 배합하거나, 멜라닌 생성과정 중의 일부 반응을 저해함으로써 멜라닌의 생성을 감소시키는 방법이 일반적으로 사용되고 있다.

이러한 목적으로 사용되고 있는 대표적인 물질로는 하이드로퀴논(Hydroquinone), 아스코르브산(Ascorbic acid), 코직산(Kojic acid), 글루타치온, 알부틴(Arbutin) 성분이 있다.

그러나 코직산의 경우, 우수한 티로시나제 활성 저해 작용을 갖는 반면 화장품에 배합 시 변색 및 경시 변화에 따른 역가 저하 등 안정성에 문제점이 있으며, 피부 자극이 커서 사용상 한계가 있다.

아스코르빈산은 티로시나제 활성 저해 효과가 낮을뿐더러 분자 자체의 안정성이 낮아 멜라닌 생성 억제제로 적합하지 않으며, 히드로퀴논은 피부에 대해 자극이 높아 안전성 문제로 현재 화장품 배합 시에 그 사용성이 제한되고 있다.

따라서 오래전부터 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과 기능을 지닌 기존 원료가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 한방제로 사용되고 있는 생약, 야채, 과일, 꽃 등의 안전성이 뛰어난 식물추출물로부터 비정상적인 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 여러 가지 효과를 가진 추출물을 찾아 화장품 원료로 사용하는 연구가 계속되어 오고 있다.

그의 일례로, 상백피 추출물 또는 감초 추출물 등의 식물추출물이 피부 미백용도에 유용성에 대하여 다수 보고되어 있다[대한민국 공개특호 제2010-56422호, 특허 제530669호, 특허 제638170호 및 특허 제1017922호].

피세아타놀(Piceatannol, 3,4,3',5'-tetrahydroxy-trans-stilbene)은 포도와 와인, 대황 등에서 발견되는 폴리페놀(polyphenol)계열에 속하는 물질로서 화학적 암 예방 물질로 주목받는 레스베라트롤(resveratrol, 3,5,4'-trihydroxytrans-stilbene)의 유도체이다.

종래 피세아타놀의 생리활성에 관한 초기 연구 중, 피세아타놀은 프로테인타이로신 키나제(protein-tyrosine kinase)와 분자핵 인자 카파 B(nuclear factor kappa B, NF-κB)의 활성을 강력하게 억제함으로써, 면역 조절 및 항염증 효능이 있다고 보고된 바 있다[Piceatannol-Induced G1 Arrest of the Cell Cycle is Associated with Inhibition of Prostaglandin E2 Production in Human Gastric Cancer AGS Cells, 41, 907-913].

이러한 효능에 관한 구체적인 기전 연구로서 피세아타놀이 림프구에서 인터페론-알파(interferon-α)에 의해 유도된 신호전달인자(signal transducer)와 전자활성화인자 3(activator of transcription 3, STAT3)로 풀이되는 신호전달인자 및 활성자의 기능 억제가 밝혀졌는데, 이는 피세아타놀이 다양한 세포 내 표적인자의 발현을 조절함으로써 면역 조절 및 항염증 효능을 나타낼 수 있는 대표적인 예에 해당된다고 보고되어 있다[Induction of S Phase Arrest of the Cell Cycle by Piceatannol is Associated with Inhibition of Telomerase Activity in Human Leukemic U937 Cells, 18, 96-102].

이에, 본 발명자들은 다양한 식물소재로부터 티로시나제 활성 저해 작용을 가지는 성분을 탐색하던 중, 다릅나무 식물추출물로부터 피세아타놀을 분리하고 상기 피세아타놀 성분의 피부 미백효능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다릅나무(Maackia amurensis ) 추출물로부터 분리된 피세아타놀 성분이 유효성분으로 함유된 피부 미백 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다릅나무(Maackia amurensis ) 식물추출물로부터 분리된 피세아타놀을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물을 제공한다.

상기 다릅나무 식물추출물은 다릅나무의 줄기, 잎, 열매, 뿌리 및 전초로부터 이루어진 군에서 선택되는 단독 또는 그 혼합성분이 함유될 수 있으며, 이때, 상기 식물추출물로부터 분리된 유효성분인 피세아타놀이 0.00025∼0.001중량%로 함유된 것이 바람직하다.

이에, 본 발명은 피세아타놀을 유효성분으로 함유하되, 유연화장수, 영양화장수, 에센스 및 영양크림으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형에 적용된 피부 미백 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 다릅나무 식물추출물로부터 분리된 피세아타놀 성분이 종래 면역 조절 및 항염증이 아닌, 멜라닌 생합성 억제활성과 멜라닌 생합성에 관여하는 효소인 티로시나아제(Tyrosinase), Trp-1, 및 Trp-2, MITF와 같은 단백질의 발현 억제효과를 확인함으로써, 이를 유효성분으로 함유한 피부 미백 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

이에, 피부 미백기능을 최적화한 기능성 화장품을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 피세아타놀 성분에 의한 멜라닌 생성억제효과에 관한 실험 결과이고,
도 2는 본 발명의 피세아타놀 성분에 의한 MITF, 티로시나아제, Trp-1, Trp-2 단백질 발현 저해효과에 관한 웨스턴 블롯 실험 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 다릅나무(Maackia amurensis ) 식물추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 피세아타놀을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물을 제공한다.

화학식 1

상기 식물추출물의 원재료인 다릅나무(Maackia amurensis)는 한국이 원산지이고 국외로는 일본, 중국 등지에 분포하며 현화식물문, 쌍떡잎식물강, 장미목 및 콩과에 속하는 식물을 의미할 수 있다.

본 발명의 다릅나무 식물추출물은 다릅나무의 줄기, 잎, 열매, 뿌리 및 전초로부터 이루어진 군에서 선택되는 단독 또는 그 혼합성분이 추출용매에 의해 추출된 것이며, 보다 바람직하게는 줄기 또는 열매로부터 추출된 추출물을 사용하는 것이다. 구체적으로는 본 발명의 다릅나무 식물추출물의 부위별 세포독성을 평가한 결과, 5㎍/㎖ 이하의 농도로 세포에 처리할 때, 80% 이상의 세포생존율을 확인할 수 있으며 더욱 바람직하게는 다릅나무 줄기 또는 열매 추출물의 경우, 우수한 세포생존율을 확인할 수 있다.

이에, 본 발명의 실시예에서는 다릅나무 줄기 추출물로부터 분리된 피세아타놀 성분 확인 및 그의 피부 미백 효능에 대하여 한정하여 설명하고 있으나, 다릅나무 식물추출물의 부위에 한정되지는 않을 것이다.

상기 다릅나무 식물추출물로부터 분리된 피세아타놀 성분은 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과, 알부틴보다 낮은 농도(10㎍/㎖)에서도 멜라닌 생성을 현저히 억제하며, 알부틴대비, 동일농도로 전환하여 비교하면 피세아타놀 성분이 알부틴보다 50 내지 100배의 멜라닌 생성억제 효과를 구현한다[표 6 및 도 1].

또한, 멜라닌 생합성 경로에 관여하는 단백질인 티로시나아제, Trp-1, Trp-2, MITF의 발현을 억제하여 미백 작용을 구현하며, 피부 미백효과 시험을 통해 2주차부터 색소침착(대, 소)이 감소되는 경향을 보이고, 피부 밝기가 밝아지는 결과를 보임으로써, 우수한 피부 미백결과를 뒷받침한다[표 7 및 도 2].

따라서, 본 발명의 다릅나무 식물추출물로부터 분리된 피세아타놀 유효성분은 0.00025∼0.001중량%로 함유되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 피세아타놀 유효성분이 0.00025중량% 미만이면, 탁월한 미백효과를 보기 어려우며, 0.001중량%를 초과하면, 안정성에 문제점이 발생할 수 있다.

나아가 본 발명은 피세아타놀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 대한 우수한 피부 미백효과를 확인함으로써, 다양한 제형의 피부 미백효능의 기능성 화장품을 제공할 수 있다.

이때, 바람직한 제형은 유연화장수, 영양화장수, 에센스 및 영양크림으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 제조예 1> 다릅나무 줄기 추출물 제조

다릅나무(Maackia amurensis Rupr. et Max.) 줄기 2,800g을 99.5% 메탄올에 침적시켜(혼합비율 1:20 중량비율) 3일 동안 실온에서 침출하였고, 상기 침출물을 여과지로 여과하고, 침출 여과과정을 3회 더 반복하였다. 이후, 380 메쉬로 여과하고 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다. 상기 여과액을 감압농축하여 엷은 노란 고체(pale yellow solid)의 농축물을 수득하였다. 상기 수득된 농축물을 동결건조하여 추출물을 얻었다.

< 제조예 2> 다릅나무 잎 추출물 제조

다릅나무 잎을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여, 농축물을 얻고 동결건조하였다.

< 제조예 3> 다릅나무 열매 추출물 제조

다릅나무 열매를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여, 농축물을 얻고 동결건조하였다.

< 제조예 4> 다릅나무 뿌리 추출물 제조

다릅나무 뿌리를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여, 농축물을 얻고 동결건조하였다.

< 제조예 5> 다릅나무 전초 추출물 제조

다릅나무 전초를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여, 농축물을 얻고 동결건조하였다.

< 실험예 1> 다릅나무 부위별 추출물의 세포독성 평가

상기 제조예 1∼5에서 제조된 다릅나무 부위별 추출물들에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, 사람 섬유아세포를 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 다릅나무 식물추출물 각각을 농도별로 처리한 후 같은 배양 조건에서 추가 배양하였다. 배양이 끝난 후 MTT{3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide} 용액을 넣고 배양하고, 그 후 배양액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 넣고 적당히 흔들어 준 뒤 마이크로플레이트계수기(Microplate reader)를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 그 값은 표 1과 같다. 여기서, 세포독성실험에서의 대조구는 상기 다릅나무 식물추출물을 넣지 않은 블랭크를 의미한다.

상기 표 1에서 뒷받침되는 바와 같이, 다릅나무 식물추출물의 세포독성 평가결과, 다릅나무 줄기 또는 열매 추출물의 경우, 5㎍/㎖ 이하의 농도로 세포에 처리할 때, 80% 이상의 세포생존율을 확인하였다. 이에, 이하의 실험은 다릅나무 줄기 메탄올 추출물에 대하여 수행하였다.

< 실시예 1> 다릅나무 메탄올 추출물의 용매분획물로부터 피세아타놀의 분리 및 구조 동정

상기 제조예 1에서 제조된 다릅나무(Maackia amurensis Rupr. et Max.) 메탄올 추출물에 대한 용매분획은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 다릅나무 메탄올 추출물(99.5% methanol extract)을 증류수에 현탁시켜 분별 깔대기를 이용해 n-헥산(n-Hex), 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc), n-부탄올(n-BuOH)을 사용하여 분획한 후 여과 및 감압 농축하여 각각의 용매별 n-헥산 분획물 1.36g, 메틸렌클로라이드 분획물 4.56g, 에틸아세테이트 분획물 92.28g, n-부탄올 분획물 37.96g 및 열수(H₂O) 분획물 36.46g을 얻었다.

에틸아세테이트 분획물(10.0g)을 가지고 고체상으로 실리카겔을 사용하고 이동상으로 메틸렌클로라이드와 메탄올(CH₂Cl₂/MeOH)을 용매 기울기 조건으로 사용하여 17개의 분획을 얻었다. 이때, 분획-10에 대하여 CH₃CN-Water 용매로 prep-LC를 실시하여 화합물을 분리하였다.

얻어진 화합물을 핵자기공명기(Bruker Co. 400 M Hz, NMR)를 이용하여 ¹H, ¹³ C-NMR 스펙트럼(도 1 참조)을 확인한 결과, 화학식 1의 피세아타놀(piceatannol)이 순수하게 분리되었음을 확인하였다[¹H-NMR (400 MHz, MeOH-d ₄ ) : δ 6.99 (1H, s, H-2), 6.89 (1H, d, J = 16.1 Hz, olefinic H), 6.83 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-6), 6.75 (1H, d, J = 16.1 Hz, olefinic H), 6.75 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.47 (2H, s, H-2', H-6'), 6.20 (1H, s, H-4), ¹³C-NMR (100 MHz, MeOH-d ₄ ) : δ 159.5 (C-3', 5'), 146.4 (C-3, 4), 141.3 (C-1'), 131.1 (C-1), 129.7 (C-olefinic), 127.0 (C-olefinic), 120.3 (C-6), 116.5 (C-5), 113.9 (C-2), 105.9 (C-2', C-6'), 102.7 (C-4)].

< 실시예2 > 유연화장수 제형 제조

상기 실시예 1에서 분리된 피세아타놀 성분을 유효성분으로 함유하는 유연화장수 제형을 제조하였다.

더욱 구체적으로, 소듐히알루로네이트는 정제수에 프로펠러믹서 3000rpm으로 분산하여 1중량% 농도로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1∼8을 프로펠러믹서 500rpm으로 균일화하고, 75℃에서 가온하여 완전 용해한 후, 실온으로 냉각하였다. 별도 용해조에 원료 9∼11를 완전 용해시켜 준비한 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 여기에, 피세아타놀 성분을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 미백화장용 유연화장수를 제조하였다.

< 실시예 3> 영양화장수 제형 제조

상기 실시예 1에서 분리된 피세아타놀 성분을 유효성분으로 함유하는 유연화장수 제형을 제조하였다.

하기 표 3에서 카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2중량% 함유용액으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1∼6을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7∼14를 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 피세아타놀 성분을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 미백화장용 영양화장수를 제조하였다.

<실시예 4> 에센스 제형 제조

상기 실시예 1에서 분리된 피세아타놀 성분을 유효성분으로 함유하는 유연화장수 제형을 제조하였다.

구체적으로는 하기 표 4에서 소듐히알루로네이트, 히드록시에틸셀룰로이스는 각각 정제수에 프로펠러믹서 2000rpm으로 분산하여 1중량% 함유용액으로 준비하였다. 카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2중량% 함유용액으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1∼12를 투입하여, 호모 2000rpm으로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 가온 된 수상을 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13∼15를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 여기에 피세아타놀 성분을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 미백화장용 에센스를 제조하였다.

< 실시예 5> 영양크림 제형 제조

상기 실시예 1에서 분리된 피세아타놀 성분을 유효성분으로 함유하는 유연화장수 제형을 제조하였다.

구체적으로 하기 표 5에서 제시된 바와 같이, 수상 용해조에 원료 1∼8을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 9∼16을 투입하여 80℃까지 가온 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 피세아타놀 성분을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 미백화장용 영양크림을 제조하였다.

< 실험예 1> 멜라닌 생성 억제 효과 평가

1. 세포독성검사

세포 독성 검사는 뉴트랄 레드 에세이(Neutral red assay) 방법을 이용하였다. 세포를 96웰 플레이트에 5×10⁴ 농도로 24시간 배양하였고 이때, 세포는 멜라닌 형성 세포주의 하나인 B16F1 멜라노마(melanoma)를 1% Antibiotic-Antimycotic(100X, Gibco)과 10% FBS(Fetal bovine serum, Gibco)를 포함한 DMEM(Dulbecco's modified essential medium, Hyclone)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 시료를 처리하였다. 이때, 상기 실시예 1에서 분리된 피세아타놀 성분을 DMSO(Dimethyl sulfoxide, Wako)에 용해시킨 후, 각 실험법에 맞는 추출용매에 농도별로 희석하여 사용하였다. 배양이 끝난 후 배지를 제거한 플레이트에 뉴트랄 레드를 처리하고 2시간 배양 후 용액을 제거하고 1중량% CaCl₂및 1중량% 포름알데하이드 용액으로 1분간 수세한 후 용액을 제거하고 1 중량% 아세트산과 1 중량% 포름알데하이드 용액을 넣고 5분 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 기록기를 이용하여 파장 570nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 하기 표 6에 기재하였다.

상기 표 5의 세포독성실험 결과, 실시예 1에서 분리된 피세아타놀 성분은 10㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다.

2. 멜라닌 생성 억제효과 측정

B16F1 멜라노마 셀을 6웰 플레이트에 5×10⁴ 농도로 24시간 배양 후 상기 표기된 농도의 시료를 시험 물질로 하여 B16F1 멜라노마 셀의 배양액에 첨가하여 3일간 배양하였다. 이때, 멜라닌 합성을 유도시키기 위한 의도로 0.2μM의 a-MSH(Melanicyte stimulating hormone)를 처리하였고, 이를 처리하지 않은 경우와 멜라닌 합성을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 잘 알려진 알부틴 처리한 것을 대조군으로 사용하였다.

48시간 배양 후 배양액을 제거하고 PBS 2회 세척 후 5분 동안 트립신(trypsin) 처리하여 튜브(ep-tube)에 옮겨 세포를 모두 회수하고 PBS로 세척 및 건조 후 1N NaOH와 10% DMSO 용액으로 세포를 녹이고, 96웰 플레이트에 옮긴 후 마이크로플레이트 기록기를 이용하여 파장 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.

도 1은 본 발명의 피세아타놀 성분에 의한 멜라닌 생성억제 실험 결과를 도시한 것으로서, 그 결과 흡광도 값이 a-MSH를 처리하지 않은 블랭크와 a-MSH 처리한 대조군과 비교하였을 때, a-MSH를 처리한 대조군이 약 2.3배의 멜라닌을 더 생성하였다.

또한, a-MSH를 처리한 알부틴(500㎍/㎖)과 비교하였을 때, 피세아타놀 성분은 알부틴보다 낮은 농도(10㎍/㎖)에서도 멜라닌 생성을 현저히 억제하였다. 이에, 본 발명의 피세아타놀 성분의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하였다.

< 실험예 2> 멜라닌 합성 관련 효소 단백질 발현 억제 평가

1. Western blotting

상기 실시예 1에서 분리된 피세아타놀 성분이 멜라닌 생합성을 관여하는 티로시나아제(Tyrosinase), Trp-1, 및 Trp-2, MITF와 같은 단백질의 발현을 억제하는지를 확인하기 위해 웨스턴 블롯(western blotting) 실험을 진행하였다.

B16F1(melanoma)을 10% FBS-DMEM에 배양한 후, 이를 취하여 세포농도를 5×10⁴ 농도로 조정한 세포액을 조제하였다. 이를 6-웰 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다. 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 최종농도 0.2μM α-MSH로 조제한 배지와 시료를 농도별로 혼합한 뒤 다시 동일 조건에서 24시간 배양시켰다. 블랭크의 경우 α-MSH을 첨가하지 않은 배지만을 넣었으며, 양성 대조구는 500㎍㎖ 농도의 알부틴을 사용하였다.

24시간 배양한 후, 세포를 회수하고 PRO-PREPTM 단백질 추출액(Intron, Korea)으로 처리하여 세포를 용해한 다음 원심분리하였다.

상층액을 취한 다음 8∼10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동하고, PVDF 막으로 이전시켰다. 5% 스킴밀크(skim milk)가 함유된 트리스 완충용액으로 1 시간 블락킹(blocking)한 후, 티로시나아제(Tyrosinase), TRP-1, TRP-2, MITF, β-actin 1차, 2차 항체와 각각 반응시켰다. Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate(Millipore, USA)를 이용하여 2 min 반응시킨 후 Chemi-Doc (ATTO, Japan)을 사용하여 현상하였다.

도 2는 본 발명의 피세아타놀 성분에 웨스턴 블롯 실험 결과로서, 피세아타놀 성분 10 ㎍/㎖ 농도에서 티로시나아제, Trp-1, Trp-2, MITF 발현을 저해하는 결과를 확인하였다.

따라서 티로시나아제 성분의 미백 효과는 멜라닌 생성 단계 관여효소들의 발현이 억제되어 나타나는 것임을 확인하였다.

< 실험예 3> 피부 미백 효과 시험

인-비트로 실험에서 나타난 미백 효과가 실제적으로 사람의 피부 미백에 도움을 주는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 5에서 제조된 영양크림에 대하여, 인체 적용시험을 실시하였다.

로보스킨 분석기(Roboskin analyser) 장비를 이용한 피부 미백 시험은 피시험자의 얼굴 부위에 시료 또는 제품을 적용하면서 주기적으로 색소 침착 및 피부톤(밝기)의 개선 효과를 평가하였다. 시험은 역시 피부 탄력 개선 시험과 동일하게 수행되었다. 피시험자 10명(대조구 5명, 시험구 5명)으로 진행되었으며 모두 여성으로 연령은 평균 34세로 구성되었다. 사용 전, 사용 후 1주, 2주, 4주, 6주의 총 5회 측정을 실시하여 평균값을 구하였으며 모든 시험은 20∼24℃, 습도 45∼55%인 항온항습실에서 진행되었고, 세안 후 항온항습실에서 최소 1시간 이상 적응시킨 후 측정하였고, 그 결과는 표 7에서 제시한 바와 같다.

상기 표 6의 피부 미백 효과 결과로부터, 사용 2주차부터 색소침착(대, 소)이 감소되는 경향을 나타내었으며 피부 밝기 또한 밝아지는 결과를 확인함으로써, 피부 미백효과를 입증하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 국내 자생식물의 생리활성에 대한 연구를 통해 다릅나무(Maackia amurensis ) 식물추출물로부터 피세아타놀을 분리동정하고, 상기 피세아타놀에 대하여, 종래 면역 조절 및 항염증이 아닌, 멜라닌 생합성 억제활성과 멜라닌 생합성에 관여하는 단백질의 발현 억제효과를 확인함으로써, 이를 함유한 피부 미백 화장료 조성물을 제공하였다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (4)

1. 다릅나무(Maackia amurensis ) 식물추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 피세아타놀을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물.
   

   
2. 제1항에 있어서, 상기 다릅나무 식물추출물이 다릅나무의 줄기, 잎, 열매, 뿌리 및 전초로부터 이루어진 군에서 선택되는 단독 또는 그 혼합성분이 함유된 것을 특징으로 하는 피부 미백 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 유효성분이 0.00025∼0.001 중량%로 함유된 것을 특징으로 하는 피부 미백 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 유효성분이 유연화장수, 영양화장수, 에센스 및 영양크림으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형에 함유된 것을 특징으로 하는 피부 미백 화장료 조성물.

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