KR101748806B1 - Purpurogallin을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 화장료 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배 유래의 폴리페놀 산화효소를 활용한 pyrogallol 산화생성물 purpurogallin을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 MITF의 활성을 억제함으로써 멜라닌 생합성 활성을 저감시키는 멜라닌 생성 억제 기능성 화장료 조성물로 제공할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

Purpurogallin을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 화장료 조성물 및 그 제조방법{Anti-melanogenic cosmetic composition of Purpurogallin as an efficient component and preparation method of the same}

본 발명은 purpurogallin을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 B16 melanoma 세포에 purpurogallin을 처리 시 멜라닌 생성과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 MITF의 활성을 억제함으로써 멜라닌 생합성 활성을 저감시키는 피부 미백 기능성 및 주름개선 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 세포는 자외선과 환경오염 및 그 밖의 요인에 의한 자극의 방어 기전으로 포유동물의 표피 기저층에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)의 멜라노좀에서 tyrosine이 tyrosinase 효소에 의해 멜라닌을 생성한다. 멜라닌 생성과 관련하여 잘 알려진 효소로는 tyrosinase 외에도 tyrosinase related protein-1(TRP-1)과 dopachrome tautomerase(DCT) 등이 있다. 그러나 이 중에서 tyrosinase 는 멜라닌 생합성의 속도 결정 단계인 초기 반응에 작용하는 효소로서 tyrosine을 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)으로 전환시키는 tyrosine hydroxylase 활성과 DOPA를 DOPA quinone으로 산화시키는 DOPA oxidase 활성을 모두 가지고 있다. 또한 TRP-1은 mouse에서 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA)를 indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid로 산화하는 효소로 작용하나, human TRP-1은 이러한 활성이 없는 것으로 보고되었다. 과거 DCT는 tyrosinase related protein-2(TRP-2)로 불렸던 효소로 dopachrome을 DHICA로 이성화하는 능력이 있는 효소이다. 그중 tyrosinase 효소는 eumelanin과 pheomelanin의 합성에 반드시 필요하며, TRP-1과 DCT는 eumelanin의 합성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

자외선(ultraviolet)에 의한 피부 손상이나 노화 또는 발암으로부터 신체를 보호하기 위한 멜라닌의 생성은 색소의 합성이나 분포의 기능에 장애가 있을 경우 다양한 피부 질환을 유발하게 되며, 과도한 색소의 침착은 흑색종, 주근깨, 노인성 검버섯 등을 생성시키는 것으로 알려져 있다. 최근에 사람들의 미적 욕구와 건강에 대한 관심이 증가하면서 화장품 업계에서는 멜라닌의 생성을 억제하는 기능성 화장품의 개발에 대한 관심이 점점 높아지고 있다. 최근에는 melanin 과잉 생성을 억제하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있으며, 지금까지 알려진 tyrosinase의 저해제로 hydroquinone, arbutin 및 kojic acid 등이 있다. 그러나 피부 안전성 및 제품 제형 안정성 등의 문제로 제한된 양만 사용되고 있으며, 이에 따라 melanin 합성을 감소시키고 동시에 부작용이 없는 천연소재 개발이 주목을 받고 있다.

녹차에는 (-)-epigallocatechin gallate(EGCG) 등 다량의 폴리페놀이 함유되어 있는데 이들 화합물은 녹차 잎에 존재하는 polyphenol oxidase에 의해 카테킨의 catechol과 pyrogallol 부분이 산화되고 benzotropolone의 새로운 구조를 가진 theaflavin과 같은 축합물을 생성한다. 본 연구에서는 이전 연구에서 보고한 페놀성 화합물의 효소반응 산화생성물의 항염증 효능 평가를 수행한 실험과 동일한 방법으로 배 유래의 polyphenol oxidase를 효소원으로하여 페놀성 화합물인 pyrogallol이 산화반응에 의해 형성되는 purpurogallin의 피부 미백 활성에 관한 연구를 수행하였다.

본 발명과 관련하여 선행기술로는 대한민국 등록특허 제10-1510315호에 공지되어 있으나 이는 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로 왕지네(Scolopendra subspinipes) 추출물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 억제 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 그러나 현재까지 purpurogallin을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 기능성 화장료 조성물에 관련된 발명은 공지된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 배 유래의 폴리페놀 산화효소를 활용한 pyrogallol 산화생성물인 purpurogallin을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 기능성 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 경산에서 생산된 배(280g)를 증류수 280mL에 넣어 마쇄하여 균질화하는 단계와; 상기 균질현탄액 160mL를 거즈로 여과한 다음 증류수 40mL로 녹인 pyrogallol 200mg을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 교반시키는 단계와; 상기 단계의 여과액을 10% 메탄올 100mL에 현탁시킨 후 EtOAc로 분획하여 EtOAc 가용분획물 205.1mg을 얻는 단계를 통해 purpurogallin을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 제조한 purpurogallin 100mg을 YMC gel ODS AQ 120S를 이용한 칼럼크로마토그래피를 이용해 50% MeOH 용리액에서 purpurogallin을 순수 분리하는 단계와; 상기 단계에서 분리한 purpurogallin을 HPLC를 통해 확인하고 MTT assay 및 western blot을 통해 purpurogallin의 멜라닌 생성 억제 효과를 검증하고 이를 평가함으로써 달성하였다.

본 발명은 배 유래의 폴리페놀 산화효소를 활용한 pyrogallol 산화생성물인 purpurogallin이 B16 melanoma 세포에서 멜라닌 생성을 억제함으로써 멜라닌 생성 억제 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도1은 본 발명에 따른 purpurogallin을 HPLC assay를 통해 분석하여 화합물의 생성을 확인한 그래프이다.
도2는 본 발명에 따라 B16 melanoma 세포에 purpurogallin을 처리했을 때 나타나는 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도3은 본 발명에 따라 B16 melanoma 세포에 purpurogallin을 처리했을 때 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도4는 본 발명에 따라 B16 melanoma 세포에 purpurogallin을 처리했을 때 멜라닌 생합성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도5는 본 발명에 따라 B16 melanoma 세포에 purpurogallin을 처리했을 때 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase 활성을 western blot을 통해 나타낸 사진도 및 그래프이다.

본 발명은 melanoma 세포에 하기 구조식(I)을 가지는 purpurogallin을 처리하여 멜라닌 생성 억제효과를 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

^{… [구조식 I]}

본 발명에 따른 상기 purpurogallin은 배 유래의 폴리페놀 산화효소에 의하여 pyrogallol 산화반응에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에 따르면 상기 purpurogallin은 경산에서 생산한 배를 구입하여 제조하였으며 배 유래의 폴리페놀 산화효소를 활용한 pyrogallol 산화생성물로 인체에 유해한 시약을 전혀 사용하지 않은 green chemistry의 방법으로 제조하였다.

또, 본 발명에 따라 제조된 상기 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 할 수 있다.

본 발명은 하기의 구체적인 실시예, 실험예에 의해 보다 구체적으로 설명되나, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.

실시예1. Purpurogallin 제조.

경산에서 생산된 배(280g)를 증류수 280mL에 넣어 마쇄한 후 균질화하고 4겹의 거즈로 여과한 다음 상기 단계에서 얻은 균질현탄액 160mL에 증류수 40mL로 녹인 pyrogallol 200mg을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 단계에서 교반시킨 여괘액을 10% 메탄올 100mL에 현탁시킨 후 EtOAc로 분획하여 EtOAc 가용분획 205.1mg을 얻었고 이를 역상 HPLC로 분석하여 본 발명 화합물의 생성을 확인하였다.

실험예1. Purpurogallin 분리

상기 실시예1의 방법으로 얻은 purpurogallin을 분석하기 위해 역상 HPLC asaay를 하였다. 이를 평가하기 위해 EtOAc 가용분획 100mg을 YMC gel ODS AQ 120s(1.1cm i.d X 37cm)를 이용한 칼럼크로마토그래피를 수행하여 50% MeOH 용리액에서 Purpurogallin 83.5mg(t _R 11.0min)을 순수 분리하였다. 이동상 용매A는 0.1% HCOOH, 용매B는 acetonitrile을 사용하여 gradient elution하였다. 유속은 1.0mL/min을 유지하였고 280nm에서 검출하였다. HPLC 칼럼은 YMC-Pack ODS A-302 column(4.6mm i.d X 150mm)을 사용하였다.

실험 결과, 도1에서 알 수 있듯이 pyrogallol은 3.34min에서 검출되었으며, polyphenol oxidase에 의해 반응하여 생물 전환된 화합물이 11.04min에서 확인되었다.

실시예2. 세포배양

Melanoma(B16F10) 세포를 배양하기 위해 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin(100U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. Melanoma(B16F10) 세포에 purpurogallin 용액을 2.5, 5, 10, 25 및 50μM 또는 양성대조군 kojic acid 2.5μM을 1시간 전처리한 후 α-MSH를 10nM/mL로 처리하고 48시간 배양하였다.

실험예2. 세포생존율 측정

상기 실시예2의 방법으로 배양한 melanoma 세포에 시료용액 및 양성대조군 처리로 인한 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay를 Carmichael의 방법으로 사용하여 평가하였다. 이를 위해 상기 실시예2의 방법으로 배양한 melanoma 세포를 96well plate에 5x10⁴ cells/well이 되게 0.18mL 분주하고 purpurogallin을 2.5, 5, 10, 25 및 50μM 농도로 조제하여 0.02mL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건에서 배양하였다.

실험 결과, 도2에서 알 수 있듯이 purpurogallin 처리에 의한 세포의 생존율은 대조군과 비교했을 때 50μM의 농도에서 60%의 생존율을 나타내었으나, 2.5, 5, 10 및 25μM에서는 80% 이상의 생존율을 나타냈다.

실험예3. tyrosinase 저해 활성 측정

피부 melanoma 세포로부터 tyrosinase 활성 측정은 Martinez-Esparza의 방법으로 측정하였다. 상기 실시예2의 방법으로 배양한 melanoma 세포를 100mm culture dish에 2x10⁶ cells/dish가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 2.5 내지 25μM 농도로 조제하여 2mL 첨가하고 48시간 후에 pH 7.4 인산완충액으로 세척하였다. Lysis buffer를 200uL씩 분주한 후 세포를 수거 후 얼음에서 30분간 lysis시켰다.

실험 결과, 도3에서 알 수 있듯이 melanoma 세포에서 tyrosinase 활성을 측정한 결과 purpurogallin의 경우 2.5 내지 25μM 농도에서 농도 의존적으로 tyrosinase 활성이 감소하였다. 특히 25μM 농도에서 20% 이상의 tyrosinase의 활성 저해능을 나타내었으며 purpurogallin은 tyrosinase의 활성을 직접적으로 저해함으로써 멜라닌 합성을 억제하는 것으로 나타났다.

실험예4. melanin 생합성 측정

멜라닌은 세포 내의 ribosome에서 tyrosinase 작용에 의해 합성되고, 상기 tyrosinase 작용으로 아미노산인 tyrosine는 피부 기처층의 멜라닌 세포의 흑색소포 표면에 침착하여 melanin 입자가 형성된다. 세포 내 멜라닌 생합성을 측정하기 위해 상기 실시예2의 방법으로 배양한 melanoma 세포에 purpurogallin을 2.5, 5, 10 및 25μM 농도로 처리하였다. 대조군으로는 kojic acid를 2.5μM 처리한 군을 이용하여 비교하였다.

실험 결과, 도4에서 알 수 있듯이 purpurogallin 농도가 증가할수록 멜라닌 생합성이 감소하였다. 특히 25μM 농도에서 20% 멜라닌 생합성 저해 활성을 나타냈다. 대조군과 비교했을 때 약 50%의 멜라닌 저해 활성을 나타냈다.

실험예5. MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase 저해 활성 측정

미백 관련 mechanism인 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase 활성을 보기 위하여 상기 실시예2의 방법으로 배양한 melanoma 세포의 suspension을 100mm culture dish에 각 well당 2x10⁴ cells/mL로 가한 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화시켰다. 배지를 제거하고 purpurogallin을 2.5, 5, 10 및 25μM 농도로 처리한 배지로 교체하고 48시간 배양 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하였다. Lysis buffer 100uL로 용해해서 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액만을 모은 후 Bradford assay로 정량하여 20uL의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide에 전기 영동하여 분리하였다. 분리한 단백질을 PVDF membrane에 옮긴 후 MITF(Santa Cruz, 1:1000), TRP-2(Santa Cruz, 1:1000) tyrosinase(Santa Cruz, 1:1000) 및 β-actin(Santa Cruz, 1:1000)을 1차 항체로 4℃에서 Over night하고 ECL(Amersham Pharmacia) 용액으로 반응시키고 LSA4000 chemiluminescence detection system을 이용해 밴드 및 density를 확인하였다. 대조군으로는 purpurogallin을 처리하지 않은 melanoma 세포를 이용하여 비교하였다.

실험 결과, 도5에서 알 수 있듯이 대조군에 비해 purpurogallin을 처리한 실험군에서 모두 단백질 발현이 감소하였다. purpurogallin 25μM의 농도에서 tyrosinase의 단백질 발현량은 약 10% 저해되었으며 TRP-1은 25% 저해되었고 TRP-2는 20% 저해되었다. 또, 미백 관련 전사인자인 MITF는 약 15% 저해되어 미백에 관련된 전사인자의 발현에 효과가 있음을 나타냈다. 결론적으로 purpurogallin은 멜라닌 합성에 직접적으로 관여하는 효소인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 억제하고 melanocyte 세포 수준에서 활성을 억제하여 melanin 합성을 억제하는 것으로 나타났다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 배 유래의 폴리페놀 산화효소를 활용한 pyrogallol 산화생성물인 purpurogallin을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 기능성 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 화장료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

1. 삭제
2. 배를 증류수에 넣어 마쇄하여 균질화하는 단계와; 상기 단계의 균질현탄액을 거즈로 여과한 다음 증류수로 녹인 pyrogallol을 첨가하고 실온에서 교반시키는 단계와; 상기 단계의 여과액을 메탄올에 현탁시킨 후 EtOAc로 분획하여 EtOAc 가용분획물을 얻는 단계를 통해 purpurogallin을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 제조한 purpurogallin을 칼럼크로마토그래피를 이용해 MeOH 용리액에서 purpurogallin을 분리하는 단계로 이루어진 purpurogallin 제조방법에 따라 제조된 purpurogallin을 함유하는것이 특징인 멜라닌 생성 억제 기능성 화장료 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것이 특징인 화장료 조성물.
   
   

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