KR20180006699A - 갈색거저리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈색거저리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 갈색거저리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 또는 항염 기능을 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 갈색거저리 추출물은 프리 라디칼 소거 효과와 멜라닌 생성 억제 효과 또는 염증유발 인자의 생성 또는 발현을 억제하는 효과를 발휘하므로 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항산화, 미백 또는 피부 염증성 질환 개선을 위한 기능성 화장품의 소재로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

갈색거저리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장료 조성물{Cosmetic compositions for anti-oxidation, skin whitening or anti-inflammation comprising Tenebrio molitor extracts as an active ingredient}

본 발명은 갈색거저리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 갈색거저리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 또는 피부 염증성 질환 개선 기능을 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 노화의 원인으로는 크게 자연 노화(내인성 노화, intrinsic aging)와 광 노화(photoaging)로 나눌 수 있는데, 자연 노화는 시간이 흐르면서 자연스럽게 생기는 노화이고 광 노화는 생활 속에서 햇빛에 노출되어 생기는 노화이다.

자외선(ultraviolet rays; UV)에 노출되면 피부에서는 활성 산소종(ROS, reactive oxygen species)이 생성되고, 과잉 생성된 활성산소는 산화작용을 일으켜 세포막, DNA 그리고 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산과 반응하여 세포에 손상을 주고 피부 노화를 발생시키는 원인이 된다. 이러한 활성산소를 억제하는 성분으로는 butylated hydroxy anisol(BHA), butylated hydroxy toluene(BHT) 등이 알려져 있다.

또한 UV는 멜라닌 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있는데, 멜라닌은 피부의 색을 결정하는 주요 인자로 자외선에 의해 피부가 자극을 받으면서 표피의 melanocyte에 존재하는 melanocortin 1 receptor(MC1R)와 뇌하수체에서 분비되는 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)이 결합하여 cyclic adenosine monophosphate(cAMP)/protein kinase A(PKA) 경로에 의해 microphthalmia-associated transcription factor(MITF)의 발현이 증가되면서 형성된다. 또한 전구물질인 tyrosine 단백질이 tyrosinase라는 효소에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanin(L-DOPA)으로 전환되는 가수분해과정과 L-DOPA를 phenylanine-3,4-quinone(DOPA quinone)으로 전환시키는 산화과정을 거쳐 형성된다. 생성된 멜라닌은 피부 중에 침착되어 "검버섯", "주근깨"로 발전하는데, 이것을 방지하기 위하여 다양한 화장품 조성물이 함유된 미백 화장품이 사용되고 있다.

한편, 염증(inflammation)이란 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적인 변화를 가져오는 것에서 수복 재생하려는 일련의 과정이며 macrophage나 mast cell 등의 백혈구에서 생성된 다양한 신호전달물질인 histamine, prostaglandins(PGs), leukotriene과 같은 혈관 활성 물질로 인해 혈관투과성이 증가하여 염증을 유발하게 된다. macrophage는 대표적인 염증 매개물인 nitric oxide(NO)과 cytokine 생성에 관여하며, 그람 음성세균 (gram-negative bacteria)의 세포 외막에 존재하는 lipopolysaccharide(LPS)는 macrophage 또는 monocyte에서 interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6(IL-6), tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 같은 cytokine을 증가시키는 것으로 알려져 있다. Inducible nitric oxide synthase(iNOS)는 세포내 세포질에 존재하는 효소로서 NO를 생성하는 반응을 촉매한다. 염증반응 부위에서 발견되는 cyclooxygenase-2(COX-2)는 arachidonic acid를 대사시켜 PGE2 등의 PGs를 형성하여 국소 부위에 염증과 통증을 발생시킨다.

갈색거저리(Tenebrio molitor, mealworm)는 딱정벌레목 (Coleoptera) 거저리과로서 한국을 비롯한 전세계에 분포하고 있다. 현재 곤충을 이용한 화장료 조성물 관련 특허로는 귀뚜라미 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물(대한민국 등록특허 제10-1429679호), 누에고치로부터 추출된 세리신 단백질을 함유하는 미용팩조성물(대한민국 등록특허 제10-0542266호) 등이 있으나, 갈색거저리 추출물을 화장료 주성분으로 사용된 적은 아직 없다.

이에 본 발명자들은 생체에 부작용이 없으면서 항산화, 미백 및 피부 염증 개선 효과가 우수한 화장품 제조를 위한 새로운 소재로 천연물질을 모색하던 중, 갈색거저리 추출물에 주목하여 그 기능을 실험해 본 결과, 갈색거저리 추출물이 프리 라디칼 소거 효과와 멜라닌 생성 억제 효과, 염증유발 인자의 생성 또는 발현을 억제하는 효과가 있음을 발견하여 항산화, 미백 또는 피부 염증성 질환 개선을 위한 화장품 천연소재로서의 활용 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1429679호 2. 대한민국 등록특허 제10-0542266호

따라서 본 발명의 목적은 생체에 부작용이 없으면서 항산화, 피부 미백 및 피부 염증성 질환 개선 효능이 있는 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갈색거저리 추출물은 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갈색거저리 추출물은 DPPH(1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl), ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 라디칼 또는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical) 활성을 저해하여 항산화 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갈색거저리 추출물은 티로시나아제(tyrosinase), MITF(microphthalmia-associated transcription factor), TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 또는 cAMP(cyclic adenosine-3',5'-monophosphate; cyclic AMP)의 발현을 억제하여 멜라닌 생성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갈색거저리 추출물은 NO(nitric oxide), iNOS(inducible nitric oxide synthase), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6 (interleukin-6), IL-1ß(interleukin-1ß) 또는 NF-κB (nuclear factor keppa B)의 발현을 억제하여 피부 염증성 질환을 개선하는 것일 수 있다.

본 발명의 갈색거저리 추출물은 DPPH, ABTS, 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 활성을 억제하는 항산화 효과와 티로시나아제, MITF, TRP-1, TRP-2 및 cAMP의 발현을 저해하는 기작을 통하여 멜라닌 생성을 억제함으로써 미백효과를 가지며, NO, iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β 및 NF-κB의 발현을 억제하는 기작을 통해 항염 효과를 나타내므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 피부에 자극을 일으키지 않는 항산화, 미백 또는 피부 염증성 질환 개선을 위한 기능성 화장품의 소재로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물의 DPPH에 대한 전자 공여능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(p < 0.01)
도 3은 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물에 대하여 ABTS+ 라디칼 소거활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(p < 0.01)
도 4는 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물에 대하여 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(Superoxide anion radical) 소거활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(p < 0.01)
도 5는 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물에 대하여 mushroom 유래의 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(p < 0.01)
도 6은 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물에 대한 melanoma cell(B16F10)의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. α-MSH 처리군)
도 7은 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물에 의한 melanoma cell(B16F10)에서의 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. α-MSH 처리군)
도 8은 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물에 의한 melanoma cell(B16F10)에서의 멜라닌(melanin) 생합성 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. α-MSH 처리군)
도 9는 Western blot을 통한 갈색거저리 용매별 추출물 및 물 추출물의 처리농도에 따른 melanoma cell(B16F10)에서의 tyrosinase 및 MITF 단백질 발현율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. α-MSH 처리군)
도 10은 Western blot을 통한 갈색거저리 물 추출물의 처리농도에 따른 melanoma cell(B16F10)에서의 TRP-1 및 TRP-2 단백질 발현율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. α-MSH 처리군)
도 11은 Real-time PCR을 통한 갈색거저리 물 추출물의 처리농도에 따른 melanoma cell(B16F10)에서의 tyrosinase 및 MITF의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. α-MSH 처리군)
도 12는 Real-time PCR을 통한 갈색거저리 물 추출물의 처리농도에 따른 melanoma cell(B16F10)에서의 TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. α-MSH 처리군)
도 13은 갈색거저리 물 추출물의 처리농도에 따른 melanoma cell(B16F10)에서의 cAMP 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. α-MSH 처리군)
도 14는 immunofluorescence assay를 통해 갈색거저리 물 추출물에 의한 melanoma cell(B16F10)내에서의 MITF 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물에 대한 macrophage cell(RAW 264.7)의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. LPS 처리군)
도 16은 갈색거저리를 에탄올, 메탄올 또는 물로 추출한 추출물에 의한 macrophage cell(RAW 264.7)에서의 nitric oxide(NO) 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. LPS 처리군)
도 17은 갈색거저리 물 추출물의 처리농도에 따른 macrophage cell(RAW 264.7)에서의 PGE2 및 TNF-α 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. LPS 처리군)
도 18은 갈색거저리 물 추출물의 처리농도에 따른 macrophage cell(RAW 264.7)에서의 IL-1β 및 IL-6 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. LPS 처리군)
도 19는 Western blot을 통한 갈색거저리 50% 메탄올 추출물의 처리농도에 따른 macrophage cell(RAW 264.7)에서의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. LPS 처리군)
도 20은 Western blot을 통한 갈색거저리 물 추출물의 처리농도에 따른 macrophage cell(RAW 264.7)에서의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. LPS 처리군)
도 21은 Real-time PCR을 통한 갈색거저리 물 추출물의 처리농도에 따른 macrophage cell(RAW 264.7)에서의 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.(*p < 0.01 vs. LPS 처리군)
도 22는 immunofluorescence assay를 통해 갈색거저리 물 추출물에 의한 macrophage cell(RAW 264.7)내에서의 NF-κB 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 항산화 효과를 나타내고, 피부 미백 효과를 증진시키며, 피부 염증성 질환을 개선시킬 수 있는 새로운 화장품 소재를 연구하던 중, 갈색거저리 추출물이 이러한 기능을 가지고 있음을 확인하였다.

갈색거저리(Tenebrio molitor, mealworm)는 딱정벌레목 (Coleoptera) 거저리과로서 한국을 비롯한 전세계에 분포하고 있다. 주로 애완동물의 먹이로 많이 사용되고 있으며 최근에는 갈색거저리가 대량 생산이 용이한 점과 단백질 등의 영양성분이 풍부한 점을 이용하여 미래의 식량자원으로서 가치도 연구되고 있다. 보고된 연구로는 갈색거저리에서 분리한 항진균단백질을 이용한 항균효과 등이 있으며 동의보감 및 본초강목에는 간경화, 간암, 파상풍 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 약리적 효능에 대한 연구가 미비하여 다양한 방면에서 탐색이 필요하다. 그러므로 본 연구에서는 갈색거저리의 용매별 추출물에 대한 미백, 항염증 및 항산화 효과를 검증하는 실험을 실시하였다.

따라서 본 발명은 갈색거저리에서 추출한 갈색거저리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

특히 본 발명자들은 천연물질로부터 유래되어 인체에 안정하면서도, 탁월한 항산화, 미백 또는 항염 효과를 나타낼 수 있는 소재를 찾고자 모색하던 중, 갈색거저리 추출물에 주목하였으며, 갤색거저리 추출물이 이러한 효과를 가지고 있는지 실험을 통해 확인하였다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 갈색거저리 추출물은 DPPH(1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl), ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 라디칼 또는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical) 활성을 저해하는 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다(도 10 내지 도 12 참조).

한편, 멜라닌은 피부에 존재하는 색소로 자외선 등 외부의 자극으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 한다. 하지만 이것이 과잉 생성되어 침착되면 기미나 주근깨 등을 형성시켜 피부 외관상 문제를 야기할 수 있으며 나아가 피부노화를 촉진시키고 피부암을 유발할 수 있기 때문에 멜라닌 과잉생성을 억제할 수 있는 물질의 경우 미백제품으로 사용이 가능하다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 갈색거저리 추출물이 티로시나아제(tyrosinase)를 농도의존적으로 저해하며, MITF(microphthalmia-associated transcription factor), TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 및 cAMP(cyclic adenosine-3',5'-monophosphate; cyclic AMP)의 발현을 억제하여 멜라닌 생합성을 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났다(도 13 내지 22 참조).

따라서 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생합성을 억제하는 본 발명의 갈색거저리 추출물의 경우 피부의 색소 침착 예방 또는 피부의 미백 효과를 위한 용도로 사용될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 갈색거저리 추출물이 NO(nitric oxide) 생성 저해활성을 나타내며, iNOS(inducible nitric oxide synthase), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6 (interleukin-6), IL-1ß(interleukin-1ß) 및 NF-κB (nuclear factor keppa B)의 발현을 억제하여 항염 효과가 있는 것으로 나타났다(도 23 내지 30 참조).

따라서 염증 억제 활성을 나타내는 본 발명의 갈색거저리 추출물의 경우 피부의 염증성 질환을 개선하기 위한 용도로 사용 될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명자들은 상기 갈색거저리 추출물 중 특히 어떠한 용매를 이용하여 추출한 추출물이 항산화, 미백 및 피부 염증성 질환 개선 효과가 우수하게 나타나는지를 실험해 본 결과, 갈색거저리를 물로 추출한 갈색거저리 물 추출물이 가장 효과가 뛰어남을 확인하였다.

이와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 갈색거저리 추출물이 항산화, 미백 및 피부 염증성 질환 개선 효과를 모두 가지고 있으며, 특히 갈색거저리 물 추출물이 가장 우수한 효과를 나타낸다는 것을 실험적으로 입증하였다.

본 발명에 따른 갈색거저리 추출물은 당업계에 공지된 추출하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 추출물은 적절한 용매를 이용하여 갈색거저리로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 갈색거저리의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 바람직하게는 갈색거저리를 추출한 추출물일 수 있다.

상기 갈색거저리로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 아세톤, 에탄올, 메탄올 또는 물을 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 갈색거저리 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 갈색거저리 추출물은 상기한 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 원심분리, 여과, 농축후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 그대로 사용할 수도 있고, 상기 1차 추출물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 갈색거저리 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

실험 재료 준비

<1-1> 실험 재료

갈색거저리(Tenebrio Molitor)는 에스웜(Sworm, Gyeonggi, Korea)에서 구입하여 용매별로 추출후 동결건조하여 사용하였다.

<1-2> 시약 및 기기

(1) 항산화능 분석 시약

항산화능 측정 실험에 사용된 시약인 2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin e-6-sulphonic acid), 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), xanthine, xathine oxidase, nitro blue tetrazolium(NBT) 등은 sigma chemical Co.(St, Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

(2) 미백 효과 측정 시약

미백 효과 측정에 사용된 시약인 mushroom tyrosinase, L-3,4-dihydroxy phenyl-alanine(L-DOPA) 등은 sigma chemical Co. Ltd.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. cAMP kit(Cayman, Ann Arbor, MI, USA), MITF, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 등의 항체는 santa cruz(Biotech, CA, USA)에서 구입 하였다.

(3) 항염증 측정 시약

항염증 측정 실험에 사용된 시약인 p-dimethylaminobenzaldehyde, sodium nitrite, griess reagent, ripa buffer, lipopolysaccharide, protease inhibitor 등은 sigma chemical Co. Ltd.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. PGE2와 cytokine 측정을 위한 ELISA kit는 R&D systems Inc.에서 구입하였으며 iNOS, COX-2, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, horseradish peroxidase-conjugated 2차 antibody는 santa cruz (Biotech, CA, USA)에서 구입 하였다.

(4) 세포 독성 측정에 사용된 세포주 및 시약

세포 생존율 측정에 사용된 세포주는 mouse melanoma cell(B16F10), macrophage cell(RAW 264.7)로 american type culture collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양을 위한 dulbecco's modified eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 LONZA Co.에서 구입하여 사용했으며, 0.25% trypsin-EDTA, 0.4% trypan blue stain은 gibco BRL Co.(Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였고, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromid(MTT)는 sigma chemical Co. Ltd.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

(5) 실험에 사용된 기기

본 발명에서 사용된 기기는 UV/VIS spectrophotometer(Hitachi, Japan), polarization microscope(Olympus BX 51, Japan), western imaging system(CAS-400SM, Davinch-K, Korea), rotary vacuum evaporator(Tokyo, Rikakikai Co. Japan), centrifμge(Hitachi, Japan), freeze drier(Ilsin, Korea), microscope(Olympus, Japan), CO2 incubator(Hanbaek Scientific Co., Korea), pH meter(Metrohm. Switzerland), BOD Incubator(Hanbaek Co., Korea), autoclave(Hanbaek Scientific Co., Korea), ELISA reader(Molecular Devices, USA)를 사용하였다.

< 실시예 2>

세포 배양 및 세포 독성 실험

<2-1> 세포배양

본 발명의 실시예에서 이용한 B16F10, RAW 264.7 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin(100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

<2-2> MTT assay 에 의한 세포 독성 측정

세포 독성 측정은 Carmichael[Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: Assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 1987;47(4):936-42.]의 방법에 따라 측정하였다. 각 세포주 B16F10 cell과 RAW 264.7은 96 well plate에 5×104 cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 하기 수학식 1에 나타난 공식을 이용하여 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었으며, 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었고, p값이 0.01 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다(p<0.01).

<실시예 3>

단백질 및 mRNA 발현 분석 실험

<3-1> Western blot을 통한 단백질 발현 측정

cell을 차가운 PBS로 2회 세척 후 RIPA buffer 10 mL에 complate mini 1 tab을 가한 것으로 용해해서 4℃ 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 bradford assay로 정량하여 25 μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE 에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell(Hofer, USA) 기기를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 30분 동안 blocking buffer(5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 3시간 동안 반응한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 membrane을 HRP가 중합된 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 60분 동안 반응시켰다. 3회 washing 한 뒤 davinch-k western imaging system 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량 하였다. 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었고, 분석 대상에 따라 p값이 0.01 또는 0.05 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다(p<0.01 or 0.05).

<3-2> mRNA 분리 및 Real-time polymerase chain reaction(PCR) 분석

(1) Cell lysis 및 cDNA 합성

100 mm dish에 cell seeding을 하고 24시간 동안 배양한 후 샘플을 농도별로 처리하여 cell의 종류에 따라 B16F10 cell은 48시간, RAW 264.7 cell은 24시간 동안 유지시켰다. 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer 각각의 dish 에 1 mL씩 분주하여 세포를 lysis 한 후 상온에서 5분동안 방치하였다. Trizol buffer를 mL 당 chloroform 200 μL∼500 μL를 첨가하여 약 15초동안 강하게 vortexing 해주고 다시 상온에서 5분간 방치하였다. 원심분리기를 이용하여 4℃에서 12,000∼15,000 rpm으로 15분간 실시하고 상등액 400 μL를 새 tube로 옮겨서 isopropyl alcohol 400 μL와 1:1로 조심스럽게 섞어준 뒤 상온에서 5∼10분간 두었다. 앞의 과정과 동일하게 원심분리를 하고 tube의 바닥에 있는 RNA pellet을 확인한 후 상층액을 제거하였다. 70% ethanol로 RNA pellet을 washing 해주고 남은 ethanol을 날린 후 RNase free water에 RNA pellet을 녹여주었다. cDNA로의 역전사와 증폭은 TOPscript™ RT DryMIX(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 시행하였다.

(2) Real-time PCR

cDNA와 TOPreal™ qPCR 2X PreMIX(Enzynomics, Daejeon, Korea), primer를 넣고 ABI step one plus(Applied biosystem, USA) 기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 하고 analysis program을 사용하여 결과를 분석하였다. 이때 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었다. 본 실험에 사용된 시퀀스는 하기 표 1에 나타내었다.

Gene	Primer	Sequence (5'→3')
TNF-α	Forward	CCG CTG GTT GCC AAT AGT GAT G
	Reverse	CAT GCC GTT GGC CAG GAG GG
IL-1β	Forward	GCA CTA CAG GCT CCG AGA TGA A
	Reverse	GTC GTT GCT TGG TTC TCC TTG T
IL-6	Forward	CTT GGG ACT GAT GCT GGT GAC A
	Reverse	GCC TCC GAC TTG TGA AGT GGT A
Tyrosinase	Forward	GAC GGT CAC TGC AGA CTT TG
	Reverse	GCC ATG ACC AGG ATG AC
MITF	Forward	AGC GTG TAT TTT CCC CAC AG
	Reverse	TAG CTC CTT AAT GCG GTC GT
TRP-1	Forward	ACT TCA CTC AAG CCA ACT GC
	Reverse	AGC TTC CCA TCA GAT GTC GT
TRP-2	Forward	GCT CCA AGT GGC TGT AGA CC
	Reverse	AAT GCA GTG GCT TGG AAA TC
β-actin	Forward	GCA AGC AGG AGT ACG ATG AGT
	Reverse	AGG GTG TAA AAC GCA GCT CAG

<3-3> Immunofluorescence assay

각 cell line을 lab-tek chamber 8 well plate에 cell을 1×103개로 분주하여 24시간 안정시킨 뒤, 시료를 농도별로 처리한다. 24∼48시간 후 PBS 완충 용액으로 3회 세척하고 0.5% triton X-100을 10분간 처리하여 세포를 투과하였다. 다시 PBS로 세척을 하고 1% BSA를 넣어 1시간동안 blocking 과정을 진행하였다. primer antibody(MITF 1:100, NF-κB 1:50)를 1% BSA에 희석하여 4℃에서 over night 하였다. 다시 PBS 세척을 하고 alexa flour 568 goat anti-mouse IgG(1:1000)을 1% BSA에 희석시켜 차광상태에서 1시간동안 반응시켰다. 40분후 DAPI 200 μL씩 각각의 well에 추가하였다. 마지막으로 PBS 세척과정을 진행하고 chamber를 제거한 후 slide에 mounting solution을 첨가하여 cover slip으로 덮어서 고정한 상태로 관찰하였다.

<실시예 4>

갈색거저리( Tenebrio Molitor ) 추출물의 제조

갈색거저리(Tenebrio Molitor) 추출물의 제조는 에탄올, 메탄올, 물을 이용하여 각각의 추출물을 제조하였다. 상기 실시예 1에서 준비된 갈색거저리에 에탄올(각각 50%, 70%, 100%), 메탄올(각각 50%, 70%, 100%) 또는 물을 시료 중량의 10배의 양으로 첨가한 후, 실온에서 stirrer(250 rpm)를 이용하여 24시간 추출하고 상등액을 분리하였으며, 이를 3회 반복 실시하여 갈색거저리 추출물(50% 에탄올 추출물(TE50), 70% 에탄올 추출물(TE70), 100% 에탄올 추출물(TE100), 50% 메탄올 추출물(TM50), 70% 메탄올 추출물(TM70), 100% 메탄올 추출물(TM100) 및 물 추출물(TDW))을 제조하였다.

제조된 각각의 갈색거저리 추출물은 원심분리 및 여과, 농축후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 실험의 시료로 사용하였다(도 1 참조).

< 실시예 5>

갈색거저리 추출물의 항산화 효능 측정

상기 실시예 4를 통해 제조된 본 발명의 갈색거저리 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 전자공여능, ABTS 라디칼 소거활성, 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(Superoxide anion radical) 저해 활성을 측정하였다.

<5-1> DPPH에 대한 전자공여능

1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 짙은 자색을 띄는 그 자체가 안정한 free radical로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 화합물이다. 또한 glutathion, cystein과 같은 함황아미노산과 L-ascorbic acid 및 BHA 등에 의해 환원되어 탈색되므로 여러 소재에서 항산화물질을 확인하는데 많이 사용되고 있다. 이 라디컬은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며, 특히 여러가지 항산화 기작 중 proton-radical scavaenger에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있다. 반면에 indole, uric acid, flavonoid, polyphenol 등에도 민감하여 비교적 넓은 스펙트럼을 보이는 단점도 있다.

본 발명에서는 Blois[Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. 1958.]의 방법을 변형하여 전자 공여능(EDA:electron donating ability)을 측정하였다. 상기 실시예 4에서 제조된 갈색거저리 추출물(TE50, TE70, TE100, TM50, TM70, TM100 및 TDW) 각각의 시료와 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)를 1:1 비율로 혼합하여 교반한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 하기 수학식 2에 나타난 공식을 이용하여 시료의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었으며, p값이 0.01 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다(p<0.01).

그 결과, 최고 농도인 1000 μg/mL에서 갈색거저리 물 추출물(TDW)의 경우 22.5%로 나타났고 갈색거저리 100% 메탄올 추출물(TM100)은 16.5%, 갈색거저리 100% 에탄올 추출물(TE100)은 16.2%의 전자공여능을 나타내었다(도 2 참조).

<5-2> ABTS 라디칼 소거활성

2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS)는 DPPH와 비슷한 원리로 항산화 활성을 측정할 수 있는 방법으로서 실험전 potassium persulfate와 미리 하루 정도 반응시켜 청록색의 라디칼을 생성해야 한다. 시료를 첨가하면 연한 하늘색으로 변하는 것을 측정하는 방법이며 hydrogen donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다.

본 발명에서의 ABTS⁺ radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS^+· decolorization assay 방법[Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine. 1999;26(9):1231-7.]에 의하여 측정하였다. 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sul fonic acid)와 2.4 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS^+·을 형성시킨 후 ethanol로 희석하여 ABTS^+·를 제조하였고, 실시예 4에서 제조된 갈색거저리 추출물 각각의 시료 100 μL에 상기 ABTS^+· 100 μL를 더하여 1분 동안 방치한 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거율은 하기 수학식 3에 나타난 공식을 이용하여 시료의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었고, 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었으며, p값이 0.01 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다(p<0.01).

그 결과, 최고 농도인 1000 μg/mL에서 갈색거저리 물 추출물(TDW)의 경우 99.7%로 나타났고 갈색거저리 50% 메탄올 추출물(TM50)은 99.8%, 갈색거저리 70% 메탄올 추출물(TM70)은 99.5%의 소거율을 보여주었다(도 3 참조). 이는 대조군인 Butylated hydroxyl anisole(BHA)의 99.9%의 전자공여능과 유사한 수준으로 물과 50% 및 70% 메탄올 추출물의 높은 항산화능을 확인할 수 있었다.

<5-3> 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼( Superoxide anion radical ) 저해 활성

슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(Superoxide anion radical)은 호기성 세포의 효소 및 비효소적 단계에서 생성되는 독성이 매우 강한 radical로서 노화와 관련된 산화반응의 개시단계에 관여하고 있다. 또한 superoxide anion radical은 hydrogen peroxide, hydroxyl radical, singlet oxygen 등과 같은 다른 활성산소종의 생성에 관여하여 지질, 단백질, DNA 등에 산화적 손상을 유도하는 것으로 알려져 있다[Samak G, Shenoy RP, Manjunatha S, Vinayak K. Superoxide and hydroxyl radical scavenging actions of botanical extracts of wagatea spicata. Food Chem. 2009;115(2):631-4., Gulcin I, Berashvili D, Gepdiremen A. Antiradical and antioxidant activity of total anthocyanins from perilla pankinensis decne. J Ethnopharmacol. 2005;101(1):287-93.]. Superoxide anion radical은 NBT와 반응하여 청색을 띠게 되는데 시료 중에 항산화 물질이 존재하면 superoxide anion radical-NBT complex 형성을 방해하여 청색이 탈색되고[Gulcin I. Antioxidant activity of caffeic acid (3,4-dihydroxycinnamic acid). Toxicology. 2006;217(2):213-20.] 페놀성 화합물들이 superoxide anion radical을 소거한다는 보고도 있다[Joung YM, Park SJ, Lee KY, Lee JY, Suh JK, Hwang SY, Park KE, Kang MH. Antioxidant and antimicrobial activities of Lilikum species extracts prepared from different aerial parts. Korean J Food Sci Technol, 2007;39:452-457.].

Superoxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법[Stirpe F, Della Corte E. The regulation of rat liver xanthine oxidase. conversion in vitro of the enzyme activity from dehydrogenase (type D) to oxidase (type O). J Biol Chem. 1969;244(14):3855-63.]에 의해 측정하였다. 각 시료용액 0.1 mL와 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6 mL xanthine(0.4 mL)과 NBT(0.24 mM)을 녹인 기질액 1 mL를 첨가하고 xanthine oxidase(0.049 U/mL) 1 mL를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 1N HCl을 1 mL 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 흡광도 560 nm에서 측정하였다. superoxide anion radical 소거율은 하기 수학식 4에 나타난 공식을 이용하여 시료의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었고, 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었으며, p값이 0.01 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다(p<0.01).

상기 실험의 결과, 최고농도 1000 μg/mL에서 갈색거저리 물 추출물(TDW)이 62.4%, 갈색거저리 50% 메탄올 추출물(TM50)이 57.1%, 갈색거저리 70% 메탄올 추출물(TM70)이 53.5%의 소거율을 나타내어 에탄올 추출물보다 상대적으로 좋은 활성을 보였다(도 4 참조).

< 실시예 6>

갈색거저리 추출물의 미백 효과 측정

상기 실시예 4를 통해 제조된 본 발명의 갈색거저리 추출물의 미백 효과를 확인하기 위하여, 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성, melanoma cell(B16F10)에서의 tyrosinae 및 melanin 생합성 저해율, 세포내 티로시나아제(tyrosinase), MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현과 mRNA 발현 및 cAMP 발현 등을 측정하였다.

<6-1> 티로시나아제( tyrosinase ) 저해 활성

피부의 색을 결정하는데 영향을 주는 인자중의 하나인 melanin은 표피의 기저층에 존재하는 melanocyte의 melanosome에서 생합성된다. 이 melanin을 합성하기 위해서는 tyrosine이라는 아미노산의 일종인 물질에서 시작되며 tyrosine은 멜라닌 세포내의 tyrosinase에 의해 L-3,4-dihydroxylphenylalaine(DOPA), DOPA quinone으로 산화된다. DOPA quinone은 DOPA chrome, 5,6-dihydroxyindole, indole-5,6-quinone이 되고 중합반응에 의해 melanin이 생성되는 것으로 알려져 있다[Ko JS. Dermatology. Soomoonsa press. Seoul. Korea. 2000;73., Prota G. Recent advances in the chemistry of melanogenesis in mammals. J Invest Dermatol. 1980;75(1):122-7., Pavel S, Muskiet FA. Eumelanin (precursor) metabolites as markers for pigmented malignant melanoma: A preliminary report. Cancer Detect Prev. 1983;6(1-2):311-6.]. 또한 melanin은 활성 산소종(ROS, reactive oxygen species)에 의한 산화반응에 의해서도 합성되는 것으로 알려져 있다[Hachinohe M, Matsumoto H. Involvement of reactive oxygen species generated from melanin synthesis pathway in phytotoxicty of L-DOPA. J Chem Ecol. 2005;31(2):237-46.]. 활성 산소종은 체내 호흡과정 중에 생기는 산물중에 하나인데 과도하게 생성될 경우 melanin 합성 뿐만 아니라 산화적 스트레스를 유발하여 세포손상 및 기관손상을 야기시켜 암, 당뇨, 혈관계질환, 관절염 등과 같은 각종 질병을 유발한다[Wiseman H, Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: Role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochem J. 1996;313:17-29.]. 이 같은 이유로 tyrosinase의 저해활성을 확인하는 것은 중요하므로, 본 발명에서는 갈색거저리 추출물의 mushroom 유래의 tyrosinase 저해활성을 측정하였다.

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등[Yagi A, Kanbara T, Morinobu N. The effect of tyrosinase inhibition for aloe. Planta Med. 1986;3981:517-9.]의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.175 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5 mL에 10 mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2 mL및 시료용액 0.1 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase(110 U/mL) 0.2 mL을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475 nm에서 측정하였다. tyrosinase 저해활성은 하기 수학식 5에 나타난 공식을 이용하여 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었으며, p값이 0.01 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다(p<0.01).

그 결과, 최고 농도인 1000 μg/mL에서 TDW는 24.2%, TM100과 TM70은 각각 18.2%, 17.2% 수준의 활성 저해율을 나타내었다(도 5 참조).

<6-2> Melanoma cell(B16F10)에 대한 세포 독성

갈색거저리 추출물에 의한 melanoma cell의 생존율은 실시예 2에 기재된 MTT assay로 측정하였다. 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었으며, p값이 0.01 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다(p<0.01).

추출 용매별, 농도별로 측정한 결과 농도 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL에서 모두 95% 이상의 생존율을 보여 실험 구간으로 설정하였다(도 6 참조).

<6-3> Melanoma cell(B16F10)에서 티로시나아제( tyrosinase ) 저해활성

B16F10 cell을 각 culture dish에 가득 배양 한 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 각 dish에 lysis buffer(67 mM sodium phosphate buffer, 1% triton X-100, 0.1 mM phenylmethyl sulfonyfluoride)를 100 μL 첨가한 후 얼음에 방치하고 다시 세포를 수집하여 ultra sonication 하였다. 이를 1시간 동안 방치한 후 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 효소용액으로 사용하였다. 이를 67 mM phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 8.0 mM 의 L-DOPA 120 μL와 시료용액 40 μL를 96 well plate에 넣은 후, 67 mM phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 효소용액 40 μL을 첨가하여 37℃에서 30분간 배양한 후, 생성된 DOPA chrome의 양을 490nm에서 측정하였다. 이때 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었다.

상기 방법에 따라 갈색거저리 추출물에 의한 melanoma cell에서의 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성을 용매별로 확인한 결과, 농도 100 μg/mL에서 TDW>TE100>TM100>TE70>TM70>TM50>TE50 순으로 tyrosinase 저해 활성이 우수하게 나타났으며 가장 효과가 좋았던 TDW의 경우 농도의존적(97.2%, 92.5%, 83.2%, 78.2%)으로 티로시나아제 활성(tyrosinase activity)을 감소시킴을 보여주었다(도 7 참조).

<6-4> Melanoma cell(B16F10)에서 멜라닌( melanin ) 생합성 저해활성

B16F10 cell에서 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등[Hosoi J, Abe E, Suda T, Kuroki T. Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid. Cancer Res. 1985;45(4):1474-8.]의 방법에 따라 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 B16F10 cell을 100mm culture dish에 1×10 cells/dish가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 0.25 M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×10 cell 당 1 mL의 5% TCA로 처리하고, 2,500 rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 melanin을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether : ethanol (1 : 3) 1 mL를 가하여 2회 원심분리 한 후 ether 1 mL로 세척 건조시켰다. 건조된 melanin에 1 N NaOH를 1 mL 가하여 80℃에서 1시간 반응 시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Melanin 생합성 저해는 하기 수학식 6에 나타난 공식을 이용하여 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었으며, 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었다.

갈색거저리 추출물에 의한 melanoma cell에서의 melanin 생합성 저해활성을 측정하기 위하여, 농도 100 μg/mL에서 용매별로 확인한 결과 TDW>TM100>TE100>TM70>TE70>TE50>TM50 순으로 나타났으며 cellular tyrosinase와는 다르게 메탄올 추출물(TM50,70,100)이 에탄올 추출물(TE50,70,100)보다 좋은 활성을 보였고 가장 효과가 좋았던 물 추출물(TDW)의 경우 농도의존적으로 melanin 생합성을 감소시키는 데이터를 보여주었다(도 8 참조).

<6-5> Western blot을 통한 티로시나아제( tyrosinase ), MITF , TRP -1, TRP -2 발현 억제 효과

멜라닌 생성은 주로 산화적 반응에 의해서 일어나는데 TRP-1은 TRP-2에 의해 생성된 5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid(DHICA)를 oxidation 시켜 indole-2-carboxylic acid(IQCA)를 생성한다. microphthalmia-associated transcription factor(MITF)는 tyrosinase의 발현을 조절하는 인자이다. 따라서 MITF의 억제는 tysinase의 발현을 억제시키며 결과적으로 melanin 색소의 생성을 억제 할 수 있다.

갈색거저리 물추출물(TDW)이 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 발현에 미치는 영향을 보기위해 mouse melanoma cell(B16F10)에 TDW를 10, 25, 50, 100 μg/mL 의 농도로 처리한 후 48시간 뒤에 회수하여 실시예 3의 western blot을 통해 상기 단백질들의 발현을 확인하였다. House keeping gene으로는 β-actin을 사용하였다.

그 결과, TRP-1, TRP-2는 농도의존적으로 발현이 감소하는 경향을 보였으며, tyrosinase와 MITF의 경우에는 최고 농도인 100 μg/mL에서 발현율이 각각 65.5%, 92.5%로 나타났다(도 9 및 10 참조).

<6-6> Real - time PCR을 통한 티로시나아제( tyrosinase ), MITF , TRP -1, TRP -2 발현 억제 효과

갈색거저리 물추출물(TDW)에 의한 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현을 확인하기 위하여 실시예 3의 polymerase chain reaction(PCR)을 실시하여 알아보았다.

그 결과, TDW를 처리한 실험군은 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 발현을 농도의존적으로 억제하는 결과를 보였으며 특히 TRP-1과 TRP-2의 mRNA 발현을 효과적으로 저해시키는 것을 확인하였다(도 11 및 12 참조).

<6-7> 세포 내 cyclic AMP ( cAMP ) 활성

멜라닌 합성은 세포 내 여러 신호 전달 경로를 통하여 일어나는데 그 중 α-melanocyte stimulating factor(α-MSH)에 의한 멜라닌 합성 작용은 cAMP 경로를 통해 일어난다고 알려져 있다[Busca R, Ballotti R. Cyclic AMP a key messenger in the regulation of skin pigmentation. Pigment Cell Research. 2000;13(2):60-9.]. cAMP는 cAMP-dependent protein kinase A(PKA) 및 cAMP-response element binding protein(CREB) 전사인자의 활성화를 통하여 microphthalmia-associated transcription factor(MITF)의 발현을 증가시킴으로써 tyrosinase 발현을 유발하여 멜라닌의 합성을 촉진시킨다[Bentley NJ, Eisen T, Goding CR. Melanocyte-specific expression of the human tyrosinase promoter: Activation by the microphthalmia gene product and role of the initiator. Mol Cell Biol. 1994;14(12):7996-8006.].

갈색거저리 물 추출물(TDW)이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 cAMP 발현 정도를 측정하였다. 세포 내 cAMP 농도는 cAMP immunoassay kit(Cayman, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 측정하였다. 3×105개의 B16F10 cell을 0.1 M HCl에 용해하여 phosphodiesterase activity를 억제하였다. 그 후 상층액을 모아서 중성화 시키고 희석한 뒤 고정된 cAMP conjugate를 넣어 96 well plate에서 cell lysate와 면역반응을 시켰다. 초과한 conjugate와 결합하지 않은 cAMP를 세척하고, substrate solution을 넣어 결합한 효소의 활성 정도를 측정하였다. 색의 변화가 멈추면, 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었다. 색의 강도는 cell lysate 내에서 cAMP 농도와 역비례 한다.

상기 실험의 결과, TDW의 경우 최고 농도인 100 μg/mL에서 81%의 발현율을 보여 약 19%의 저해율을 확인 할 수 있었다(도 13 참조).

<6-8> Immunofluorescence 검증

B16F10 cell 내에서 MITF의 발현 정도를 알아보기 위해 상기 실시예 3의 immunofluorescence assay를 실시하였다.

농도 구간은 단일 농도로 100 μg/mL로 처리하여 측정하였다.

그 결과, TDW를 처리하지 않은 실험군에서는 처리한 실험군보다 MITF의 발현이 상대적으로 많이 일어났다는 것을 알 수 있었다(도 14 참조; a) nor b) control, α-MSH 100 nM; c): Tenebrio molitor water extract 100 μg/mL, respectively. A: blue channel (DAPI), B: green channel (FITC), C:red channel and the merge fig.).

< 실시예 7>

갈색거저리 추출물의 항염증 효능 측정

상기 실시예 4를 통해 제조된 본 발명의 갈색거저리 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, nitric oxide 저해율, prostaglandin E2(PGE2) 및 pro-inflammatory cytokine 저해율, inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2) 발현 등을 측정하였다.

<7-1> Macrophage cell(RAW 264.7)에 대한 세포 독성

갈색거저리 추출물의 추출 용매, 처리농도에 따른 macrophage cell의 세포 생존율을 실시예 2의 MTT assay를 통해 확인한 결과, 농도 10, 25, 50, 100 μg/mL에서 모두 95% 이상의 생존율을 보여 하기 nitric oxide 측정 및 western blot, real-time PCR은 상기 4개의 구간으로 설정하여 실험을 진행하였다(도 15 참조).

<7-2> Nitric oxide 저해활성

Nitric oxide(NO) 측정은 cell의 supernatant에서 NO의 양을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 Griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 2 × 106개의 cell을 confluence가 80 %일 때, PBS로 2번 washing 한 후 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 다음 lipopolysacchride(LPS) 10μg/mL을 control 군을 뺀 모든 well 에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였다. NO 생성량은 24시간 후에 supernatant를 모아 griess regent로 10분간 반응시킨 후에 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었다.

Macrophage cell인 RAW 264.7에서 갈색거저리 추출물의 nitric oxide(NO)의 억제 정도를 측정하기 위해 용매별, 농도별로 샘플을 처리하여 NO의 양을 측정한 결과, 모든 용매에서 농도의존적으로 감소하는 결과를 보였고, 최고 농도 100 μg/mL에서 TM50은 23.5%, TDW는 25.8%의 저해효과를 보였다(도 16 참조).

<7-3> prostaglandin E2( PGE2 ) 및 pro - inflammatory cytokine 저해활성

Macrophage cell인 RAW 264.7에서 갈색거저리 추출물이 prostaglandin E2(PGE2)와 pro-inflammatory cytokine의 형성을 억제하는지 확인하기 위해 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6(IL-6) 그리고 PGE2를 ELISA kit를 통해 측정하였다. 이때 분석 값들은 3회 반복 실험한 값의 mean ± S.D.로 나타내었다.

그 결과, PGE2의 경우 TDW 농도 100 μg/mL에서 36.2%의 저해율을 보였고, TNF-α는 65.3%, IL-1β는 72.3%, IL-6는 69.2%의 억제 활성을 확인하였다(도 17 및 18 참조).

<7-4> Western blot을 통한 inducible nitric oxide synthase ( iNOS ) 및 cyclooxygenase-2(COX-2) 발현 억제 효과

NO는 세포내의 NO synthase(NOS)에 의해 생성되며, NOS는 nNOS, eNOS, iNOS의 3가지 종류가 존재한다고 알려져 있다[Ma JS, Kim WJ, Kim JJ, Kim TJ, Ye SK, Song MD, et al. Gold nanoparticles attenuate LPS-induced NO production through the inhibition of NF-κB and IFN-β/STAT1 pathways in RAW264. 7 cells. Nitric Oxide. 2010;23(3):214-9.]. nNOS와 eNOS의 경우 세포내에서 항상 발현되는 효소로 이들의 작용으로 체내의 NO는 낮은 농도를 유지한다. 그러나 inducible nitric oxide synthase(iNOS)는 외부자극이 있을 때 생성되는 효소로서 체내의 NO 농도를 조절하는데 큰 영향을 준다. 또한 cyclooxygenase-2(COX-2)는 arachidonic acid를 이용하여 염증성인자 중 하나인 PG를 합성하는 효소로 PG는 염증반응에서 발열, 통증에 관련된 것으로 알려져 있다[Woo KJ, Kwon TK. Sulforaphane suppresses lipopolysaccharide-induced cyclooxygenase-2 (COX-2) expression through the modulation of multiple targets in COX-2 gene promoter. Int Immunopharmacol. 2007;7(13):1776-83., Lee AK, Sung SH, Kim YC, Kim SG. Inhibition of lipopolysaccharideinducible nitric oxide synthase, TNF-α and COX-2 expression by sauchinone effects on IκBα phosphorylation, C/EBP and AP-1 activation. Br J Pharmacol. 2003;139(1):11-20.].

따라서, 갈색거저리 추출물에 의한 NO의 저해 기전을 보기 위해 iNOS의 단백질 발현을 확인하였고, PGE2의 저해 경로를 보기 위해 COX-2의 발현을 측정하였다. iNOS 및 COX-2의 발현은 상기 실시예 3의 western blot을 통해 측정하였다.

TM50의 iNOS 발현 억제율은 100 μg/mL의 농도에서 20.3%를 나타내었고 COX-2의 발현 억제율은 42.5%로 측정되었다(도 19 참조). 반면에 동일한 농도의 TDW의 경우 iNOS 발현율이 19.7%, COX-2의 발현율은 23.2%로 TM50보다 TDW의 억제 효과가 더 우수한 것으로 나타났다(도 20 참조).

<7-5> Real - time PCR을 통한 iNOS 및 COX -2 발현 억제 효과

갈색거저리 물 추출물(TDW)에 의한 NO의 저해 기전을 보기 위해 iNOS의 발현을 확인하였고, PGE2의 저해 경로를 보기 위해 COX-2의 발현을 mRNA 수준에서 측정하였다. 상기 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현 억제 효과는 실시예3의 real-time PCR을 통하여 확인하였다.

TDW의 iNOS와 COX-2 발현 억제 효과는 농도의존적으로 감소하는 효과를 보였고 최고 농도인 100 μg/mL에서는 약 60%의 억제효과를 확인할 수 있었다(도 21 참조).

<7-6> Immunofluorescence 검증

LPS로 자극된 RAW 264.6 cell에서 NF-κB의 발현을 보기 위해 항체를 이용하여 실시예 3의 immunofluorescence assay를 실시한 결과, TDW를 100 μg/mL의 농도로 처리시 NF-κB의 발현이 control에 비해 줄어드는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 TDW가 염증 억제에 관여하고 있음을 알 수 있었다(도 22 참조; a) nor b) control, LPS 1 μg/ml; c): Tenebrio molitor water extract 100 μg/mL before the addition of LPS for 60 min, respectively. A: blue channel (DAPI), B: green channel (FITC), C:red channel and the merge fig.).

따라서 종합적으로 본 발명자들은 이러한 결과들을 토대로 본 발명의 갈색거저리 추출물, 특히 갈색거저리 물 추출물을 항산화, 미백 또는 항염활성을 갖는 화장료 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

1. 갈색거저리(Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장품 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 갈색거저리 추출물은 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol) 또는 물(water) 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장품 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 갈색거저리 추출물은 물 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장품 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 갈색거저리 추출물은 50 내지 100%농도의 메탄올을 이용하여 추출한 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장품 조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 갈색거저리 추출물은 DPPH(1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl), ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 라디칼(radical) 또는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical) 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장품 조성물.
6. 제 1항에 있어서,
   상기 갈색거저리 추출물은 티로시나아제(tyrosinase), MITF(microphthalmia-associated transcription factor), TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2) 또는 cAMP(cyclic adenosine monophosphate; cyclic AMP)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장품 조성물.
7. 제 1항에 있어서,
   상기 갈색거저리 추출물은 NO(nitric oxide), iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6 (interleukin-6), IL-1ß(interleukin-1ß) 또는 NF-κB (nuclear factor keppa B)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 염증성 질환 개선용 화장품 조성물.
   

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