KR101799426B1

KR101799426B1 - 적하수오 추출물을 함유하는 화장품 조성물

Info

Publication number: KR101799426B1
Application number: KR1020150053127A
Authority: KR
Inventors: 구창섭; 서수경; 오세량; 류형원; 김두영
Original assignee: 주식회사 콧데; 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2017-11-21
Also published as: KR20160123433A

Abstract

본 발명은 적하수오를 95% 에탄올 수용액으로 추출한 후 상기 추출물을 액체크로마토그래피 칼럼에 충진한 후 용매로는 물/메탄올[70:30→0:100 (v/v)]를 사용하여 메탄올 농도가 50%이며, 분획 시간이 66 내지 85분 사이에 분획되는 분획물을 활성성분으로 포함하여 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증, 항아토피, 상처치유 등에 매우 유용한 기능성을 가진 화장품 조성물을 제공한다.

Description

적하수오 추출물을 함유하는 화장품 조성물{Cosmetic composition containing Polygonum multiflorum extract}

본 발명은 적하수오 추출물을 함유하는 화장품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 적하수오 에탄올 추출물의 컬럼크로마토그래피 분획물 중에서 주름개선, 피부 미백, 항염, 아토피, 튼살 개선 효과가 우수한 분획물을 활성성분으로 함유하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

자외선은 피부 노화 및 주름살 형성의 주요한 원인으로 작용하고 있다. 자외선은 파장에 따라 UVA, UVB, UVC로 나눠지는데, UVB (290~320nm)는 주로 피부의 표피층까지 침투하여 멜라닌 (melanin) 합성을 자극하고, UVA(320~400nm)는 진피층까지 도달하여 활성산소의 생성을 유발하며 피부 각질세포 및 진피세포에 손상을 준다(박수남 외, 식물유래 성분의 미백화장품 (기능성 화장품)에의 응용. 서울산업대학교 논문집. 52, pp 205-220, 2001). UV 등의 외부 스트레스는 피부 각질세포로부터 α-MSH와 같은 성장 호르몬과 함께 TGF-beta, PGE2 등을 분비하는데, 이러한 사이토카인류는 멜라노사이트에 존재하는 수용체에 결합하여 세포기능을 활성화 시킨다(Tong X et al., Mol. Cell Biol., 27(1), pp 283-296, 2007). 활성화된 멜라노사이트 (melanocyte)는 멜라노좀(melanosome)에서 페놀류의 고분자 물질인 멜라닌을 합성하는데, 이러한 멜라닌은 외부 스트레스로부터 피부를 방어하는 기전의 일환으로 작용하게 된다 (Romero G.C. et al. J. Clin. Invest., 99(4), pp 635-642, 1997).

각질세포 (keratinocyte)에 의해 분비된 α-MSH에 의해 자극된 멜라노사이트로부터 생성된 멜라닌은 수상 돌기 (dendrite) 등을 통하여 다시 각질세포 등에 전해져서 스트레스에 의한 세포 상해를 억제하는 작용을 나타내게 한다 (손애량, 이승자. 한국미용학회지, 6(1), pp 239-254, 2000).

멜라닌의 합성은 멜라노사이트의 멜라노좀 내에 존재하는 티로시나아제 (tyrosinase)의 작용을 통해 이루어진다. 이 티로시나아제는 L-티로신을 산화시켜 L-도파 (L-DOPA)를 만드는 티로신 하이드록시라제 (tyrosinehydroxylase)로 작용하며, 도파를 산화시켜 도파퀴논 (DOPAquinone)을 만드는 도파 산화제 (DOPA oxidase)로 작용하여 멜라닌을 합성하는 효소이다 (山孝一良 and hearing, V. J.. メラニソ産生の制御因子, FragnanceJournal, 6, pp 24-28, 1990). 따라서 멜라닌 생성을 억제하는 피부 미백제 개발에는 타이로시나제의 활성을 억제하는 것이 필수적이다. TRP-2 (tyrosinase related protein-2)는 도파크롬 타우토머라제 (DOPAchrometautomerase)로 알려져 있는 효소로서 도파크롬 (DOPAchrome)을 이용하여 DHICA (5, 6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)를 생성한다. DHICA (5, 6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)는 TRP-1 (tyrosinaserelated protein-1)에 의해 산화되어 IQCA (indole-2 -carboxylic acid)를 생성하는데, IQCA (indole-2-carboxylic acid)는 흑갈색을 나타낸다 (Jackson I.J. et al. EMBO J., 11, 519, 1992).

한편, 멜라노사이트가 활성화되어 멜라닌 세포 생합성 (melanogenesis)가 진행될 때, 아데닐 사이클라아제 (adenylate cyclase)의 활성이 증가하여 cAMP (cyclic adenosine monophosphate) 농도가 증가한다. PKA(protein kinase A)는 cAMP-의존적 단백질 키나제 (protein kinase)로서 각종 효소의 활성을 조절하고, 세포증식에 관여하는 것으로 알려져 있다. PKA의 활성 증가는 타이로시나제의 인산화와 활성 증가를 유발하며 이러한 과정은 멜라닌 합성 증가로 이어진다 (Lee J. et al., Biochem. Pharmacol., 74(7) pp 960-968, 2007).

따라서, PKA 발현을 억제하는 경우 타이로시나제의 활성화를 방지를 통하여 멜라닌 생성을 억제하게 된다. PKC(Protein kinase C)은 여러 효소를 인산화하여 활성을 증가시키며, 세포의 증식을 자극한다. PKC의 활성이 증가하면 멜라노사이트의 기능이 증가하며, 티로시나아제의 인산화 및 활성증가를 유발한다. 따라서 PKC 발현을 억제하는 경우 티로시나아제의 활성화를 억제하여 멜라닌 생성을 억제한다. 멜라노사이트 세포 내에 존재하는 AKT(serine/threonine kinase)는 ERK (extracellular signal-regulated kinase), CREB (cyclic-AMP responseelement binding protein), RSK-1 (ribosomal S6 kinase) 등과 함께 세포 기능을 조절하는 신호전달 단백질로 유전자 발현을 조절하는 인자로 알려져 있다 (Huang SC et al., Biochem. Pharmacol., 69(2), pp 221-232,02004). ERK와 AKT (serine/threonine kinase)의 발현이 증가하면 MITF (microphthalmia transcriptionfactor)의 발현이 억제되어 티로시나아제 발현을 억제한다 (JimC. et al., J. Cell Sci., 114(Pt 12), pp 2335-2344, 2004). MITF (microphthalmia transcription factor)의 억제는 티로시나아제의 발현억제를 통하여 멜라닌색소 생성을 억제할 수 있다. 따라서 MITF의 발현 억제를 통한 색소 생성 억제 물질 개발은 유의적인 일이 될 수 있다.

이미 아스코르빈산 (일본특허공개평 4-9320호), 하이드로퀴논 (일본특허공개평 6-192062호), 코직산(일본특허공개평 56-7710호), 알부틴 (일본특허공개평 4-9315호) 및 일부의 화합물들이 티로시나아제 저해 활성이 있어 미백 화장료의 원료로 이용되고 있으나, 처방 중에서의 안정성이 떨어져 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체 레벨과 유사한 멜라노사이트 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다. 또한, 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코직산 및 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질로서, 소량 함유한 화장료를 실온에서 수 주일 동안 보관하면 갈변현상이 발생한다.

오래전부터 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과 기능을 지닌 기존 원료가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 한방제로 사용되고 있는 생약, 야채, 과일, 꽃 등의 안전성이 뛰어난 식물 추출물로부터 비정상적인 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 여러 가지 효과를 가진 추출물을 찾고자 하는 노력이 있어 왔다.

한약재를 이용한 미백 관련 연구 결과, 마황, 마황고 및 사백산의 미백 효과가 보고되었으며 (이상희, 麻黃 및 麻黃膏의 미백효과에 관한 연구, 경희대학교 동서의학대학원, 2001), 서시옥용산 등의 복합처방에 의한 미백효과도 보고되었다(손동석 외, 加減西施玉容散의 미백효과에 관한 연구, 대한안이비인후피부과학회지, 15(2), pp 104-117, 2002).

적하수오는 여러해살이 덩굴 풀로서, 덩굴 길이는 3~4m까지 서로 엉겨붙어 감기면서 자란다. 뿌리 줄기는 굳은 나무 질이며 옆으로 뻗고 끝에는 여러 가지 모양의 덩이뿌리가 생긴다. 덩이뿌리껍질과 목질부의 세로줄이 있는 줄기의 모습이 불그스름하다고 하여 적하수오라고 부른다.

적하수오의 덩이뿌리에는 옥시메틸안트라키논 유도체, 레시틴 등이 들어 있으며, 효능으로는 간, 신장, 정혈을 보하며, 힘줄과 뼈를 든든하게 하고, 신허로 인한 유정, 허리와 무릎이 나른한데, 혈과 진액이 부족하여 대변이 막히는데, 목임파절 결핵, 옹종창독, 치질, 산후병 등에 쓰인다고 알려져 있다.

적하수오 추출물과 관련된 선행기술로는 피부미백과 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2009-0120810호, 대한민국등록특허 제10-1052189호가 공지되어 있고 피부노화와 관련하여서는 대한민국 등록특허 제10-0829846호가 공지되어 있다. 또, 대한민국 등록특허 제10-0966835호에는 감초, 승마, 하수오, 흑임자, 상황버섯, 당귀, 상백피,백작약, 고삼, 황금으로 구성되된 식물 혼합 추출물이 미백 및 항주름 효과가 있다는 사실이 개시되어 있고 대한민국 등록특허 제10-1178594호에는 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 함유하는 보습 및 항산화 효과의 화장료 조성물에 대하여 개시된 바 있다.

또한, 2011년도 한국식품영양과학회지에 발표되었던 하수오와 백하수오의 에탄올 추출물에 의한 B16/F10Melanoma 세포주의 멜라닌 생성억제효과, 2008년도 대한한방부인과학회지에 발표된 적하수오의 멜라닌 생성억제와 작용기전에 관한 연구에서는 적하수오 추출물의 미백효과에 대하여 개시된 바 있고, 2002년도에 발표된 하수오의 stilbene glucoside의 라디칼 저해효과에서 적하수오 추출물의 항산화 효과에 대하여 기재된바 있다.

상기 선행 기술에는 본 발명의 화장료 조성물의 구성성분이 되는 적하수오 추출물의 분획물을 적용한 기능성 화장료 조성물에 대하여는 전혀 암시되거나 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 적하수오 추출물의 분획물이 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과 및 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, PKA, PKC, MITF 유전자의 발현 억제 효과 등을 확인하여 본 발명을 완성하게 된 것으로서 본 발명은 적하수오 추출물의 분획물을 활성성분으로 하는 화장품 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

적하수오를 95% 에탄올 수용액으로 추출한 후 상기 추출물을 액체크로마토그래피 칼럼에 충진한 후 용매로는 물/메탄올[70:30→0:100 (v/v)]를 사용하여 메탄올 농도가 50%이며, 분획 시간이 66 내지 85분 사이에 분획되는 분획물을 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 조성물에 있어서,

상기 적하수오는 건조된 적하수오 뿌리이며, 상온에서 95% 에탄올 수용액으로 추출하는 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 조성물에 있어서,

상기 물/메탄올[70:30→0:100 (v/v)] 용매의 용리 속도는 20㎖/분인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 조성물에 있어서,

상기 기능성이 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증, 항아토피, 피부 튼살 방지일 수 있다.

본 발명은 적하수오 에탄올 추출물의 분획물을 활성 성분으로 포함하여 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증, 항아토피, 상처치유 등에 매우 유용한 기능성을 가진 화장품 조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 적하수오 추출물의 분획물 수득 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 적하수오 추출물에 대한 액체컬럼크로마토그래피 분석 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 적하수오 추출물 분획 5의 상처 치유 효과에 실험 데이터 도면이다.

이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 실시예를 통하여 상세하게 설명하기로 한다.

< 실시예 1>

1. 적하수오 에탄올 추출물의 제조

적하수오 뿌리 6.6kg를 건조기 50-55℃로 음건하여 수분을 제거한 후 약 1cm의 크기로 분쇄하고, 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 60% 에탄올 수용액부터 100% 에탄올을 각각 600ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 여과 및 감압농축 후, 각 농도별 적하수오 에탄올 추출물을 수득하였다. 평균 추출량은 68.0g(추출수율 10.3%)이었다.

2. 적하수오 에탄올 추출물의 항산화 활성 평가

1) DPPH radical 소거 활성

● 실험방법

DPPH 자유 라디칼에 대한 각 시료의 환원력을 측정하기 위해 메탄올에 각 시료를 녹인 후 농도별로 희석하여 희석액을 준비한다. 농도별로 희석한 희석액 800 와 메탄올에 녹인 0.2mM DPPH 용액 200를 1.5㎖ tube에 넣고 혼합한다. 실온에서 30분간 방치한 후 517nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 활성을 비교하기 위하여 양성 대조군으로 ascorbic acid를 사용한다. DPPH 자유라디칼 소거활성을 계산한 공식은 다음과 같다.

저해율(%)= 1-(시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡광도) x 100

● 실험결과

전자공여능 측정에 사용된 DPPH는 안정한 자유라디칼로서, 만일 시료가 항산화 활성이 있다면 DPPH가 갖고 있는 지질 산화에 관여하는 자유라디칼의 비공유 결합을 소거하여 DPPH의 환원성을 높인다. 적하수오 60% 에탄올 추출물부터 100% 에탄올 추출물에 대하여 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH radical 소거 효과를 확인해 보았다. 시료 모두 31.3㎍/㎖부터 1000㎍/㎖의 농도에 따른 DPPH radical 소거 효과가 농도 의존적인 것으로 나타났고 95% 에탄올 추출물에서 가장 높은 DPPH 환원력을 가짐을 확인할 수 있었다(표 1 참조).

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	31.3	62.5	125	250	500	1000
적하수오60%EtOH	42.3±2.2	44.2±1.5	52.5±2.8	52.7±1.9	55.8±3.2	56.2±1.8
적하수오65%EtOH	42.4±2.9	45.1±2.8	52.4±1.5	53.0±1.7	56.1±2.1	57.1±1.5
적하수오70%EtOH	43.1±2.1	45.2±2.9	52.6±1.9	52.9±2.5	56.2±1.7	57.8±2.3
적하수오75%EtOH	44.3±3.5	48.9±2.7	54.1±2.7	55.4±2.9	57.8±1.4	58.9±3.2
적하수오80%EtOH	44.1±2.1	49.1±2.1	55.2±3.8	55.9±1.3	58.5±2.1	59.9±2.1
적하수오85%EtOH	45.1±2.7	50.2±3.2	57.9±2.4	58.1±2.3	60.9±3.4	61.9±1.3
적하수오90%EtOH	46.1±3.1	51.3±3.8	58.2±1.2	59.3±1.4	61.1±2.4	62.3±2.4
적하수오95%EtOH	52.3±3.2	57.9±2.7	66.0±3.8	66.8±2.9	69.8±2.1	71.9±3.2
적하수오100%EtOH	47.3±3.1	52.1±0.5	60.2±2.3	60.8±1.5	62.5±1.1	62.7±2.4

< 실시예 2>

1. 적하수오 활성분획물의 제조

상기 실시예 1의 적하수오 추출물 중에서 가장 항산화활성이 높았던 95% 에탄올 적하수오 추출물로부터 활성분획물을 분리제조하기 위해 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)를 실시하였다.

구체적으로, MPLC(Medium pressure liquid chromatography) 기기(YMC Forte/R)에 칼럼(YMC glass column 50 mm × 500 mm; Resin: YMC ODS-AQ HG, 10 ㎛)을 장착한 후 95% 에탄올 추출물을 5g의 양으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 물/메탄올[70:30→0:100 (v/v)]를 사용하고, 용리 속도는 20㎖/분이었으며, UV 254, 280, 320㎚의 파장에서 검출하였다. 분석 시간은 360분으로 하여 8개의 분획물을 얻었다(표 2 및 도 1-2 참조).

적하수오 분획물		용매조건	시간 (min)	번호 (bottle number)	무게 (mg)
Fr.1	분획물 1	30-50% MeOH	13-27	13-26	1857.8
Fr.2	분획물 2		26-34	27-33	30.0
Fr.3	분획물 3		34-49	34-49	57.8
Fr.4	분획물 4	50% MeOH	49-66	50-65	74.6
Fr.5	분획물 5	50% MeOH	66-85	66-84	56.0
Fr.6	분획물 6	50% MeOH	85-103	85-102	441.1
Fr.7	분획물 7	50% MeOH	103-120	103-120	229.0
Fr.8	분획물 8	50-100% MeOH	120-360	Washing	139.0

2. 적하수오 활성 분획물의 항산화 활성 평가

상기 실시예 1에서 동일한 방법으로 DPPH radical 소거 활성을 평가하여 본 결과 분획물 5의 경우에는 95% 에탄올 추출물에 비하여 상당한 부분 소거 활성이 증가하였으며, 더더욱 양성 대조군인 ascorbic acid 만큼이나 높은 DPPH 환원력을 가짐을 확인할 수 있었다(표 3 참조). 다른 분획물들에서는 95% 에탄올 추출물 보다도 낮은 수순의 DPPH 환원력을 보였다.

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	31.3	62.5	125	250	500	1000
적하수오95%EtOH	52.3±3.2	57.9±2.7	66.0±3.8	66.8±2.9	69.8±2.1	71.9±3.2
적하수오95%EtOH fraction 5	75.1±1.1	87.4±1.3	95.0±2.5	97.8±1.2	98.8±1.1	99.4±0.5
Positive control	Concentration (㎍/㎖)
Positive control	31.3	62.5	125	250	500	1000
ascorbic acid	68.2±0.4	69.4±3.4	71.8±0.0	72.5±0.0	73.6±1.3	72.8±0.0

< 실시예 3>

실시예 2에서 가장 높은 DPPH 환원력을 보인 분획물 5를 선정하여 하기와 같은 추가적 실험을 하여 그 결과를 나타냈다.

1. superoxide radical 소거능

● 실험방법

각 시료를 농도별로 희석하여 희석액을 준비한다. 농도별로 희석한 희석액 0.1㎖과 0.1M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 0.6㎖, 기질액인 xanthine (2 mM) 0.2㎖를 첨가하고 xanthine oxidase (0.2 U/㎖) 0.1㎖를 1.5㎖ tube에 넣고 혼합한다. 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1 N HCl 1㎖를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 292nm에서 흡광도를 측정한다.

superoxidase 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도의 감소율로 나타낸다.

● 실험결과

적하수오 95% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5에 대하여 superoxide radical 소거 효과가 있는지 확인한 결과 31.3㎍/㎖부터 1000㎍/㎖으로 처리한 농도에 따른 superoxide radical 소거능의 결과가 농도 의존적인 것으로 나타났고 양성 대조군인 ascorbic acid 만큼이나 높은 superoxide radical 소거 효과를 가짐을 확인할 수 있었다(표 4 참조).

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	31.3	62.5	125	250	500	1000
적하수오95%EtOH	39.7±1.3	39.7±2.9	38.1±3.6	45.2±1.9	61.3±2.1	67.3±3.1
적하수오95%EtOH fraction 5	55.4±0.5	69.5±0.8	78.0±2.3	85.6±1.2	92.3±1.5	96.1±1.2
Positive control	Concentration (㎍/㎖)
Positive control	31.3	62.5	125	250	500	1000
ascorbic acid	33.0±1.6	35.1±3.4	43.0±1.2	53.1±0.8	68.4±2.9	77.4±1.3

2. 항주름 효능 평가

1) Elastase 저해 활성 측정

● 실험방법

각 시험용액을 일정농도가 되도록 조제한다. 각각의 시험용액 40ul에 50mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 proporcine pancreas elastase (2.5 U/㎖) 용액 40μL을 가한 후 기질로 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (0.5 mg/㎖)을 80㎕ 첨가하여 혼합한다. 37℃에서 30분간 반응시킨 후 410nm에서 흡광도를 측정한다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

● 실험결과

인체의 중성구 과립구내에 존재하는 elastase는 동물 결합 조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 elastin을 분해시켜 피부의 진피조직의 그물망 구조 결합을 끊어줌으로써 주름생성의 주원인 효소로 알려져 있다. 이러한 elastase에 대하여 적하수오 95% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5가 저해활성을 갖는지 알아보았다. 두 개의 시료 모두 31.3㎍/㎖부터 1,000㎍/㎖의 처리 농도에 따른 elastase 저해활성 결과가 농도 의존적인 것으로 나타났고 양성 대조군인 oleanolic acid 만큼이나 높은 elastase 저해 활성을 가짐을 확인할 수 있었다(표 5 참조).

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	31.3	62.5	125	250	500	1000
적하수오95%EtOH	62.8±0.5	71.8±2.3	76.3±1.1	78.7±0.7	81.1±0.8	81.3±0.6
적하수오95%EtOH fraction 5	74.4±0.8	80.7±3.0	84.1±0.2	89.3±2.3	90.0±2.2	90.9±0.7
Positive control	Concentration (㎍/㎖)
Positive control	31.3	62.5	125	250	500	1000
oleanolic acid	32.7±0.0	41.7±0.5	46.3±1.6	57.5±2.4	61.0±2.8	70.6±0.5

3. 미백 효능 평가

1) tyrosinase 저해 활성 측정

● 실험방법

0.175M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5㎖에 기질액인 10mM L-DOPA 0.2㎖ 과 시료용액 0.1㎖을 96 well plate에 넣고 혼합한다. 혼합액에 mushroom tyrosinase (110 U/㎖) 0.2㎖을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정한다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타낸다.

● 실험결과

tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, melanosome 내에서 tyrosine을 산화시켜 DOPA를 만드는 tyrosine hydroxylase로 DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 만드는 DOPA oxidase로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요한 효소로 작용한다. 적하수오 95% 에탄올 추출물에 대한 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 125㎍/㎖부터 2000㎍/㎖의 처리한 농도에 따른 tyrosinase 저해 활성이 농도 의존적인 것으로 나타났지만 양성 대조군인 Arbutin과 비교하였을 때 낮은 수준의 tyrosinase 저해 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 그러나 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5의 경우 Arbutin 보다 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내었다(표 6 참조).

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	125	250	500	1000	2000
적하수오95%EtOH	27.1±1.2	36.5±0.3	37.4±1.1	42.5±0.5	44.6±1.1
적하수오95%EtOH fraction 5	60.1±2.5	72.4±0.8	87.3±1.2	92.5±1.7	95.8±2.3
Positive control	Concentration (㎍/㎖)
Positive control	31.3	62.5	125	250	500
Arbutin	17.5±1.0	20.3±1.5	38.7±0.6	57.6±1.2	59.7±2.5

2) 세포배양

● 실험방법

melanoma cell line인 B16F10 cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 2일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

3) melanin 생합성 저해 활성 측정

● 실험방법

DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 24 well plate에 2.0 X 10⁴ cells/well로 접종한다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양 후 시료를 농도별로 준비한다. 각각의 농도별 시료와 cell에 자극하기 위하여 자극제인 α-MSH를 200nM로 혼합하여 첨가한다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 48시간 동안 배양한 후에 배양액을 제거한 후 인산완충액(pH 7.4)으로 각 well을 세척한다. 1N NaOH를 100㎕ 씩 가하여 cell을 떼어낸 후 1.5㎖ tube에 옮겨준다. 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광광도계 405nm에서 흡광도를 측정한다. melanin 생합성 저해는 시료 용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타낸다.

● 실험결과

α-MSH 단독 처리군을 통해 α-MSH에 의해 멜라닌 합성이 유도됨을 확인할 수 있었다. 적하수오 95% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5에 대한 melanin 합성은 50㎍/㎖ 처리하였을 때 α-MSH 단독 처리군에 비교하여 각각 45.4%와 17.1%를, 25㎍/㎖ 처리하였을 때 각각 77.0%와 35.2%를 나타냄으로써 농도의존적으로 유의성 있는 결과를 확인할 수 있었고 멜라닌 합성을 효과적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 적하수오 95% 에탄올 추출물과 비교하였을 때 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5가 약 2배 정도로 멜라닌 합성을 효과적으로 억제하는 것으로 확인할 수 있었다(표 7 참조).

sample		Melanin contents (%)
α-MSH(-)		-
α-MSH(+, 200nm)		100
α-MSH(+, 200nM) + 적하수오95%EtOH	25 ㎍/㎖	77.0 ± 3.6
	50 ㎍/㎖	45.4 ± 4.3
α-MSH(+, 200nM) + 적하수오95%EtOH fraction 5	25 ㎍/㎖	35.2 ± 2.4
	50 ㎍/㎖	17.1 ± 1.5

4. 항염증 효능 평가

1) 세포배양

● 실험방법

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 2일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

2) Nitric oxide ( NO ) 생성 억제 활성 측정

● 실험방법

RAW 264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 2.0 × 10⁵cells/㎖로 24 well plate에 넣고 18시간 배양한다. 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 LPS를 1ug/㎖의 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정한다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하고 sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 사용한다.

● 실험결과

생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO₂-의 형태로 측정하였다. LPS 단독 처리군은 NO의 생성을 유도하였고, 대조군으로서 iNOS inhibitor인 2-amino- 4-methylpyridine은 NO의 생성을 약 87.5% 억제함을 확인할 수 있었다. 95% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5에 대한 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과, 50㎍/㎖ 처리하였을 때 95% 에탄올 추출물은 60.1%인 반면에 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5는 84.3%로 대조군인 2-amino- 4-methylpyridine과 거의 유사한 NO 생성 억제 효과가 있음을 알 수 있었다(표 8 참조).

Sample		NO production (%)
LPS (-)		-
LPS (+, 1 ㎍/㎖ )		100
2-amino-4-methylpyridine (A, 10 μM)		12.5 ± 3.9
LPS (1㎍/㎖) + 적하수오95%EtOH (㎍/㎖)	6.25	82.9 ± 5.4
	12.5	82.5 ± 7.4
	25	60.7 ± 1.5
	50	39.9 ± 4.3
LPS (1㎍/㎖) + 적하수오95%EtOH fraction 5(㎍/㎖)	6.25	74.9 ± 3.0
	12.5	61.3 ± 5.8
	25	36.8 ± 1.9
	50	15.7 ± 4.9

5. 항아토피 효능 평가

1) 세포배양

● 실험방법

Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell을 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic 과 10% fetal bovine serum 이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 3일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

2) 염증성 chemokines ( TARC , MDC ) 생성 억제 활성 측정

● 실험방법

HaCaT cell을 3.0 * 10⁵ cells/㎖로 24 well plate에 18시간 전 배양하고, 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 IFN-γ 와 TNF-α 를 각각 10 ng/㎖ 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한다. 이후 배양액을 1.5㎖ tube에 옮겨 원심 분리하여 얻어진 상층액의 chemonkines 합성량을 측정한다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 한다. 염증성 chemokines는 Human enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r ² 값은 0.99 이상이었다.

● 실험결과

아토피 피부염 환자에서 TARC의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. Human keratinocyte인 HaCaT cell을 이용하여 95% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5가 TARC의 발현에 영향을 미치는지 확인해 보았다. TNF-α, IFN-γ 단독 처리군을 통해 TARC의 발현이 유도됨을 확인하였고, 두 개의 시료를 25㎍/㎖, 50㎍/㎖로 처리하였을 때 TNF-α, IFN-γ 단독 처리군과 비교하여 TARC의 발현을 95% 에탄올 추출물은 각각 약 75%와 82% 억제하였으나, 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5는 100% 억제하는 것을 확인하였다. 이로 인해 95% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획에 대하여 높은 수준의 TARC 발현을 억제하며, 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5가 더욱 높은 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있었다(표 9 참조).

Sample		TARC production (%)
-		0
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖)		100
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) + 적하수오95%EtOH (㎍/㎖)	25	25.1 ± 1.3
	50	17.9 ± 2.1
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) + 적하수오95%EtOH fraction 5 (㎍/㎖)	25	0.0 ± 0.0
	50	0.0 ± 0.0

Human keratinocyte인 HaCaT cell을 이용하여 적하수오 95% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획이 아토피 피부염을 유발하는 것으로 알려진 중요 케모카인 중 하나인 MDC의 발현을 억제하는지 확인해 보았다. TNF-α와 IFN-γ를 단독 처리군을 통해 MDC의 발현이 유도됨을 확인하였고, 적하수오 95% 에탄올 추출물을 25㎍/㎖, 50㎍/㎖로 처리하였을 때 MDC의 발현을 92.7% 억제하였고 6.25, 12.5㎍/㎖에서는 각각 82.7%, 62.7%로 억제함으로써 농도의존적으로 유의성 있는 결과를 확인하였다. 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5에서는 6.25, 12.5, 25, 50㎍/㎖의 농도로 처리했을 때 모두 MDC의 발현을 100% 억제하는 것을 확인하였다. 이로써 95% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5가 높은 수준의 MDC 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5는 적하수오 95% 에탄올 추출물보다 훨씬 더 우수한 억제 효과를 보였다(표 10 참조).

Sample		MDC production (%)
-		0
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖)		100
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) + 적하수오95%EtOH (㎍/㎖)	6.25	37.3 ± 0.03
	12.5	17.3 ± 0.02
	25	7.3 ± 0.03
	50	7.3 ± 0.03
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) + 적하수오95%EtOH fraction 5 (㎍/㎖)	6.25	0 ± 0.0
	12.5	0 ± 0.0
	25	0 ± 0.0
	50	0 ± 0.0

6. 상처 치유 효과 평가(wound healing assay)

1) 세포배양

● 실험방법

Human keratinocyte인 HaCaT cell과 Human dermal fibroblast cell을 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic 과 10% fetal bovine serum 이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 3, 4일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

2) fibroblast 와 keratinocyte 이동성 평가 ( Wound healing assay )

● 실험방법

fibroblast와 keratinocyte의 이동성 평가를 위해 CytoSelect^TM 24-Well Wound Healing Assay kit (CELL BIOLABS INC. USA)를 사용하였다. 멸균된 포셉을 이용하여 wound field inserts를 24 well plate의 각 well에 잘 고정시킨다. fibroblast와 keratinocyte를 24well plate에 각각 8.0x10⁴cells/well, 3.0x10⁵cells/well로 접종한다. 이때 wound field insert가 움직이지 않도록 조심한다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 18시간 전배양 한 후 시료를 농도별로 준비한다. 멸균된 포셉을 이용하여 wound field insert를 제거한 후 배양액을 제거하고 PBS로 2번 세척한다. 준비된 시료를 각 well에 처리한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 2시간 동안 배양한 후 배양액을 제거한 다음 PBS로 세척 후 시료가 들어있지 않은 배양액으로 교체한다. 그리고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간, 48시간, 72시간 동안 시간별로 cell 상태를 확인하고, 배양을 멈춰야 하는 시간 때에 배양액을 제거한 후 cell의 잔여물이 남지 않도록 PBS로 2번 세척한다. 각 well에 cell stain solution을 250㎕ 씩 넣은 후 실온에서 15분 동안 반응시키고 다시 PBS로 3번 세척한 다음 실온에서 건조시킨다. 건조된 plate를 가지고 현미경으로 cell의 이동성 상태를 확인한다.

● 실험결과

피부는 외부환경에 대한 일차 장벽으로 개체를 보호하는 주된 역할을 담당한다. keratinocyte는 피부의 표피를 구성하는 주요 세포로서, 분열 및 분화를 통해 피부장벽을 만드는 역할을 담당한다. 피부질환은 피부 장벽이 정상적으로 만들어지지 않거나 비정상적 각질형성세포 분화가 일어나게 되므로, 이러한 경우 각질형성세포 분화를 촉진시킴으로서 정상적 피부장벽 형성에 도움을 줄 수 있다. fibroblast는 피부 내 진피 층 건조중량의 70%를 차지하는 collagen을 생성하며, 진피층을 이루는 주요 세포이다. 결손 된 피부의 진피층이 재생되기 위하여 fibroblast의 재생이 가장 중요하다. 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5가 keratinocyte와 fibroblast에 대한 상처치유에 영향을 미치는지 확인해 보기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 아무 처리 하지 않은 control군과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5를 각각 6.25 /㎖ 씩 처리한 세포군의 증식 정도를 관찰하였다. fibroblast에서는 48시간과 72시간을, keratinocyte에서는 24시간과 48시간을 배양하여 확인하였다. 그 결과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5로 처리한 세포군 모두 fibroblast와 keratinocyte에서 시간이 지날수록 negative control 보다 세포의 이동과 증식의 속도가 빠른 것으로 관찰되었다(도 3 참조).

Claims

적하수오를 95% 에탄올 수용액으로 추출한 후 상기 추출물을 액체크로마토그래피 칼럼에 충진한 후 용매로는 물/메탄올[70:30→0:100 (v/v)]를 사용하여 메탄올 농도가 50%이며, 분획 시간이 66 내지 85분 사이에 분획되는 분획물을 활성성분으로 포함하여 항산화 효과 및 피부 미백 효과가 우수한 화장품 조성물
제 1항에 있어서,
상기 적하수오는 건조된 적하수오 뿌리이며, 상온에서 95% 에탄올 수용액으로 추출하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 물/메탄올[70:30→0:100 (v/v)] 용매의 용리 속도는 20 ㎖/분인 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
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