상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍경천 추출물을 함유하는 미백 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 피부 색소 침착과 노화를 방지하는 물질을 검색하기 위하여, 여러 가지 식물 추출물들을 대상으로 연구한 결과, 홍경천 추출물이 미백작용이 우수함을 확인하고 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
홍경천은 참돌꽃(학명: Rhodiola Sachalinensis A. Bor)이라 하는데, 해발 2000 내지 5000 m 정도의 고산 지대에 서식하는 다년생 초본 식물이다. 홍경천은 일교차가 크고 건조하며, 산소가 희박하고, 자외선이 강한 고산 지대의 환경에서도 생존할 수 있는 특수한 적응성을 가지고 있어 고산 경천 또는 고산 홍경천 등의 별명으로도 불린다. 홍경천의 주요한 성분은 살리드로사이드(salidroside), 타이로솔(tyrosol), 및 배당체를 비롯하여 전분, 단백질, 지방, 당분, 플라본류 화합물, 아미노산, 무기원소, 미량의 정유 등을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 홍경천 추출물은 통상적인 추출방법에 의해 얻는다.
구체적으로는, 홍경천을 그늘에서 충분히 말린 뒤, 절단기로 세절하거나 분쇄기로 분쇄하여 추출물의 출발물질을 만든다. 상기 출발물질에 추출용매를 가하여 실온에서 유효 성분을 추출한 다음, 고형물은 여과하여 제거하고, 여액은 감압농축시킨다.
본 발명에서는 홍경천 미세분말 1 kg에 대하여 홍경천 추출용매 1 내지 15 L를 사용하는 것이 바람직하며, 추출용매로서 에탄올, 페트롤륨 에테르(petroleum ether), 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올을 차례대로 가하여 비수용성 침전물(A), 페트롤륨 에테르 추출물(B), 클로로포름 추출물(C), 에틸아세테이트 추출물(D), 부탄올 추출물(E), 및 수용성 추출물(F)을 얻을 수 있다.
상기 홍경천 추출물들은 과산화수소 유도 세포 독성, 티로시나제 활성, 멜라닌 합성 억제 기능을 나타내며, 특히 수용성 추출물은 티로시나제 활성 억제작용이 우수하다.
또한 본 발명은 홍경천 추출물을 함유하는 화장료를 제공한다.
화장료에 첨가되는 홍경천 추출물의 함유량은 각종 화장료의 0.001 내지 10 중량%이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%이다. 홍경천 추출물의 함유량이 0.001 중량% 미만이면 미백효과가 미미하고, 10 중량%를 초과하면 사용량만큼의 효과가 없다.
본 발명의 홍경천 추출물을 함유하는 미백 화장료는 유연화장수(스킨), 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 피부접착용 패취 및 피부접착용 겔 등과 같이 여러 가지 제형의 화장품으로 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 홍경천 추출물을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물에 첨가되는 홍경천 추출물은 0.001 내지 10 중량%로함유되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%이다. 홍경천 추출물의 함유량이 0.001 중량% 미만이면 미백효과가 미미하고, 10 중량%를 초과하면 사용량 만큼의 효과가 없다.
본 발명의 홍경천 추출물을 유효성분으로 하는 미백용 약제학적 조성물은 도포제의 제형으로 제조될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 홍경천 추출물 제조
홍경천을 정제수로 세척하고 건조시킨 뒤 분쇄하여 홍경천 미세분말을 수득하였다. 상기 홍경천 미세분말 1 kg을 70 % 에탄올 수용액 5 L을 추출용매로 하여 혼합하고, 실온에서 5일 동안 반응시켰다. 상기 혼합액의 침전물을 와트만 여과지로 여과하고, 여액을 65 ℃, 회전감압증발기에서 농축시켜 에탄올을 제거하였다. 상기 농축액에 증류수를 혼합하여, 비수용성 침전물(A)과 상청액을 얻었다. 이 때, 상기 비수용성 침전물은 DMSO 용액 또는 50 % 에탄올 수용액에 용해시켜, 비수용성 침전물 수용액으로 사용할 수 있다. 상기 상청액에 페트롤륨에테르를 가하여 상층과 하층으로 분리시킨 다음, 상기 상층은 페트롤륨 에테르 추출물(B)로 칭하여 수득하였다. 상기 하층은 수득한 후 클로로포름을 가하여 상층과 하층으로 분리한 다음, 상기 상층을 클로로포름 추출분획(C)으로 수득하였다. 상기 하층은 다시 에틸아세테이트을 가하여 상층과 하층으로 분리시킨 다음, 상기 상층은 에틸아세테이트 추출물(D)로 수득하였다. 상기 하층은 동일한 방법으로 부탄올을 가하여 부탄올 추출물(E)을 수득하였고, 상기 부탄올에 추출되지 않은 분액은 수용성 추출물(F)로 칭하여 수득하였다.
(실시예 2) 과산화수소 유도 세포 독성 억제효과
과산화수소는 세포 내에서 히드록실라디칼(Hydroxyl radical)을 생성하여 지질과산화를 유발함으로써 세포막의 손상과 세포독성을 일으킨다. 상기 실시예 1의 홍경천 추출물들(비수용성 침전물(A)), 페트롤륨 에테르 추출물(B), 클로로포름 추출물(C), 에틸아세테이트 추출물(D), 부탄올 추출물(E), 및 수용성 추출물(F))이 과산화수소에 의한 세포독성작용을 억제시킬 수 있는 효과를 가짐을 확인하였다. 실험은 HaCaT 세포를 이용하여 MTT 분석법으로 측정하였다. 대수증식기에 있는 HaCaT 세포를 웰(well) 당 8000개로 96웰 플레이트에 접종하여 DMEM 배지 200 ㎕에서 24 시간 동안 배양하였다. 실시예 1의 홍경천 추출물들 각각을 최종농도 50 ㎍/㎖로 배지에 첨가한 다음 4 시간 동안 반응시키고, 세포들은 PBS로 세척하였다. 과산화수소를 최종농도 1 mM로 포함하는 배지에 상기 세척된 세포들을 2 시간 동안 배양하여 산화적 스트레스를 유도하였고, 상기 세포들을 PBS로 세척하였다. 세척한 세포들은 0.5 ㎎/㎖의 MTT를 포함한 배지에서 다시 4시간 동안 배양하여 반응시켰다. 이 때, 황색의 MTT는 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 작용 하에 환원되어, 물에 용해되지 않는 자색의 포마잔(Formazan)으로 변화한다. MTT는 세포에 붙어있기 때문에, 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 200 ㎕로 상기 배양액을 용해하여, 세포를 파괴하고 MTT를 유리시켰다. 포마잔의 양은 살아있는 세포수에 정비례하므로, ELISA 판독기로 측정하였을 경우 나타나는 포마잔의 흡광도를 측정하여 세포독성을 계산할 수 있다. 또한, 과산화수소 처리를 하였으나 상기 실시예 1의 홍경천 추출물들을 첨가하지 않은 HaCaT 세포를 대조군으로 하여 상기 방법과 동일하게 실시하였다.
상기에서 용해시킨 시료들 각각을 ELISA 판독기의 540 ㎚로 흡광도를 측정한 뒤, 각 용액의 세포 독성을 하기 계산식 1로 환산하여 표 1 및 도 1에 나타내었다.
[계산식 1]
구분 |
세포독성(%) |
대조군 |
46.66 |
비수용성침전물(A) |
21.56 |
페트롤륨에테르추출물(B) |
39.2 |
클로로포름추출물(C) |
36.11 |
에틸아세테이트추출물(D) |
27.51 |
부탄올추출물(E) |
25.1 |
수용성추출물(F) |
27.19 |
도 1 및 표 1을 통하여, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물들(비수용성 침전물(A), 페트롤륨에테르 추출물(B), 클로로포름 추출물(C),에틸아세테이트 추출물(D),부탄올 추출물(E), 및 수용성 추출물(F))은 과산화수소 처리로 인한 세포독성을 대조군에 비하여 약 16 내지 53.8 % 가량 억제시킴을 확인할 수 있었다.
(실시예 3) 티로시나제 활성 억제 실험
Vanni 등(Vanni A, Gastaldi D, Giunata G et al.,Annali Di Chimica,1990; 80:35-60)의 방법에 따라 L-티로신 용액(시그마 사 제조) 40 ㎕를 96웰에 넣고, 여기에 각각 0 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도별로 홍경천 추출물(비수용성 침전물(A), 페트롤륨에탄올 추출물(B), 클로로포름 추출물(C), 에틸아세테이트 추출물(D), 부탄올 추출물(E), 및 수용성 추출물(F))을 첨가하였다. 상기 혼합 용액에 50 ㎍/㎖ 티로시나제(시그마 사 제조) 20 ㎕를 각각 첨가한 뒤, 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 상기 L-티로신 용액(시그마 사 제조)에 실시예 1의 홍경천 추출물들을 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하여 상기 방법과 동일하게 실시하였다. 상기 혼합 용액들의 흡광도를 490 ㎚에서 측정한 뒤, 각 용액의 티로시나제 활성 억제율을 하기 계산식 2로 환산하여 하기 표 2에 나타내었다.
[계산식 2]
구분 |
비수용성침전물(A) |
페트롤륨에테르추출물(B) |
클로로포름추출물(C) |
에틸아세테이트추출물(D) |
부탄올추출물(E) |
수용성추출물(F) |
50 ㎍/㎖ |
24.21 % |
1.01 % |
21.73 % |
22.66 % |
65.04 % |
77.11 % |
100 ㎍/㎖ |
55.45 % |
25.44 % |
22.35 % |
25.75 % |
70.3 % |
81.75 % |
표 2에서와 같이, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물들(비수용성 침전물(A), 페트롤륨에테르 추출물(B), 클로로포름 추출물(C), 에틸아세테이트 추출물(D), 부탄올 추출물(E), 및 수용성 추출물(F)) 중, 수용성 추출물 F는 티로시나제 활성을 최대 80 % 가량 억제함을 확인할 수 있었다.
하기 표 3은 우수한 티로시나제 활성 억제율을 나타내는 홍경천 추출물 F의 흡광도를 재측정하여, 티로시나제 활성 억제기능이 있다고 알려진 물질들과 비교한 결과를 나타낸 것이다. 티로시나제 활성 억제기능이 있다고 알려진 상기 알부틴(시그마 사), 비타젠((주)태평양), 및 녹차 추출물(일본 교토 대학)을 구입 또는 얻어 사용하였으며, 실험에 사용한 물질들의 양을 5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖으로 한 것을 제외하고는 상기 실험군과 동일한 방법으로 실시하였다.
구분 |
홍경천추출물(F) |
알부틴 |
비타젠 |
녹차 |
5 ㎍/㎖ |
16.34 % |
5.70 % |
-5.32 % |
17.87 % |
25 ㎍/㎖ |
45.04 % |
29.28 % |
-6.09 % |
24.92 % |
50 ㎍/㎖ |
65.66 % |
51.06 % |
4.68 % |
37.48 % |
100 ㎍/㎖ |
72.20 % |
65.41 % |
-7.11 % |
43.63 % |
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 홍경천 추출물 F가 알부틴, 비타젠 및 녹차에 비하여 티로시나제 억제 효과가 높음을 확인할 수 있었다.
(실시예 4) 악성 흑색종 세포(Malme-3M)에서의 멜라닌 합성 및 티로시나제 활성 억제 실험
실시예 1의 홍경천 추출물 F의 악성 흑색종 세포(Malme-3M)에 대한 미백효과를 관찰하였다. 멜라닌 합성 억제 실험을 위하여, Malme-3M를 100 ㎜ 배양접시에 접종하고, 홍경천 추출물 F를 0 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 2 일 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집하여 각각의 단백질 양을 정량한 다음, 정량한 양과 같은 양의 단백질을 1 N 수산화 나트륨 용액 1 ㎖에 넣고 100 ℃에서30 분 동안 끓여 세포를 파괴하였다. 상기 부유물의 흡광도는 ELISA 판독기를 사용하여 400 ㎚에서 측정하였다. 또한, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물들을 첨가하지 않은 Malme-3M 세포를 대조군으로 하여 상기 방법과 동일하게 실험하였다. 멜라닌 농도는 멜라닌 합성 농도(5 ㎍/㎖ ~ 300 ㎍/㎖)의 표준곡선을 사용하여 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.
상기 정량한 단백질과 같은 양의 단백질을 96웰 평판에 넣은 뒤, -80 ℃에서 30 분간 냉동하였다. 냉동된 단백질을 해동한 뒤, 10 ㎕의 10 nM L-도파(dopa)를 각 웰에 첨가하여 혼합하여 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 배양액의 흡광도는 ELISA 판독기를 사용하여 475 ㎚에서 측정하였고, 측정 결과는 대조군을 표준화하고 티로시나제 효소활성 억제율을 계산하여 표 4에 나타내었다.
구분 |
대조군 |
수용성추출물(F)100 ㎍/㎖ |
수용성추출물(F)200 ㎍/㎖ |
멜라닌 농도(%) |
100 |
95.77 |
71.88 |
티로시나제 활성 억제율(%) |
100 |
75.34 |
56.16 |
도 2 및 도 3은 각각 홍경천 추출물 F의 멜라닌 농도 및 티로시나제 활성 억제율을 나타낸다. 멜라닌 농도 및 티로시나제 활성 억제율은, 티로시나제가 티로신에 작용하여 멜라닌을 생성하는 과정에서 생성되는 색소를 띄는 중간물질들(도파크롬(dopachrome), 5,6-인디히드록시인돌-2-카르복시산(DHICA: 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid), 및 5,6-디히드록시인돌(DHI: 5,6-dihydroxyindole))의 생성량으로 비교하였다. 멜라닌이 생성되는 과정은 다음과같다. 우선, 티로시나제가 티로신에 작용하여 도파(dopa)가 형성되고(Slominski A, Moellmann G, Kuklinska E.,Pigment Cell Res1989; 2:109-116), 상기 도파에 다시 티로시나제가 산화 작용을 촉진하는 효소로 작용하여 도파퀴논(dopaquinone)이 생성되고, 도파퀴논이 싸이클로도파(cyclodopa)로 변한 다음, 싸이클로도파로 변하지 않고 남아있는 도파퀴논이 보조인자로 작용하여 도파크롬(dopachrome)을 형성한 뒤 5,6-디히드록시인돌-2-카복시산(DHICA:5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid) 및 5,6-디히드록시인돌(DHI:dihydroxyindole)을 거쳐 최종적으로 멜라닌이 만들어진다.(Acroca P, Garcia-Borron JC, Lozano JA, ,Eur J Biochem1992; 208:155-163)
각 도에 나타난 바와 같이, 홍경천 추출물 F는 대조군에 비하여 멜라닌의 농도를 최대 30 % 가량 낮추고, 티로시나제의 활성을 최대 45 % 가량 억제함을 확인할 수 있었다.
(실시예 5) 세포 독성 실험
실시예 1과 같이 제조된 각각의 홍경천 추출물로 세포의 독성을 실험하였다. 세포독성은 MTT 분석법을 이용하였다. 대수증식기의 섬유모세포를 웰 당 8000 개로 96웰 플레이트에 접종하여 200 ㎕ DMEM 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 배지에 용해되어 있는 홍경천 추출물의 최종 농도가 각각 0 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖가 되도록 하여 20 시간 반응시켰다. 상기 혼합액을 MTT 용액 0.5 ㎎/㎖를 포함한 배지에서 4 시간 배양한 뒤, 200 ㎕ 디메틸설폭사이드 용액을 웰에 넣고 용해시켜, ELISA 판독기를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를측정하였고, 각 용액의 세포 생존율을 하기 계산식 3으로 환산하였다. 하기 표 5는 홍경천 추출물을 함유하지 않는 대조군을 100 %로 표시하였을 경우의 세포증식 및 생존율을 나타낸다.
[계산식 3]
구분 |
비수용성침전물(A) |
페트롤륨에테르추출물(B) |
클로로포름추출물(C) |
에틸아세테이트추출물(D) |
부탄올추출물(E) |
수용성추출물(F) |
50 ㎍/㎖ |
115.85 % |
96.23 % |
121.41 % |
103.72 % |
120.13 % |
120.98 % |
100 ㎍/㎖ |
117.56 % |
100.88 % |
117.78 % |
102.75 % |
119.54 % |
134.88 % |
200 ㎍/㎖ |
115.32 % |
112.22 % |
81.32 % |
91.37 % |
126.17 % |
157.60 % |
400 ㎍/㎖ |
101.26 % |
41.38 % |
28.01 % |
67.68 % |
86.66 % |
159.74 % |
상기한 표 5와 같이, 특히 홍경천 추출물 중 수용성추출물(F)을 함유하는 세포는 대조군에 비하여 약 1.6 배 가량의 생존율을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 홍경천 추출물들은 미백효과, 과산화수소에 대한 보호효과가 우수하고 인체에 안전하여, 상기 추출물이 화장용 및 약제학적 조성물 등의 제조에 첨가될 수 있었으며, 특히 수용성 추출물의 미백효과가 가장 우수하였음을 확인할 수 있었다.
(실시예 6) 홍경천 추출물을 함유하는 유연화장수(스킨)의 제조
통상적인 방법에 따라, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물 F 1 중량%, 글리세롤 3 중량%, 에탄올 5 중량%, 프로필렌글리콜 2 중량%, 향 미량, 및 정제수 잔량을 혼합하여 홍경천 추출물을 함유하는 유연화장수를 제조하였다.
(실시예 7) 홍경천 추출물을 함유하는 수렴화장수의 제조
통상적인 방법에 따라, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물 E 1 중량%, 밀랍 4 중량%, 유동파라핀 4 중량%, 스쿠알렌 4 중량%, 글리세린 3 중량%, 방부제 미량, 향 미량, 및 정제수 잔량을 혼합하여 홍경천 추출물을 함유하는 수렴화장수를 제조하였다.
(실시예 8) 홍경천 추출물을 함유하는 영양크림의 제조
통상적인 방법에 따라, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물 D 0.5 중량%, 프로필렌글리콜 6 중량%, 글리세린 4 중량%, 유동파라핀 5 중량%, 스쿠알렌 3 중량%, 폴리솔베이트60 1.5 중량%, 및 정제수 잔량을 혼합하여 홍경천 추출물을 함유하는 수렴화장수를 제조하였다.
(실시예 9) 홍경천 추출물을 함유하는 마사지 크림의 제조
통상적인 방법에 따라, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물 C 0.2 중량%, 바셀린 7 중량%, 유동파라핀 10 중량%, 밀랍 2 중량%, 폴리솔베이트 2.5 중량%, 스쿠알렌 3 중량%, 글리세린 4 중량%, 프로필렌글리콜 6 중량%, 방부제 미량, 및 정제수 잔량을 혼합하여 홍경천 추출물을 함유하는 마사지 크림을 제조하였다.
(실시예 10) 홍경천 추출물을 함유하는 에센스의 제조
통상적인 방법에 따라, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물 B 2중량%, 프로필렌글리콜 2 중량%, 글리세린 4 중량%, 에탄올 7 중량%, 방부제 미량, 향 미량, 및 정제수 잔량을 혼합하여 홍경천 추출물을 함유하는 에센스를 제조하였다.
(실시예 11) 홍경천 추출물을 함유하는 팩의 제조
통상적인 방법에 따라, 상기 실시예 1의 홍경천 추출물 A 1 중량%, 프로필렌글리콜 6 중량%, 글리세린 4 중량%, 밀랍 2 중량%, 유동파라핀 30 중량%, 방부제 미량, 향 미량, 및 정제수 잔량을 혼합하여 홍경천 추출물을 함유하는 팩을 제조하였다.
(실시예 12) 홍경천 추출물을 함유하는 약제학적 조성물
본 발명의 홍경천 추출물을 함유하는 약제학적 조성물의 미백효과를 확인하기 위하여, 미백 작용을 갖는 것으로 알려진 하이드로코티존과 레티노익산을 포함하는 통상의 피부외용 연고 조성물에 홍경천 추출물을 첨가하여 피부외용 연고 조성물을 제조하였다.
하이드로코티존 1 중량%와 레티노익산 3 중량%를 포함하는 통상의 피부외용 연고 조성물을 대조군으로 하고, 여기에 상기 실시예 1의 홍경천 추출물 F 5 중량%를 첨가하여 제조한 본 발명의 홍경천 추출물을 함유하는 피부외용 연고 조성물을 자외선 조사부위에 도포하고, 검사원 10 명을 대상으로 하여 기호도를 평가(5점 척도법)하고 멜라닌지수를 측정하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
5: 아주 좋다 4: 좋다 3; 보통이다 2: 나쁘다 1: 아주 나쁘다
구 분 |
하이드로코티존 1 중량% +레티노익산 3 중량% +홍경천 추출물 F 5 중량% |
하이드로코티존 1 중량% +레티노익산 3 중량% |
미백효과 |
멜라닌지수 8 감소(평균) |
멜라닌지수 3.4 감소(평균) |
전체적인 기호도 |
4 (평균) |
3.4 (평균) |