KR102079090B1

KR102079090B1 - 적하수오 줄기 추출물을 함유하는 기능성 화장품 조성물

Info

Publication number: KR102079090B1
Application number: KR1020180093535A
Authority: KR
Inventors: 강성익; 이헌진; 홍혜정; 설주영; 나지현
Original assignee: (주)뷰애드
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2020-02-19

Abstract

본 발명은 적하수오 줄기 에탄올 추출물, 바람직하게는 95% 에탄올 수용액으로 추출한 적하수오 줄기 에탄올추출물. 더욱 바람직하게는 버드나무 잎과 구연산을 이용하여 전처리한 적하수오 줄기를 이용한 에탄올 추출물을 활성성분으로 포함하여 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증 및 항아토피 중 선택되는 어느 하나 이상에 유용성을 가진 기능성 화장품 조성물을 제공한다.

Description

적하수오 줄기 추출물을 함유하는 기능성 화장품 조성물{Cosmetic composition containing Polygonum multiflorum stem extract}

본 발명은 적하수오 줄기 추출물을 함유하는 기능성 화장품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 주름개선, 피부 미백, 항염, 아토피, 튼살 개선 효과가 우수한 활성성분이 추출되도록 적하수오 줄기를 전처리하여 제조되는 적하수오 줄기 추출물을 함유하는 기능성 화장품 조성물에 관한 것이다.

자외선은 피부 노화 및 주름살 형성의 주요한 원인으로 작용하고 있다. 자외선은 파장에 따라 UVA, UVB, UVC로 나눠지는데, UVB (290~320nm)는 주로 피부의 표피층까지 침투하여 멜라닌 (melanin) 합성을 자극하고, UVA(320~400nm)는 진피층까지 도달하여 활성산소의 생성을 유발하며 피부 각질세포 및 진피세포에 손상을 준다(박수남 외, 식물유래 성분의 미백화장품 (기능성 화장품)에의 응용. 서울산업대학교 논문집. 52, pp 205-220, 2001). UV 등의 외부 스트레스는 피부 각질세포로부터 α-MSH와 같은 성장 호르몬과 함께 TGF-beta, PGE2 등을 분비하는데, 이러한 사이토카인류는 멜라노사이트에 존재하는 수용체에 결합하여 세포기능을 활성화 시킨다(Tong X et al., Mol. Cell Biol., 27(1), pp 283-296, 2007). 활성화된 멜라노사이트 (melanocyte)는 멜라노좀(melanosome)에서 페놀류의 고분자 물질인 멜라닌을 합성하는데, 이러한 멜라닌은 외부 스트레스로부터 피부를 방어하는 기전의 일환으로 작용하게 된다 (Romero G.C. et al. J. Clin. Invest., 99(4), pp 635-642, 1997).

각질세포 (keratinocyte)에 의해 분비된 α-MSH에 의해 자극된 멜라노사이트로부터 생성된 멜라닌은 수상 돌기 (dendrite) 등을 통하여 다시 각질세포 등에 전해져서 스트레스에 의한 세포 상해를 억제하는 작용을 나타내게 한다 (손애량, 이승자. 한국미용학회지, 6(1), pp 239-254, 2000).

멜라닌의 합성은 멜라노사이트의 멜라노좀 내에 존재하는 티로시나아제 (tyrosinase)의 작용을 통해 이루어진다. 이 티로시나아제는 L-티로신을 산화시켜 L-도파 (L-DOPA)를 만드는 티로신 하이드록시라제 (tyrosinehydroxylase)로 작용하며, 도파를 산화시켜 도파퀴논 (DOPAquinone)을 만드는 도파 산화제 (DOPA oxidase)로 작용하여 멜라닌을 합성하는 효소이다 (山孝一良 and hearing, V. J.. メラニソ産生の制御因子, FragnanceJournal, 6, pp 24-28, 1990). 따라서 멜라닌 생성을 억제하는 피부 미백제 개발에는 타이로시나제의 활성을 억제하는 것이 필수적이다. TRP-2 (tyrosinase related protein-2)는 도파크롬 타우토머라제 (DOPAchrometautomerase)로 알려져 있는 효소로서 도파크롬 (DOPAchrome)을 이용하여 DHICA (5, 6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)를 생성한다. DHICA (5, 6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)는 TRP-1 (tyrosinaserelated protein-1)에 의해 산화되어 IQCA (indole-2 -carboxylic acid)를 생성하는데, IQCA (indole-2-carboxylic acid)는 흑갈색을 나타낸다 (Jackson I.J. et al. EMBO J., 11, 519, 1992).

한편, 멜라노사이트가 활성화되어 멜라닌 세포 생합성 (melanogenesis)가 진행될 때, 아데닐 사이클라아제 (adenylate cyclase)의 활성이 증가하여 cAMP (cyclic adenosine monophosphate) 농도가 증가한다. PKA(protein kinase A)는 cAMP-의존적 단백질 키나제 (protein kinase)로서 각종 효소의 활성을 조절하고, 세포증식에 관여하는 것으로 알려져 있다. PKA의 활성 증가는 타이로시나제의 인산화와 활성 증가를 유발하며 이러한 과정은 멜라닌 합성 증가로 이어진다 (Lee J. et al., Biochem. Pharmacol., 74(7) pp 960-968, 2007).

따라서, PKA 발현을 억제하는 경우 타이로시나제의 활성화를 방지를 통하여 멜라닌 생성을 억제하게 된다. PKC(Protein kinase C)은 여러 효소를 인산화하여 활성을 증가시키며, 세포의 증식을 자극한다. PKC의 활성이 증가하면 멜라노사이트의 기능이 증가하며, 티로시나아제의 인산화 및 활성증가를 유발한다. 따라서 PKC 발현을 억제하는 경우 티로시나아제의 활성화를 억제하여 멜라닌 생성을 억제한다. 멜라노사이트 세포 내에 존재하는 AKT(serine/threonine kinase)는 ERK (extracellular signal-regulated kinase), CREB (cyclic-AMP responseelement binding protein), RSK-1 (ribosomal S6 kinase) 등과 함께 세포 기능을 조절하는 신호전달 단백질로 유전자 발현을 조절하는 인자로 알려져 있다 (Huang SC et al., Biochem. Pharmacol., 69(2), pp 221-232,02004). ERK와 AKT (serine/threonine kinase)의 발현이 증가하면 MITF (microphthalmia transcriptionfactor)의 발현이 억제되어 티로시나아제 발현을 억제한다 (JimC. et al., J. Cell Sci., 114(Pt 12), pp 2335-2344, 2004). MITF (microphthalmia transcription factor)의 억제는 티로시나아제의 발현억제를 통하여 멜라닌색소 생성을 억제할 수 있다. 따라서 MITF의 발현 억제를 통한 색소 생성 억제 물질 개발은 유의적인 일이 될 수 있다.

이미 아스코르빈산 (일본특허공개평 4-9320호), 하이드로퀴논 (일본특허공개평 6-192062호), 코직산(일본특허공개평 56-7710호), 알부틴 (일본특허공개평 4-9315호) 및 일부의 화합물들이 티로시나아제 저해 활성이 있어 미백 화장료의 원료로 이용되고 있으나, 처방 중에서의 안정성이 떨어져 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체 레벨과 유사한 멜라노사이트 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다. 또한, 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코직산 및 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질로서, 소량 함유한 화장료를 실온에서 수 주일 동안 보관하면 갈변현상이 발생한다.

오래전부터 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과 기능을 지닌 기존 원료가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 한방제로 사용되고 있는 생약, 야채, 과일, 꽃 등의 안전성이 뛰어난 식물 추출물로부터 비정상적인 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 여러 가지 효과를 가진 추출물을 찾고자 하는 노력이 있어 왔다.

한약재를 이용한 미백 관련 연구 결과, 마황, 마황고 및 사백산의 미백 효과가 보고되었으며 (이상희, 麻黃 및 麻黃膏의 미백효과에 관한 연구, 경희대학교 동서의학대학원, 2001), 서시옥용산 등의 복합처방에 의한 미백효과도 보고되었다(손동석 외, 加減西施玉容散의 미백효과에 관한 연구, 대한안이비인후피부과학회지, 15(2), pp 104-117, 2002).

적하수오는 여러해살이 덩굴 풀로서, 덩굴 길이는 3~4m까지 서로 엉겨붙어 감기면서 자란다. 뿌리 줄기는 굳은 나무 질이며 옆으로 뻗고 끝에는 여러 가지 모양의 덩이뿌리가 생긴다. 덩이뿌리껍질과 목질부의 세로줄이 있는 줄기의 모습이 불그스름하다고 하여 적하수오라고 부른다.

적하수오의 덩이뿌리에는 옥시메틸안트라키논 유도체, 레시틴 등이 들어 있으며, 효능으로는 간, 신장, 정혈을 보하며, 힘줄과 뼈를 든든하게 하고, 신허로 인한 유정, 허리와 무릎이 나른한데, 혈과 진액이 부족하여 대변이 막히는데, 목임파절 결핵, 옹종창독, 치질, 산후병 등에 쓰인다고 알려져 있다.

적하수오 추출물과 관련된 선행기술로는 피부 미백과 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2009-0120810호, 대한민국등록특허 제10-1052189호가 공지되어 있고 피부노화와 관련하여서는 대한민국 등록특허 제10-0829846호가 공지되어 있다. 또, 대한민국 등록특허 제10-0966835호에는 감초, 승마, 하수오, 흑임자, 상황버섯, 당귀, 상백피,백작약, 고삼, 황금으로 구성되된 식물 혼합 추출물이 미백 및 항주름 효과가 있다는 사실이 개시되어 있고 대한민국 등록특허 제10-1178594호에는 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 함유하는 보습 및 항산화 효과의 화장료 조성물에 대하여 개시된 바 있다.

또한, 2011년도 한국식품영양과학회지에 발표되었던 하수오와 백하수오의 에탄올 추출물에 의한 B16/F10Melanoma 세포주의 멜라닌 생성억제효과, 2008년도 대한한방부인과학회지에 발표된 적하수오의 멜라닌 생성억제와 작용기전에 관한 연구에서는 적하수오 추출물의 미백효과에 대하여 개시된 바 있고, 2002년도에 발표된 하수오의 stilbene glucoside의 라디칼 저해효과에서 적하수오 추출물의 항산화 효과에 대하여 기재된바 있다.

상기 선행 기술에는 본 발명의 화장료 조성물의 구성성분이 되는 적하수오 뿌리 추출물물을 적용한 기능성 화장료 조성물에 대해서만 언급하고 있을 뿐 적하수오 줄기 추출물에 대해서는 개시된 바 없으며, 더더욱 기능성이 우수한 활성성분이 추출되도록 적하수오 줄기를 전처리하는 것에 대해서는 어떠한 언급도 암시도 없는 실정이다.

1. 대한민국 공개특허 제10-2009-0120810호 2. 대한민국 등록특허 제10-1052189호 3. 대한민국 등록특허 제10-0829846호

이에 본 발명자들은 적하수오 줄기 에탄올 추출물, 바람직하게는 전처리를 한 적하수오 줄기 에탄올 추출물이 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과 및 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, PKA, PKC, MITF 유전자의 발현 억제 효과 등을 확인하여 본 발명을 완성하게 된 것으로서 본 발명은 적하수오 줄기 에탄올 추출물을 활성성분으로 하는 기능성 화장품 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

적하수오 줄기를 에탄올 수용액으로 추출한 성분을 활성성분으로 포함하여 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증 및 항아토피로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 효능을 보이는 것을 특징으로 하는 기능성 화장품 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 기능성 화장품 조성물에 있어서, 상기 에탄올 수용액이 95중량% 에탄올 수용액인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 기능성 화장품 조성물에 있어서, 상기 적하수오 줄기는 100℃로 가열한 정제수에 정제수 동일 중량의 버드나무 잎을 넣고 3시간 동안 추출한 버드나무 열수 추출물을 상온으로 냉각시킨 후에 3시간 동안 침지시킨 것임 특징으로 한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 기능성 화장품 조성물에 있어서, 상기 적하수오 줄기는 100℃로 가열한 정제수에 정제수 동일 중량의 버드나무 잎을 넣고 3시간 동안 추출한 버드나무 열수 추출물을 상온으로 냉각시킨 후에 열수 추출물 중량 대비 1/10중량 구연산을 녹인 다음에 3시간 동안 침지시킨 것임 특징으로 한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 기능성 화장품 조성물에 있어서, 상기 적하수오 줄기는 버드나무 잎을 착즙하여 이 착즙물에 3시간 동안 침지시킨 것임 특징으로 한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 기능성 화장품 조성물에 있어서, 상기 적하수오 줄기는 버드나무 잎을 착즙하여 이 착즙물에 착즙물 중량 대비 1/10중량 구연산을 녹인 다음에 3시간 동안 침지시킨 것임 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 에탄올 수용액을 이용한 추출과 병용하여 초음파 추출이 더 수행하여 추출물을 제조하는 것이다.

본 발명은 적하수오 에탄올 줄기 추출물, 특히 적하수오 줄기에 대하여 전처리를 한 후에 에탄올로 추출한 추출물을 활성 성분으로 포함하여 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증, 항아토피 등에 매우 유용한 기능성을 가진 기능성 화장품 조성물을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 실시예를 통하여 상세하게 설명하기로 한다.

< 실시예 1: 적하수오 줄기 및 뿌리 에탄올 추출물의 비교 시험>

1. 적하수오 줄기 에탄올 추출물의 제조

적하수오 줄기 6.6kg를 건조기 50-55℃로 음건하여 수분을 제거한 후 약 1cm의 크기로 분쇄하고, 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 95중량% 에탄올을 600ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 여과 및 감압농축 후, 적하수오 줄기 에탄올 추출물을 수득하였다. 평균 추출량은 68.0g(추출수율 10.3%)이었다.

2. 적하수오 뿌리 에탄올 추출물의 제조

적하수오 뿌리 6.6kg를 건조기 50-55℃로 음건하여 수분을 제거한 후 약 1cm의 크기로 분쇄하고, 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 95중량% 에탄올을 600ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 여과 및 감압농축 후, 적하수오 뿌리 에탄올 추출물을 수득하였다. 평균 추출량은 68.2g(추출수율 10.4%)이었다.

3. DPPH radical 소거 활성

● 실험방법

DPPH 자유 라디칼에 대한 각 시료의 환원력을 측정하기 위해 메탄올에 각 시료를 녹인 후 농도별로 희석하여 희석액을 준비한다. 농도별로 희석한 희석액 800 와 메탄올에 녹인 0.2mM DPPH 용액 200를 1.5㎖ tube에 넣고 혼합한다. 실온에서 30분간 방치한 후 517nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 활성을 비교하기 위하여 양성 대조군으로 ascorbic acid를 사용한다. DPPH 자유라디칼 소거활성을 계산한 공식은 다음과 같다.

저해율(%)= 1-(시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡광도) x 100

● 실험결과

전자공여능 측정에 사용된 DPPH는 안정한 자유라디칼로서, 만일 시료가 항산화 활성이 있다면 DPPH가 갖고 있는 지질 산화에 관여하는 자유라디칼의 비공유 결합을 소거하여 DPPH의 환원성을 높이게 되므로 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH radical 소거 효과를 확인하여 그 결과를 표 1에 나타냈다.

표 1의 결과를 보면 시료 모두 31.3㎍/㎖부터 1000㎍/㎖의 농도에 따른 DPPH radical 소거 효과가 농도 의존적인 것으로 나타났으며, 적하수오 줄기 95% 에탄올 추출물에서 가장 높은 DPPH 환원력을 가짐을 확인할 수 있었다.

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	31.3	62.5	125	250	500	1000
적하수오 뿌리 95%EtOH	44.1±2.1	49.1±2.1	55.2±3.8	55.9±1.3	58.5±2.1	59.9±2.1
적하수오 줄기 95%EtOH	52.3±3.2	57.9±2.7	66.0±3.8	66.8±2.9	69.8±2.1	71.9±3.2

4. superoxide radical 소거능

● 실험방법

각 시료를 농도별로 희석하여 희석액을 준비한다. 농도별로 희석한 희석액 0.1㎖과 0.1M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 0.6㎖, 기질액인 xanthine (2 mM) 0.2㎖를 첨가하고 xanthine oxidase (0.2 U/㎖) 0.1㎖를 1.5㎖ tube에 넣고 혼합한다. 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1 N HCl 1㎖를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 292nm에서 흡광도를 측정한다.

superoxidase 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도의 감소율로 나타낸다.

● 실험결과

적하수오 95중량% 에탄올 추출물과 적하수오 95% 에탄올 추출물 분획 5에 대하여 superoxide radical 소거 효과가 있는지 확인하여 그 결과 표 2에 나타냈는데 표 2를 보면, 모든 추출물에서 31.3㎍/㎖부터 1000㎍/㎖으로 처리한 농도에 따른 superoxide radical 소거능의 결과가 농도 의존적인 것으로 나타났으며, 특히 적하수오 97중량% 에탄올 추출물에서 양성 대조군인 ascorbic acid 보다 높은 superoxide radical 소거 효과를 가짐을 확인할 수 있었으며, 뿌리 추출물의 경우에 줄기 추출물보다 상당히 낮은 소거 활성을 보였다.

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	31.3	62.5	125	250	500	1000
적하수오뿌리 95%EtOH	40.7±1.3	41.8±2.4	47.2±1.3	48.1±1.7	55.4±1.8	69.7±2.5
적하수오줄기 95%EtOH	55.4±0.5	69.5±0.8	78.0±2.3	85.6±1.2	92.3±1.5	96.1±1.2
ascorbic acid	42.0±1.6	48.2±3.4	69.8±1.2	78.1±0.8	83.4±2.9	90.4±1.3

5. 항주름 효능 평가: Elastase 저해 활성 측정

● 실험방법

각 시험용액을 일정농도가 되도록 조제한다. 각각의 시험용액 40ul에 50mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 proporcine pancreas elastase (2.5 U/㎖) 용액 40μL을 가한 후 기질로 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (0.5 mg/㎖)을 80㎕ 첨가하여 혼합한다. 37℃에서 30분간 반응시킨 후 410nm에서 흡광도를 측정한다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

● 실험결과

인체의 중성구 과립구내에 존재하는 elastase는 동물 결합 조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 elastin을 분해시켜 피부의 진피조직의 그물망 구조 결합을 끊어줌으로써 주름생성의 주원인 효소로 알려져 있다. 이러한 elastase에 대하여 적하수오 에탄올 추출물이 저해활성을 갖는지를 확인 그 결과 표 3에 나타냈다.

표 3을 보면, 시료 모두 31.3㎍/㎖부터 1,000㎍/㎖의 처리 농도에 따른 elastase 저해활성 결과가 농도 의존적인 것으로 나타났고, 특히 줄기 추출물에서 양성 대조군인 oleanolic acid 보다 높은 elastase 저해 활성을 가짐을 확인할 수 있었으며, 뿌리 추출물의 경우에 줄기 추출물보다 상당히 낮은 elastase 저해 활성을 보였다.

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	31.3	62.5	125	250	500	1000
적하수오 뿌리 95%EtOH	52.4±1.3	62.8±1.2	67.9±0.4	72.8±0.2	75.2±0.5	79.2±0.4
적하수오 줄기 95%EtOH	72.4±0.8	79.7±2.5	84.1±0.2	88.5±1.1	90.0±2.2	91.9±0.4
oleanolic acid	60.1±0.1	70.2±0.5	74.3±1.6	75.5±2.4	79.2±2.4	82.6±0.5

6. 미백 효능 평가

1) tyrosinase 저해 활성 측정

● 실험방법

0.175M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5㎖에 기질액인 10mM L-DOPA 0.2㎖ 과 시료용액 0.1㎖을 96 well plate에 넣고 혼합한다. 혼합액에 mushroom tyrosinase (110 U/㎖) 0.2㎖을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정한다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타낸다.

● 실험결과

tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, melanosome 내에서 tyrosine을 산화시켜 DOPA를 만드는 tyrosine hydroxylase로 DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 만드는 DOPA oxidase로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요한 효소로 작용하므로 tyrosinase 저해 활성을 통하여 미백효과를 알 수 있으며, tyrosinase 저해 활성을 측정하여 그 결과를 표 4에 나타냈다.

표 4의 결과를 보면, 적하수오 뿌리 에탄올 추출물에 대한 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 125㎍/㎖부터 2000㎍/㎖의 처리한 농도에 따른 tyrosinase 저해 활성이 농도 의존적인 것으로 나타났지만 양성 대조군인 Arbutin과 비교하였을 때 낮은 수준의 tyrosinase 저해 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 그러나 적하수오 줄기 에탄올 추출물은 Arbutin 보다 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내었다.

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	125	250	500	1000	2000
적하수오 뿌리 95%EtOH	29.5±2.2	37.1±1.2	40.1±1.5	47.6±0.6	55.6±2.5
적하수오 줄기 95%EtOH	60.1±2.5	72.4±0.8	87.3±1.2	92.5±1.7	95.8±2.3
Arbutin	53.2±1.0	60.3±1.5	78.7±0.6	84.6±1.2	88.7±2.5

2) melanin 생합성 저해 활성 측정

● 실험방법

melanoma cell line인 B16F10 cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 2일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 24 well plate에 2.0 X 10⁴ cells/well로 접종한다. 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양 후 시료를 농도별로 준비한다. 각각의 농도별 시료와 cell에 자극하기 위하여 자극제인 α-MSH를 200nM로 혼합하여 첨가한다. 37℃, 5% CO₂incubator에서 48시간 동안 배양한 후에 배양액을 제거한 후 인산완충액(pH 7.4)으로 각 well을 세척한다. 1N NaOH를 100㎕ 씩 가하여 cell을 떼어낸 후 1.5㎖ tube에 옮겨준다. 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광광도계 405nm에서 흡광도를 측정한다. melanin 생합성 저해는 시료 용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타낸다.

● 실험결과

melanin 생합성 저해 활성 측정 결과는 표 5에 나타냈으며, 표 5의 결과를 보면 α-MSH 단독 처리군에 비교하였을 때 모든 시료에서 유의성 있게 멜라닌 합성을 효과적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다.

다만. 적하수오 줄기 에탄올 추출물에서 뿌리 추출물과 비교하였을 때 약 2배 정도로 멜라닌 합성을 효과적으로 억제하는 것으로 확인할 수 있었다.

sample	Melanin contents (%)
α-MSH(-)	-
α-MSH(+, 200nm)	100
α-MSH(+, 200nM) + 적하수오 뿌리 95%EtOH 50 ㎍/㎖	44.5 ± 3.4
α-MSH(+, 200nM) + 적하수오 줄기 95%EtOH 50 ㎍/㎖	18.1 ± 2.5

7. 항염증 효능 평가

1) 세포배양

● 실험방법

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 2일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

2) Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정

● 실험방법

RAW 264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 2.0 × 10⁵cells/㎖로 24 well plate에 넣고 18시간 배양한다. 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 LPS를 1ug/㎖의 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양한다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정한다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하고 sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 사용한다.

● 실험결과

Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성을 측정하여 그 결과를 표 6에 나타냈으며, 표 6을 보면 LPS 단독 처리군은 NO의 생성을 유도하였고, 대조군으로서 iNOS inhibitor인 2-amino- 4-methylpyridine은 NO의 생성을 약 87.5% 억제함을 확인할 수 있었다. 95중량% 에탄올 적하수오 뿌리 추출물과 줄기 추출물에 대한 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과, 50㎍/㎖ 처리하였을 때 뿌리 추출물은 60.1%인 반면에 줄기 추출물은 대조군인 2-amino- 4-methylpyridine 보다 NO 생성 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.

Sample	NO production (%)
LPS (-)	-
LPS (+, 1 ㎍/㎖ )	100
2-amino-4-methylpyridine (A, 10 μM)	12.5 ± 3.9
LPS (1㎍/㎖) + 적하수오 뿌리 95%EtOH (㎍/㎖)	39.9 ± 4.3
LPS (1㎍/㎖) + 적하수오 줄기 95%EtOH (㎍/㎖)	11.2 ± 1.5 15.7 ± 4.9

8. 항아토피 효능 평가

1) 세포배양

● 실험방법

Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell을 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic 과 10% fetal bovine serum 이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 3일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

2) 염증성 chemokines (TARC, MDC) 생성 억제 활성 측정

● 실험방법

HaCaT cell을 3.0 * 10⁵ cells/㎖로 24 well plate에 18시간 전 배양하고, 시료를 농도별로 준비한 후 준비된 시료에 IFN-γ 와 TNF-α 를 각각 10 ng/㎖ 농도로 혼합하여 cell에 동시에 처리하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양한다. 이후 배양액을 1.5㎖ tube에 옮겨 원심 분리하여 얻어진 상층액의 chemonkines 합성량을 측정한다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 한다. 염증성 chemokines는 Human enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r ² 값은 0.99 이상이었다.

● 실험결과

아토피 피부염 환자에서 TARC의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있는데, TARC의 발현 억제에 대하여 측정 결과를 표 7에 나타냈다.

표 7을 보면, 시료를 50㎍/㎖로 처리하였을 때 TNF-α, IFN-γ 단독 처리군과 비교하여 TARC의 발현을 95중량% 에탄올 뿌리 추출물은 각각 약82% 억제하였으나, 95중량% 에탄올 줄기 추출물은 약 945 억제하는 것을 확인하였다.

따라서, 뿌리 추출물도 높은 수준의 TARC 발현을 억제하지만, 줄기 추출물에서 더 높은 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

Sample	TARC production (%)
-	0
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖)	100
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) + 적하수오뿌리 95%EtOH (㎍/㎖)	17.9 ± 2.1
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) +적하수오 줄기 95%EtOH (㎍/㎖)	5.8 ± 0.9

Human keratinocyte인 HaCaT cell을 이용하여 적하수오 95중량% 에탄올 줄뿌리 추출물과 줄기 추출물이 아토피 피부염을 유발하는 것으로 알려진 중요 케모카인 중 하나인 MDC의 발현을 억제하는지를 측정하여 그 결과를 표 8에 나타냈다.

표 8을 보면, TNF-α와 IFN-γ를 단독 처리군을 통해 MDC의 발현이 유도됨을 확인하였고, 적하수오 95중량% 에탄올 뿌리추출물을 50㎍/㎖로 처리하였을 때 MDC의 발현을 약 82% 억제하였고 ,적하수오 95중량% 에탄올 줄기 추출물에서는 MDC의 발현을 약 94% 억제하는 것을 확인하였다.

따라서, 적하수오 줄기 추출물이 뿌리 추출물보다 훨씬 더 우수한 억제 효과를 보임을 알 수 있었다.

Sample	MDC production (%)
-	0
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖)	100
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) + 적하수오 뿌리 95%EtOH (㎍/㎖)	18.2 ±0.06
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) + 적하수오 줄기 95%EtOH (㎍/㎖)	6.1 ±0.04

< 실시예 2>

1. 전처리한 적하수오 줄기 추출물의 제조

본 실시예에 따른 추출물의 제조는 상기 실시예 1에 따른 에탄올 95중량% 적하수오 줄기 추출물을 제조하기 전에 적하수오 줄기를 다음과 같이 전처리한 것을 사용하여 제조한 것에 차이가 있으며, 그 외에 방법은 동일하며 실시예 1과 동일한 수율을 기록하였다.

적하수오 줄기 6.6kg를 건조기 50-55℃로 음건하여 수분을 제거한 후 약 1cm의 크기로 분쇄하고, 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 70중량% 에탄올 수용액과 95중량% 에탄올을 각각 600ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 여과 및 감압농축 후, 각 농도별 적하수오 줄기 에탄올 추출물을 수득하였다. 평균 추출량은 68.0g(추출수율 10.3%)이었다.

전처리 방법 1: 100℃로 가열한 정제수에 정제수 동일 중량의 버드나무 잎을 넣고 3시간 동안 추출물한 버드나무 열수 추출물을 상온으로 냉각시킨 후에 적하수오 줄기 분쇄물을 3시간 동안 침지시킴.

전처리 방법 2: 버드나무 잎을 착즙하여 이 착즙물에 적하수오 줄기 분쇄물을 3시간 동안 침지시킴.

전처리 방법 3: 전처리 방법 1에서 제조한 버드나무 열수 추출물에 열수 추출물 중량 대비 1/10중량 구연산을 녹인 다음에 적하수오 줄기 분쇄물을 3시간 동안 침지시킴.

전처리 방법 4: 전처리 방법 2에서 제조한 버드나무 잎 착즙물에 착즙물 중량 대비 1/10중량 구연산을 녹인 다음에 적하수오 줄기 분쇄물을 3시간 동안 침지시킴.

2. 시험예

본 시험예는 상기 실시예 1에서 실시한 시험과 동일한 시험으로서, 다만 전처리를 한 것과 하지 않은 추출물에 대한 비교 시험이다.

하기 시험 결과를 보면 전처리하는 경우 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증 및 항아토피에서 모든 활성이 증가되었으며, 특히 구연산을 더 부가한 전처리 2 및 4에서 더욱 우수한 효과를 확인할 수 있었다.

2-1 DPPH radical 소거 활성

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	250	500
적하수오 줄기 95%EtOH	66.8±2.9	69.8±2.1
전처리 1	71.9±3.2	74.3±0.9
전처리 2	74.1±2.4	78.5±1.2
천처리 3	72.4±1.2	75.2±3.6
전처리 4	75.6±3.5	80.1±2.2

2-2. superoxide radical 소거능

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	250	500
적하수오줄기 95%EtOH	85.6±1.2	92.3±1.5
전처리 1	87.1±1.4	94.1±0.3
전처리 2	89.4±1.2	95.8±0.8
전처리 3	77.6±0.8	94.7±1.2
전처리 4	90.6±1.1	96.6±1.4

2-3. 항주름 효능 평가: Elastase 저해 활성 측정

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	250	500
적하수오 줄기 95%EtOH	88.5±1.1	90.0±2.2
전처리 1	89.1±0.8	91.5±2.3
전처리 2	89.9±2.2	92.8±1.1
전처리 3	89.1±1.3	91.9±0.5
전처리 4	89.9±1.7	94.5±1.2

2-4. 미백 효능 평가

1) tyrosinase 저해 활성 측정

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	250	500
적하수오 줄기 95%EtOH	72.4±0.8	87.3±1.2
전처리 1	83.5±0.1	89.9±0.8
전처리 2	85.1±0.7	93.7±1.5
전처리 3	84.4±0.2	90.4±0.6
전처리 4	86.2±0.5	94.8±1.8

2) melanin 생합성 저해 활성 측정

sample	Melanin contents (%)
α-MSH(-)	-
α-MSH(+, 200nm)	100
α-MSH(+, 200nM) + 적하수오 줄기 95%EtOH 50 ㎍/㎖	18.1 ± 2.5
전처리 1	16.2 ± 1.8
전처리 2	12.4 ± 2.1
전처리 3	15.9 ± 2.3
전처리 4	11.5 ± 2.2

2-5. 항염증 효능 평가

Sample	NO production (%)
LPS (-)	-
LPS (+, 1 ㎍/㎖ )	100
2-amino-4-methylpyridine (A, 10 μM)	12.5 ± 3.9
LPS (1㎍/㎖) + 적하수오 줄기 95%EtOH (㎍/㎖)	11.2 ± 1.5
전처리 1	10.4 ± 2.4
전처리 2	9.1 ± 3.1
전처리 3	10.1 ± 2.8
전처리 4	8.2 ± 1.6

2-6. 항아토피 효능 평가

Sample	TARC production (%)
-	0
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖)	100
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) +적하수오 줄기 95%EtOH (㎍/㎖)	5.8 ± 0.9
전처리 1	3.2 ± 0.1
전처리 2	1.5 ± 0.2
전처리 3	2.1 ± 0.7
전처리 4	0.8 ± 0.6

Sample	MDC production (%)
-	0
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖)	100
TNF-α (10ng/㎖) + IFN-γ (10ng/㎖) + 적하수오 줄기 95%EtOH (㎍/㎖)	6.1 ± 0.04
전처리 1	2.8 ± 0.09
전처리 2	0.5 ± 0.07
전처리 3	2.1 ± 0.05
전처리 4	0.0 ± 0.0

< 실시예 3>

1. 전처리한 적하수오 줄기 초음파 추출물의 제조

본 실시예는 실시예 2의 전처리 방법 중에서 효능이 뛰어난 전처리 4를 실시한 95중량% 에탄올 줄기 추출물에 대하여 에탄올 추출을 하면서 이와 더불어 적하수오 줄기를 넣은 95중량% 에탄올 수용액을 초음파 추출기(내추럴솔루션) 넣고 초음파의 출력을 200watt까지 올려 추출하여 초음파 추출을 병용한 것에 차이가 있다.

2. 시험예

하기 시험 결과를 보면 전처리 방법 4를 실시한 후 에탄올 만으로 추출하는 경우보다 초음파 추출물을 병용한 추출물에서 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증 및 항아토피에서 모든 활성이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

2-1 DPPH radical 소거 활성

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	250	500
전처리 4	75.6±3.5	80.1±2.2
초음파 병용	79.2±2.1	85.3±3.6

2-2. superoxide radical 소거능

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	250	500
전처리 4	90.6±1.1	96.6±1.4
초음파 병용	94.1±0.1	98.1±1.3

2-3. 항주름 효능 평가: Elastase 저해 활성 측정

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	250	500
전처리 4	89.9±1.7	94.5±1.2
초음파 병용	92.7±1.2	97.9±0.6

2-4. 미백 효능 평가

1) tyrosinase 저해 활성 측정

Sample	Concentration (㎍/㎖)
Sample	250	500
전처리 4	86.2±0.5	94.8±1.8
초음파 병용	89.3±0.2	96.4±1.6

2) melanin 생합성 저해 활성 측정

sample	Melanin contents (%)
전처리 4	11.5 ± 2.2
초음파 병용	10.1 ± 2.1

2-5. 항염증 효능 평가

Sample	NO production (%)
전처리 4	8.2 ± 1.6
초음파 병용	5.2 ± 1.1

2-6. 항아토피 효능 평가

Sample	TARC production (%)
전처리 4	0.8 ± 0.6
초음파 병용	0.0 ± 0.0

Claims

100℃로 가열한 정제수에 정제수 동일 중량의 버드나무 잎을 넣고 3시간 동안 추출한 버드나무 열수 추출물을 상온으로 냉각시킨 후에 3시간 동안 침지시킨
또는
버드나무 잎을 착즙하여 이 착즙물에 3시간 동안 침지시킨
적하수오 줄기를 95중량% 에탄올 수용액으로 추출한 성분을 활성성분으로 포함하여 피부 미백, 피부 주름 방지, 항산화, 항염증 및 항아토피로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 효능을 보이는 것을 특징으로 하는 기능성 화장품 조성물.

제 1항에서 있어서,
상기 냉각된 버드나무 열수 추출물 또는 상기 버드나무 착즙액에 중량 대비 1/10중량 구연산을 녹여 상기 적하수오 줄기를 침지시키는 것을 특징으로 하는 기능성 화장품 조성물.

제 1항에 또는 제 2항에 있어서, 상기 추출은 에탄올 수용액을 이용한 추출과 병용하여 초음파 추출이 더 수행하는 것으로 특징으로 하는 기능성 화장품 조성물.

삭제