이하 실시예에 의거 본 발명을 상세히 설명한다.
조록나무
추출물 및
용매분획물
제조와
PGG
분리
실시예
1 :
조록나무
잎의 메탄올 추출물 제조
조록나무 잎과 줄기는 제주도에 자생하는 수목으로부터 3월과 9월에 채취한 것을 사용하였다. 먼저 조록나무 잎과 줄기를 깨끗하게 수세하고 음건시켜 나온 것을 분쇄기로 분쇄하여 분말화 시켰다. 이중 조록나무 잎의 건조분말 580g을 25L 부피의 광구병(jar)에 넣고 20L의 80% 메탄올을 가하여 실온에서 한달 내지 두달간 추출하여 약 24L의 추출액을 수득한 후, 여과지(0.25mm)를 사용한 감압 여과를 2회 반복 실시하여 추출잔사를 제거하였다. 여과된 여과액을 회전감압농축기를 사용하여 추출용매를 완전히 제거한 후 물이 조금 남은 상태에서 -75℃의 초저온 냉동고에 이틀 정도 냉동시킨 후 동결건조하여 약 42.622g 의 추출물을 얻었다.
실시예
2 :
조록나무
잎의 유기용매
분배분획물
제조
상기에서 얻은 추출물(7g 씩)을 1L의 증류수에 용해시킨 후 2L 부피의 분획 깔대기에 1L의 n-헥산을 혼합하여 헥산층과 수층으로 3회 분획하였다. 상기 수층에 1L의 에틸아세테이트를 첨가하고 에틸아세테이트 층과 수층으로 3회 분획하였다. 에틸아세테이트층 분획을 감압 건조하여 용매를 제거한 뒤 동결건조하여 에틸아세테이트 분획 5.001g을 얻었다.
컬럼크로마토그래피
정제
용매분획 에틸아세테이트층에서 순수한 에틸아세테이트층을 얻기 위하여 비극성물질을 제거하기 위해 셀라이트를 충진한 컬럼(6×30cm) 상단 부위에 에틸아세테이트층을 흡착시킨 후 n-헥산과 클로로포름으로 순차적으로 용출시켜 제거시키고, 에틸아세테이트로 용출시켜 나온 용출액을 감압 농축시켜 3.905g을 얻었다.
농축물 3.905g을 1~2mL의 메탄올에 용해시켜 크기배제별 충진제(sephadex LH-20)로 충진된 컬럼(3×25cm) 상단 부위에 흡착시킨 후 메탄올만을 이용하여 용출시킨 분획층 0.12g을 수득하였다.
Prep-
HPLC
를 이용한 분리
상기에서 얻어진 0.12g을 10mL의 HPLC용 메탄올에 용해한 후 0.45μm 실린지 필터에 통과시킨 것을 안정화된 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분리하고자 하였다. 고속액체크로마토그래피는 미국 워터스사(Waters Co.) 썬파이어 컬럼(Sunfire prep,5μm, 19×150mm)을 장착한 Waters Co.(USA)모델 델타(Delta Prep)을 사용하였고, 아세토니트릴과 증류수를 10대 90의 비율로 혼합, 탈기한 이동상 용매를 10mL/분의 유속으로 흐르게 하여 분리하였다. Water's Dual λ Absorbance Detector로 물질의 자외선흡광패턴과 파장(254nm)의 흡수도를 이용하여 화합물들을 분리한 결과 5분 후반 때의 화합물 42mg을 수득할 수 있었다.
PGG 의
구조 결정
상기에서 분리된 화합물을 완전 건조하여 DMSO-d6(0.75mL)에 용해한 후 5mm NMR 튜브에 주입하고 지올 모델기종으로 FT-NMR을 이용하여 1H-NMR 및 13C-NMR을 분석하였다.
그 결과는 각각 <도 2> 및 <도 3>에 나타나 있으며, 그 화학 구조식은 화학식 1에 나타나 있다.
Compound 1
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6)
δ6.960, 6.899, 6.833, 6.802, 6.754(2H, s, each), 6.353 (1H, d, J=8Hz), 5.941(1H, t, J=10Hz), 5.426(1H, t, J=9.8Hz), 5.403(1H, t, J=9), 4.289(3H, m)
13C-NMR (400MHz, DMSO-d6)
δ165.416, 164.779, 164.577, 164.445, 163.927,145.671, 145.548, 145.499, 145.449, 145.367, 139.163, 139.139, 138.916, 138.777, 118.859, 118.069, 118.020, 117.888, 117.279, 108.994, 108.879, 108.750, 108.731, 108.719
위와 같은 데이터를 가지고 문헌(Lee & Ji, Effect of Paeonia lactiflora Extracts on a-Glucosidase, Natural Product Sciences 10(5) 223-227, 2004)과 비교한 결과 글루코사이드계열인 PGG (1,2,3,4,6- penta-O-alloyl-β-D-glucopyranose)로 동정하였다(표 1참조).
FT-NMR data of compound1 in comparison with paper
13C-NMR(δ) |
No. |
비교논문 |
compound 1 |
No. |
비교논문 |
compound 1 |
1 2 3 4 5 |
165.51 164.89 galloyl 164.67 ester 164.54 164.02 |
165.416 164.799 164.577 164.445 163.927 |
15 16 17 18 19 |
119.02 118.21 galloyl 118.05 C-1 117.95 117.48 |
118.859 118.069 118.020 117.888 117.279 |
6 7 8 9 10 |
145.67 145.55 galloyl 145.49 C-3,5 145.40 145.38 |
145.671 145.548 145.499 145.449 145.367 |
20 21 22 23 24 |
109.08 108.94 galloyl 108.80 C-2,6 108.80 108.80 |
108.994 108.879 108.750 108.731 108.719 |
11 12 13 14 |
139.59 139.08 galloyl 138.90 C-4 138.71 |
139.163 139.139 138.916 138.777 |
25 |
91.78 glucose C-1 |
91.74 |
조록나무
추출물
분획물과
PGG
의 미백 활성실험
조록나무 추출물의 미백활성을 조사하기 위하여, 상기 실시예 2에서 얻은 각 분획에 대한 tyrosinase활성 저해 효과와 멜라닌 생성억제 효과에 대한 실험을 수행하였다.
실험예
1 :
tyrosinase
저해 활성검색
용매에 녹인 시료를 적당한 농도범위로 희석한(5개 농도 범위) 시료액 20 μl를 0.1M 인산염 환충용액(pH6.5) 220μl에 넣고 mushroom tyrosinase(1500U/ml, Sigma, USA)액 20μl를 첨가한 후, 1.5mM 타이로신 용액 40μl를 섞어서 37℃, 15분 동안 반응시킨다. 그리고 475nm에서 흡광도를 측정하여 배양 전의 흡광도의 차이로 억제되는 정도를 측정하였다. 활성저해를 계산하는 식은 다음과 같다.
Tyrosinase inhibition (%) = [(D-C)-(B-A)]/(D-C) × 100
A와 B는 각각 시료를 가지는 용액의 배양 전과 후의 흡광도
C와 D는 각각 시료를 넣지 않은 용액(기준용액)의 배양 전과 후의 흡광도
여러 농도에서 저해 정도를 측정한 후에 Inhibition Concentration at 50% of Activity (IC50) 값을 계산하였다.
Tyrosinase 활성저해 실험
sample 100μg/ml |
Tyrosinase 억제효과 (%) |
IC50, μg/ml |
조록나무 잎 |
Crude |
55.5 |
95.2 |
Hexane |
19.0 |
- |
EtOAc |
53.1 |
115.6 |
BuOH |
17.4 |
- |
H2O |
36.0 |
- |
조록나무 줄기 |
Crude |
40.8 |
113.3 |
Hexane |
19.0 |
- |
EtOAc |
85.5 |
28.3 |
BuOH |
37.9 |
- |
H2O |
11.7 |
- |
arbutin |
50.4 |
112.1 |
상기 표 2에 나타난 바와 같이 조록나무 추출물은 조추출물인 상태서도 50㎍/mL의 농도에서는 우수한 tyrosinase 억제 활성이 있고, 특히 에틸아세테이트 추출분획은 현재 미백제로 쓰이는 arbutin과 유사하거나 우수한 tyrosinase 억제 효과를 보인다.
도 1에 의한 조록나무 잎 에틸아세테이트층 분획의 Tyrosinase 활성저해 효과
조록나무 잎 EtOAc층의 분획 100 μg/mL |
Tyrosinase 억제효과 (%) |
IC50, μg/mL |
F1 |
-23.9 |
- |
F2 |
17.1 |
- |
F3 |
16.8 |
- |
F4 |
57.5 |
- |
F5 |
66.6 |
- |
F6 |
80.1 |
12.0 |
F7 |
76.4 |
29.3 |
F8 |
71.5 |
34.4 |
F9 |
92.2 |
15.4 |
F10 |
92.0 |
3.0 |
F11 |
93.0 |
15.9 |
PGG |
92.9 |
53.4 |
arbutin |
50.4 |
112.1 |
상기 표 3에서 조록나무 잎의 에틸아세테이트 분획층들의 tyrosinase 억제 활성을 조사한 결과 F10에서 탁월한 억제 효과를 보이고 있었고, F6~11 까지 모두 대조군인 알부틴 보다 낮은 농도에서도 우수한 억제 효과를 나타내었다. 또한 100 ㎍/mL에서 F4, F5도 알부틴보다 좋은 tyrosinase억제 효과를 보였고, 분리한 PGG인 경우도 알부틴보다 우수한 효소 억제 효과를 나타내고 있음을 확인하였다.
실험예
2 : 멜라닌생성 억제 실험
melan-a cell은 non-tumorigenic mouse melanocyte cell line으로써 정상 mouse melanocyte의 성질을 대부분 가지고 있으면서도 immortalization 되어 실험에 용이하게 사용할 수 있다. 이 세포를 이용하여 최종 생성되는 멜라닌 생성 억제 정도를 측정하였다. Melan-a cells을 RPMI 배지(Gibco, USA)를 이용하여 24 well plate에 1×105 cells/mL로 plating 한 후, 시료를 처리하여 37℃ 10% CO2 항온기에서 3일간 배양하였다. Plate의 배지 제거 후 세포를 수확하여 1N NaOH를 첨가하여 세포를 완전히 녹인 후 450 nm에서 multiwell microplate reader로 측정하여 대조군과 비교하였다. 합성 멜라닌을 이용하여 standard soultion을 만들고 sample과 standard soultion을 96 well plate에 넣고 흡광도를 측정한다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌으로 작성된 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다.
세포의 Viability 측정(
MTT
assay)
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole (MTT) 정량은 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다. 멜라닌 양 측정 시 plate를 duplicate로 하여 똑같은 방법으로 시료를 처리하여 배양 후 MTT시약을 처리 하여 형성된 formazan을 DMSO롤 녹인 후 540nm에서 ELISA Reader로 측정하여 대조군과 비교하였다.
조록나무의 조추출물 및 분획층들의 멜라닌 생성억제효과
sample at 50 μg/mL |
Inhibition of melanin content (%) |
MTT(%) |
조록나무 잎 |
Crude |
26.5 ± 0.9 |
7.6 ± 1.7 |
Hexane |
40.2 ± 18.0 |
79.0 ± 5.2 |
EtOAc |
59.4 ± 4.3 |
35.0 ± 1.8 |
BuOH |
9.7 ± 0.5 |
-3.4 ± 0.5 |
H2O |
11.3 ± 2.8 |
6.8 ± 1.3 |
조록나무 줄기 |
Crude |
-50.5 ± 0 |
-14.5 ± 0 |
Hexane |
57.0 ± 0.1 |
17.7 ± 0.7 |
EtOAc |
74.2 ± 0 |
26.0 ± 0.1 |
BuOH |
-7.3 ± 2.1 |
3.3 ± 2.3 |
H2O |
17.1 ± 3.7 |
4.0 ± 3.3 |
arbutin |
37.9 ± 8.9 |
-9.8 ± 0.9 |
상기 표 4에서 조록나무의 에틸아세테이트 층에서 가장 좋은 멜라닌 생성 억제 효과를 확인 할 수 있었다.
도 1에 의한 조록나무 잎 EtOAc층의 분획의 멜라닌 생성 저해효과
조록나무 잎 EtOAc층의 분획 at 50 μg/mL |
Inhibition of melanin content (%) |
MTT (%) |
F1 |
26.6 ± 8.8 |
14.0 ± 4.5 |
F2 |
31.8 ± 2.4 |
13.9 ± 3.4 |
F3 |
65.9 ± 5.7 |
33.8 ± 2.7 |
F4 |
41.1 ± 4.4 |
22.7 ± 2.7 |
F5 |
52.0 ± 2.4 |
30.0 ± 6.1 |
F6 |
31.5 ± 4.1 |
22.5 ± 2.5 |
F7 |
61.2 ± 2.4 |
24.6 ± 3.7 |
F8 |
63.7 ± 2.4 |
50.9 ± 5.7 |
F9 |
18.0 ± 4.7 |
0.1 ± 1.5 |
F10 |
50.5 ± 6.5 |
32.6 ± 3.9 |
F11 |
52.1 ± 5.0 |
30.8 ± 2.2 |
arbutin |
30.4 ± 6.6 |
-3.9 ± 3.8 |
상기 표 5와 같이 조록나무 잎 EtOAc층의 분획의 분리층 중에서 멜라닌생성 억제 효과는 F1, F9외에는 대조군인 arbutin보다 활성이 좋음을 보여주었으나 처리농도에서 세포생존율이 비교적 낮게 측정되었다. 그러나 F9는 활성은 작으나 세포 생존율이 좋아 이로부터 PGG를 얻을 수 있었다.
PGG의 멜라닌 생성 억제효과
sample (μg/ml) |
inhibition of melanin content (%) |
MTT (%) |
PGG (20) |
73.4 ± 1.3 |
11.5 ± 2.6 |
PGG (10) |
58.5 ± 1.7 |
-1.3 ± 4.8 |
PGG (5) |
20.5 ± 2.2 |
-3.2 ± 2.1 |
arbutin (50) |
48.9 ± 1.9 |
7.0 ± 6.2 |
arbutin (10) |
22.1 ± 4.0 |
2.4 ± 2.7 |
arbutin (5) |
11.7 ± 2.1 |
7.1 ± 5.6 |
상기 표 6에서와 같이 에틸아세테이트 분획의 F9에서 분리한 compound인 PGG의 멜라닌 생성 억제 효과는 알부틴에 비해 독성이 없는 수준에서도 우수하게 나타남을 확인할 수 있었다.
실험예
3 : RT-
PCR
실험
Melan-a cells을 RPMI1640(Gibco, USA) 배지를 이용하여 60mm plate에 4.5×105 cells/well로 plating 한 후, 시료를 처리하여 37℃ 10% CO2 항온기에서 하루 동안 배양하였다. 24시간 후 시료가 담겨 있는 새배지로 교환하여 3일간 매일 처리 한 후 Plate의 배지를 제거하고 Tri-zol solution (Invitrogen, USA) 을 이용하여 RNA를 추출하였다. 1μL의 total RNA를 oligo (dT)18 primer, dNTP (0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor, M-MuLV reverse transcriptase (2U)로 70℃ 5min, 4℃ 5min, 37℃ 60min, 그리고 70℃에서 10min heating시켜 cDNA를 합성하였다. Polymerase chain reaction (PCR)은 합성된 cDNA로부터 primer들을 증폭시키기 위하여 2μL cDNA, 10×buffer (10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 1unit Taq polymerase(Promega, USA)를 증류수로 전체를 25μL로 맞춘 후 94℃에서 45s간 denaturation, 55~60℃에서 45s간 annealing, 72℃에서 90s간 extension을 25~30 cycles 수행하여 amplification 하였다. 사용된 primer는 다음 표 7과 같다.
연번 |
유전자명 |
DNA 염기 서열(5′-3′) |
1 |
Actin |
R : TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C F : TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G |
2 |
Tyrosinase |
R : GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT F : TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC |
3 |
TRP-1 |
R : GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC F : AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT |
4 |
TRP-2 |
R : GTT GCT CTG CGG TTA GGA AG F : TGT GCA AGA TTG CCT GTC TC |
5 |
Mc1r |
R : CCA GGA AGC AGA GAC TGG AC F : ACT CCA ATG CCA CCT CTC AC |
6 |
MSH |
R : GAC CTG CTC CAA GCC TAA TG F : GCT TGC AAA CTC GAC CTC TC |
R : reverse F : froward |
도 4에서 보는 바와 같이 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 세포 독성이 없는 PGG 10 μg/mL에서의 mRNA의 발현 억제 효과는 TRP-1, Mc1r, MSH의 mRNA 발현을 억제 시키고 있음을 확인할 수 있었다.
조록나무
추출물 분획과
PGG
의 피부주름생성억제효과실험
조록나무 추출물과 PGG의 피부주름생성억제활성을 조사하기 위하여 상기 실시예 2에서 얻은 각 분획의 피부주름생성억제활성을 elsatase 억제 효과 및 MMP-1 합성 억제 효과 측정을 통해 조사하였다.
실험예
4 :
엘라스타제
저해 실험
Elastase의 억제 효과는 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
완충액은 0.2M Tris액을 pH 8.0이 되도록 염산(HCl)액으로 조정한 완충액을 사용하였으며, 기질액은 엘라스타제 기질 Succ-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide 표준품을 8.8mM로 제조한 것을 사용하였고, 효소액으로는 돼지 췌장 엘라스타제 (Porcine Pancreatic Elastase) 표준품을 10 ㎍/mL가 되도록 제조한 것을 사용하였다.
엘라스타제 활성을 측정하기 위하여, 완충액 60 μL에 기질액 20 μL, 시료 100 μL를 넣어 섞고, 효소액 20 μL를 넣어 흔들어 섞어 25 ℃에서 15분간 반응시키고, p-니트로아닐린 (p-nitroaniline)의 생성량을 파장 410 nm에서 흡광도(B)를 측정하였다. 또한, 완충액 60 μL에 기질액 20 μL, 정제수 20 μL, 시료 100 μL를 넣어 위와 같은 방법으로 조작하여 얻은 용액을 대조액으로 하여 흡광도(C)를 측정하였다. 따로 시료 대신 정제수 100 μL를 가지고 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 공시험액으로 하여 그 흡광도(A)를 측정하였으며, 효소액 및 검액 대신 정제수 120 μL를 넣어 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 색보정액으로 하여 그 흡광도(D)를 측정하고 엘라스타제 억제율(%)을 구하였다.
Elastase inhibition (%) = [1- {(B-C) / (A-D)}] × 100
엘라스타제 저해활성 IC50은 엘라스타제의 활성을 50% 저해하는데 요구되는 시료의 농도(μg/mL)를 표시하였다.
조록나무 용매분획물들의 엘라스타제 활성 억제효과
sample (100 μg/mL) |
엘라스타제 억제효과 (%) |
IC50, μg/mL |
조록나무 잎 |
Crude |
87.9 |
5.5 |
Hexan |
-3.7 |
- |
EtOAC |
34.4 |
- |
BuOH |
42.0 |
- |
H2O |
-27.2 |
- |
조록나무 줄기 |
Crude |
80.9 |
21.0 |
Hexan |
64.6 |
74.8 |
EtOAC |
64.8 |
53.8 |
BuOH |
79.7 |
17.8 |
H2O |
83.7 |
18.3 |
빈랑자 |
67.2 |
30.7 |
상기 표 8에서 나타난 바와 같이 조록나무 잎 조추출물에서 탁월한 엘라스타제 활성 억제 효과가 나타났으며, 잎의 분획층에서는 오히려 활성이 떨어진 것으로 판단해 볼 때 유효성분들의 시너지 효과에 의해 조추출물에서 우수한 효소억제 활성을 보이고 있음을 알 수 있었다. 줄기에서는 비교적 극성이 높은 부탄올과 물층에서 좋은 효과를 보였고, 조추출물에서도 대조군으로 사용된 빈랑자 추출물보다 우수한 효과를 보였다.
도 1에 의한 조록나무 잎 EtOAc층 분획들의 엘라스타제 활성억제 효과
조록나무 잎 EtOAc층의 분획 (100μg/mL) |
엘라스타제 억제효과 (%) |
IC50, μg/mL |
F1 |
-23.0 |
- |
F2 |
-19.1 |
- |
F3 |
14.9 |
- |
F4 |
59.2 |
77.6 |
F5 |
90.5 |
30.5 |
F6 |
94.7 |
14.0 |
F7 |
91.1 |
14.3 |
F8 |
88.5 |
38.1 |
F9 |
72.4 |
68.7 |
F10 |
46.1 |
- |
F11 |
48.1 |
- |
PGG |
95.5 |
12.1 |
빈랑자 |
70.0 |
21.2 |
상기 표 9에서 에틸아세테이트의 분획들 중 F6, F7에서 탁월한 elastase 억제효과를 확인하였고, 분리한 compound인 PGG인 경우 가장 우수한 효소억제 효과를 나타내었다.
실험예
5 : 진피세포의
MMP
-1 합성 억제 실험
MMP-1 억제활성능의 측정은 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)방법에 근거하여 조건을 검토한 후 다음과 같은 assay계를 확립한 후 측정하였다. 진피세포인 HS68(normal human skin fibroblast) cell line을 6×104 cells/well 농도로 12 well-plate에 배양, 약 80% 찼을 때 도달할 때 원배지를 제거한 후, Phosphate buffered saline (PBS)로 세척하여 배지내 serum 성분을 제거시킨 다음 serum free DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)과 시료를 0.1 mg/ml이 되도록 함께 첨가하여 37℃, 5% CO2, 95% humid air condition에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응 후 소량의 PBS(Phosphate buffered saline)를 첨가하여 cell이 잠긴 상태에서 UVB를 조사하였으며 (35 mJ/cm2) 대조구는 UV를 조사시키지 않고 형광등 아래에서 동일한 시간을 방치시킨 다음 serum free DMEM을 첨가하여 48시간 배양한 후 상등액을 취하여 MMP-1의 농도를 ELISA 방법을 사용하여 다음과 같이 측정하였다. 즉, immuno-well plate에 glutaraldehyde를 100 ㎕ (10 ㎕ /ml D.W.)씩 well에 분주하여 37℃, 1시간 반응시킨 후 증류수로 well- plate를 세척하고 물기를 제거하였다. 상기의 배양 상등액을 100 ㎕ 분주하고 37℃, 1시간 반응시킨 후 MMP-1 antibody (mouse)를 1 : 1,000으로 washing solution (0.5% Tween 20 in PBS)에 희석하여 100 ㎕ 씩 분주하고 37℃, 1시간 반응시켰다. Anti-mouse IgG peroxidase conjugated를 1 : 30,000으로 washing solution에 희석하여 37℃, 1시간 반응시킨 후 기질[TMB (Tetramethylbenzidine)10 mg/mL DMSO, 3% H2O2, 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.1)]을 well당 200 ㎕ 씩 넣어 15 분간 빛을 차단하여 반응시켰다. 1 M H2SO4 50 ㎕를 첨가하여 반응을 완전히 중지시킨 후 micro plate reader (Model 550, BIO-RAD Laboratories, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료에 의한 MMP-1 억제활성은 아래 식에 따라 환산하였다.
Inhibitory activity of MMP-1 secretion (%) = [1-(As-Ab)/(As-Ab)]×100
Ac : 형광등 조사 대조구 medium의 흡광도
Ab : UVB를 조사하고 sample 처리하지 않은 medium의 흡광도
As : UVB를 조사하고 sample 처리한 medium의 흡광도
MMP
-1 활성 억제 측정
Assay buffer(K1173)로 inhibitor를 1/200, 기질(P125-9090)을 assay buffer를 사용하여 1/25, MMP-1 enzyme을 assay buffer를 사용하여 1/40로 희석해 37℃를 유지 하여 반응시켰다. Assay buffer를 well plate에 blank 90㎕, control 70㎕, inhibitor N-Isobutyl-N-(4-methoxyphenylsulfonyl)-glycyl hydroxamic acid (NNGH) 50㎕를 각각 넣고, 희석된 MMP-1(15.3U)을 control, inhibitor NNGH, test inhibitor well에 20㎕씩 첨가하였다. 희석된 NNGH inhibitor를 NNGH well에만 20㎕ 첨가하였다.
Inhibitor와 enzyme의 반응을 위하여 37℃에서 30~60분 동안 plate를 배양하였다. 희석된 10㎕ substrate (P125-9090)를 넣으면 반응이 시작되고, microplate reader의 412nm에서 1분 간격으로 10~20분 동안 측정하여 억제율을 구하였다.
Cell viability의 측정
MMP 량 측정에 미치는 세포 농도의 영향을 보정해 주기 위해 MTT assay를 다음과 같이 실시하였다. 배양이 완료된 배지의 10%에 해당하는 MTT 용액을 넣고 3시간 37℃에서 빛을 차단한 채 반응시킨 다음 형성된 formazan을 DMSO로 녹인 후 microplate reader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Cell viability 에 의한 보정은 MMP inhibitory activity/cell viability 값으로 보정하였다.
조록나무 조추출물에의한 MMP-1생성과 활성억제 효과
부위 |
MMP-1생성억제효과(%) at 100 μg/mL |
MTT(%) at 100 μg/mL |
MMP-1활성억제효과(%) at 20 μg/mL |
조록나무 잎, 줄기 혼합물 |
29.4 |
0.3 |
16 |
조록나무 잎 |
18.2 |
0.4 |
11.1 |
콜라게나제 생성 억제 효과 및 활성억제 효과를 조사한 결과 독성이 없는 수준에서 유효한 효능을 보여주었다.
실험예
6 :
조록나무
추출물과
PGG
의 항산화 효과 조사
DPPH
(1,1-
Diphencyl
-2-
piocry2
-
Hydrazyl
) radical 소거활성에 의한 항산화 검색
DPPH는 자신이 가지고 있는 홀수의 전자 때문에 517nm에서 강한 흡수 band를 보이나 phenolic 화합물과 같이 수소에 전자를 제공해주는 전자 공여체와 반응을 하게 되면 전자나 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 된다. 따라서 흡수 band도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다. 또한 공여된 전자는 비가역적으로 결합하며 그 수에 비례하여 진보라색의 DPPH의 색깔은 점점 옅어지게 되고 흡광도도 감소하게 된다. DPPH 시약을 EtOH에 녹여 0.1 mM 농도가 되게 제조하여 DPPH용액 450 μL에 여러 농도의 시료용액 50 μL를 넣어 잘 섞은 후 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 시킨 시료는 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 517nm의 파장에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 시료의 환원력의 크기는 Inhibition Concentration at 50% of Activity (IC50) 으로 표시한다.
Free radical 소거 활성 정도는 다음과 같이 계산하였다.
여기서 A는 시료가 포함되지 않은 DPPH control 용액의 흡광도이고, B는 DPPH와 시료 용액의 혼합액의 흡광도이고, C는 시료 자체의 흡광도이다.
조록나무 잎 조추출물 및 PGG의 항산화 활성
구분 |
라디칼 소거활성 (%) 50 ㎍/mL |
IC50 (㎍/mL) |
조추출물 |
94.0 |
5.7 |
PGG |
96.2 |
2.3 |
비타민 C |
93.4 |
5.5 |
상기 표 11에서와 같이 조록나무 잎의 조추출물 및 이의 활성성분인 PGG는 대조군인 비타민 C보다 우수한 항산화활성을 나타내었다.