KR102513584B1 - 자외선 및 미세먼지 차단용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

자외선 및 미세먼지 차단용 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 미세먼지 및 자외선에 의한 피부손상 케어용 조성물은 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물을 포함하고, 천연성분을 주성분으로 하여 피부에 자극을 주지 않으면서도 미세먼지 및 자외선으로 인한 피부 자극 및 중금속 피해를 완화할 수 있는 효과가 있으며, 피부를 보호 할 수 있는 효과가 있다.

Description

자외선 및 미세먼지 차단용 조성물 및 이의 제조 방법{Composition for UV and fine dust protecting and method for preparing the same}
본 발명은 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 미세먼지 및 자외선으로부터 피부를 보호하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 우리 몸의 항상성을 저해하는 외부 요인의 위해를 막아주는 일차적인 보호기관이다. 즉, 외부의 화학적, 물리적, 생물학적 장벽기능을 수행하고 있으나 다양한 환경적 요인과 접촉하고 있기 때문에 손상을 받게 된다. 외부의 주요 스트레스 요인으로는 자외선, 미세먼지, 황사, 급격한 온도 및 습도 변화 등을 들 수 있다.
최근 미세먼지는 건강에 가장 큰 유해요인으로 여겨지고 있다. 미세먼지는 호흡기뿐만 아니라 피부를 통해서도 몸 속에 침입한다. 중금속, 환경호르몬 등을 함유한 미세먼지는 이 같은 피부장벽을 무너뜨리고 체내에 침투한다. 또한, 지름이 0.01㎜ 안팎인 미세먼지는 지름이 2~5배인 모공도 손쉽게 통과한다.
이렇게 통과된 미세먼지는 염증반응을 일으키고 피부장벽에 손상을 주어 피부건조 및 아토피피부염을 악화시킬 수 있다. 또한 미세먼지에 붙은 PAH가 멜라닌세포를 증식시켜 얼굴에 색소반점을 증가시킬 수 있다.
뿐만 아니라 대기 중 미세먼지 내 유기성분들을 포함한 탄소 입자는 미세먼지 질량 농도의 20-90%를 차지하고 있는 주요 구성요소인데, 이 중 다환방향족탄화수소류(PAHs), 휘발성유기화합물(VOCs), 알데하이드류(Aldehydes) 3가지가 주로 대기오염물질 중 인체에 독성이 강한 것으로 알려져 있다. 이 중 특히 PAHs는 19세기 후반 석탄 사업장 노동자들에 대한 높은 피부암 발병률이 밝혀진 이후 현재까지 유해대기오염물질(HAPs: hazardous air pollutants)의 중요한 지표이다. 피부세포에서 aryl hydrocarbon receptor(AHR)와 AHR-repressor(AHRR)의 발현은 장벽 기관과 피부 세포에서 두드러지게 높은데, AHR의 역할로는 xenobiotic metabolizing enzymes(XME)의 유도를 조절하고, 상피 장벽의 수용력을 강화시키며, 발달 및 기능에 관여한다. PAH의 피부독성에 관한 보고는 그들이 강력한 AHR 리간드임을 발견한 것보다 훨씬 전에 발표되었다. 인체에서 AHR 활성제인 Benzo[α]pyrene과 같은 PAHs가 피부에 노출되면 염소좌창, 색소 침착, 각화증, 피부암을 유발할 수 있으며 자가 면역 질환을 악화시킬 수 있다.
이에 따라 최근 미세먼지 차단, 미세먼지 클렌징 등의 보호 효과가 있는‘안티폴루션’ 화장품의 사용이 급증하고 있다. 특히 천연물 소재의 다양한 생리활성 기능에 많은 관심을 가지게 되면서 기능성 제품의 원료로 천연물을 사용하고 있다.
식물 추출물을 이용하는 항미세먼지용 화장료 조성물 기술로는, 국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-1873218호「홀리바질, 박하, 님나무 추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 미세먼지에 의한 피부자극 및 피부염증 완화용 조성물」등이 개시되어 있다.
상황버섯은 일명 목질진흙버섯으로 불리우며, 동의보감에서는 상목이(桑木耳)라는 이름으로 등록되어 있는데 항암효과가 뛰어난 것으로 알려져 있으며, 귀중한 약재로서 한국에서 대량으로 재배되는데 약용하기 위해 달이면 노란색이거나 연한 노란색으로 맑게 나타나며, 맛이 순수하고 담백하여 식용에도 탁월하다. 또한 항산화 효능과 관련하여 인체에 유해한 Free Radical의 생성을 억제하는데 있어서 기존 항산화제보다 탁월한 효능을 발휘하여 피부노화를 방지하는 것으로 보고된 바 있다. 또한 표고버섯 및 느타리버섯 역시 항암효과가 있는 것으로 보고된 바 있는데 본 발명에서는 이들의 복합 버섯류가 더욱 강력한 항미세먼지 및 자외선으로부터의 피부 보호 효과가 있는 것을 보고하게 되었다.
종래, 대한민국 등록특허 제10-2018883호에는 '상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물'이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1677362호에는 상황버섯 추출물의 발효물을 함유하는 화장료 조성물이 개시되어 있다.
본 발명자들은 미세먼지로부터 피부를 보호하기 위한 국내 자생 식물소재를 발굴하고자 연구를 진행하였으며, 1차 스크리닝을 통해 최종적으로 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯을 선택하였다. 이들 버섯 복합류를 초고압 전처리한 후 아임계 추출하여 제조되는 추출물은 자외선 및 미세먼지로 유발된 멜라닌의 억제 효과가 크게 증진되고, 또한 피부 과색소침착 개선, 피부세포 손상 억제, 피부장벽 강화 활성이 나타나는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 제10-2018883호, 제10-1677362호, 제10-1873218호
본 발명은 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯을 추출하여 제조한 상황버섯 외 버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 일 측면에서, 미세먼지에 의해 손상된 피부 세포에서 특정 유전자의 발현량을 정상 수준으로 조절함으로써, 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상을 억제하는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 일 측면에서, 자외선 및 미세먼지로 인한 피부 멜라닌 생성을 억제하며, 피부 과색소침착 개선, 피부장벽 강화 및 보습력 증가 활성이 우수한 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명에 따른 미세먼지 및 자외선으로부터 피부를 보호하여 우수한 멜라닌 억제 효과 등의 피부보호효과를 나타내는 화장료 조성물은 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물은 천연소재로 제조되어 안전하며, 미세먼지 및 자외선에 의한 피부 과색소침착(hyperpigmentation) 개선 활성이 우수하여 피부 과색소침착 개선용, 피부장벽 강화용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
이하 첨부한 표들을 참조하여 본 발명에 따른 자외선 및 미세먼지에 의한 피부 과색소침착(hyperpigmentation) 개선 활성을 가지는 조성물 및 이의 제조 방법을 상세히 설명한다.
본 명세서에 기재되어 있는 실시예 및 실험예들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 %의 단위는 별다른 정의가 없는 한 중량%를 의미한다.
본 발명의 상황버섯으로는, 소나무 비늘 버섯과의 진흙버섯속에 속하는 모든 상황버섯을 사용할 수 있다. 자연산 상황버섯을 사용하는 것이 바람직하고, 한국 내에 자생하는 자연산 상황 버섯을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
표고버섯은 주름버섯속 느타리버섯과 잣버섯속에 속하는 모든 표고버섯을 사용할 수 있다. 자연산 표고버섯을 사용하는 것이 바람직하고, 한국 내에 자생하는 자연산 표고버섯을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
느타리버섯은 담자균류 주름버섯목 느타리과에 속하는 모든 느타리버섯을 사용할 수 있다. 자연산 나타리버섯을 사용하는 것이 바람직하고, 한국 내에 자생하는 자연산 느타리버섯을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
상기 천연 추출물의 추출 방법 및 조건은 크게 제한되지 않으며, 추출물의 제조를 위하여는 공지 기술을 적절히 사용해도 무방하다. 추출 방법의 일 예로, 열수추출, 환류추출 등을 이용하여 천연재료로부터 추출하여 얻은 용액을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않음은 물론이며, 추출 후 고형물 제거를 위한 여과 과정을 더 거칠 수 있다. 추출 온도 및 추출 시간도 크게 제한되지 않고, 추출 온도의 경우 영양 성분의 파괴를 최소화할 수 있을 정도의 온도가 좋으며, 일 예로 30 내지 70℃ 및 0.1 내지 10 시간을 들 수 있다. 하지만 이는 구체적인 일 예로서 설명된 것일 뿐, 본 발명이 이에 제한되어 해석되는 것은 아니다.
또 다른 일례로 본 발명에서는 이러한 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물의 제조를 위하여 초임계 추출물을 제조한다.
초임계 추출물을 제조하기 위해서는, 먼저 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯을 건조시킨 후 분쇄하여 분말로 제조한다.
추출용매로는, 이소프로필알콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 등의 다가 알콜류를 사용할 수 있으며, 1,3-부틸렌글리콜과 에탄올을 같은 질량비로 혼합한 후 교반하여 단일상이 되도록 하고 이를 공용매로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 초임계 유체 추출은 이산화탄소를 이용한 통상적인 방법으로 실시할 수 있으며, 구체적으로 다음과 같이 실시하는 것이 바람직하다.
분쇄된 버섯과 공용매를 혼합하여 교반한다. 혼합비율은 분쇄된 버섯과 공용매를 1:2.5~6.5의 질량비이며, 바람직하게는 1:4의 질량비로 사용하는 것이 수율 면에서 가장 우수하다. 이어서, 이 혼합물을 초임계 추출조에 투입하고, 고압용 기체펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 공급한 후 압력을 높인다. 이어서, 추출조 내부의 온도를 40℃ 까지 승온시키고 이를 유지시킨다. 그리고 나서, 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급하면서, 출구 쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물을 방출시킨다. 압력조절기의 온도를 조절하여, 방출물의 압력 및 온도강하로 인해 이산화탄소가 고체 드라이아이스로 전이되어 최종 출구쪽의 튜브가 막히는 현상을 방지한다. 이 온도는 60℃ 정도가 바람직하다. 방출된 추출물은 상압으로 감압되어 이산화탄소와 버섯 추출물이 분리되며, 이산화탄소는 대기로 방출되고 버섯 추출물은 회수된다. 추출물의 수율을 높이기 위해 상기 과정을 수회 반복할 수 있다.
상기와 같이 제조된, 본 발명에 따른 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 초임계 추출물은, 화장수, 영양화장수, 영양크림, 에센스, 팩, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 마사지 크림 등의 피부탄력, 주름개선 및 미백 관련 화장료에 첨가할 수 있으며, 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20.0 중량%로 첨가하는 것이 바람직하다. 0.01 중량% 미만이면 효능이 지나치게 미미하고, 20.0 중량% 초과이면 화장료로서의 사용감이 떨어져 로션 등의 묽은 제품에는 사용하기에 부적합하다.
이하 실시예 및 비교예, 제조예, 시험예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
발명의 효과에 있어서는 일 측면에서 구체적으로, 본 발명에서 미세먼지에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자로는 IL1B(NM_000576), IL-36G(NM_019618), S100A7(NM_002963), LCE3D(NM_032563), PTGS2(NM_000963),XDH(NM_000379) 등을 포함한다. 따라서 이들 유전자의 발현량을 억제하여 정상 수준으로 조절한다면 피부 세포의 손상을 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 미세먼지에 의해 발현량이 증가되는 유전자는 아래 와 같은데[표 1], 이들 표에서 Name은 NCBI의 genebank accession ID를 의미하는 것이고, Gene Symbol은 공식 유전자 심볼을 의미하며, Gene title은 각 유전자의 이름을 의미한다.
증가유전자
Name Gene
Symbol		 Gene title
NM_002963 S100A7 S100 calcium binding protein A7
NM_032563 LCE3D late cornified envelope 3D
NM_019618 IL36G interleukin 36, gamma
NM_000576 IL1B interleukin 1, beta
NM_000963 PTGS2 Cyclooxygenase-2 (COX-2)
NM_000379 XDH XDH xanthine dehydrogenase
상기 유전자 또는 단백질의 발현량 분석은 마이크로어레이, PCR, NGS(Nest Generation Sequencing; 차세대 염기서열분석), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 조직면역 염색, 면역침전분석법 등 당업계에 공지된 다양한 분석 방법을 이용하여 분석될 수 있다.
본 발명의 항미세먼지용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항미세먼지 화장료 조성물을 포함하는 화장품에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1-7]
(자연산 상황버섯, 표고버섯, 및 느타리버섯의 초임계 추출물의 제조)
자연산 상황버섯으로서, 한반도 지역에서 자생한 목질 진흙버섯(P. linteus) 또는 낙엽진흙버섯(P. pini), 자연산 표고버섯 및 느타리버섯을 햇빛이 쪼이지 않는 서늘한 곳에서 중량의 변화가 없을 때까지 건조시킨 후, 동량 혼합하여 기계적인 방법으로 직경 1cm 이하의 크기로 분쇄하였다. 또한, 1,3-부틸렌글리콜과 에탄올을 같은 질량비율로 혼합한 후 교반시켜 단일상의 공용매를 제조하였다.
분쇄된 버섯과 공용매를 1:4의 질량비로 혼합하여 30분간 교반시킨 후, 버섯과 공용매 혼합물을 내부 용적 1.5ℓ의 초임계 추출조에 투입하고 추출조를 밀봉하였다. 고압용 기체펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 공급하고 압력을 높인 뒤, 추출조의 압력이 300기압에 달하면 이산화탄소의 공급을 중단하였다. PID 온도제어기를 이용하여 추출조 외부를 감싸고 있는 열선을 이용하여 추출조 내부의 온도를 0.5 /min 속도로 40℃ 까지 승온시켰다. 승온으로 인한 추출조의 압력은 추출조의 출구에 부착된 압력조절기를 이용하여 이산화탄소를 일부 배출하며 압력을 300기압으로 유지시켰다. 또한, 추출조의 온도와 압력을 40℃, 300기압으로 30분간 유지시켰다. 고압용 기체 펌프를 재가동하여 12ℓ/min의 유량으로 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급하였다. 동시에 출구쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물을 방출시키되, 압력조절기의 온도를 60℃로 유지시켰다. 방출된 추출물은 상압으로 감압되어 이산화탄소와 버섯 추출물이 분리되었고 이산화탄소는 대기로 방출되었다. 분리된 버섯 추출물을 유리 포집기를 이용하여 회수하였다. 상기 공정 중, 추출조 내부의 온도를 0.5 ℃/min 속도로 40℃까지 승온시키는 공정으로부터 분리된 버섯 추출물을 회수하는 공정까지를 수회 반복하여 10시간 동안 수행 후, 추출을 종료하고, 얻어진 추출물을 시료로 사용하였다(S1).상황버섯(S2), 표고버섯(S3), 느타리버섯(S4)을 단독 또는 상황+표고(S5), 상황+느타리(S6)로 제조한 것은 괄호안에 기재된 것과 같다(표 2).
상황버섯 표고버섯 느타리버섯
실시예 1 ○ ○ ○
실시예 2 ○ - -
실시예 3 - ○ -
실시예 4 - - ○
실시예 5 ○ ○ -
실시예 6 ○ - ○
실시예 7 - ○ ○
[실험예 1] 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 세포독성 여부 확인
세포 독성 여부를 확인하기 위해 B16F10 세포주를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 배양하였으며, 96 well plate에 각각 2×104의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 UV 조사기(BLX-312, Vilber Lourmal, France) 안에 plate를 넣고 UV lamp를 이용하여 30 mJ/cm2의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 미세먼지를 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 미세먼지는 디메틸설폭시드에 희석하여 사용하였다(Urban particulate matter NIST SRM 1648a, Sigma-Aldrich, USA). 상기 실시예에서 제조한 시료를 농도가 0.1, 1.0 또는 2.0%가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide (MTT, Sigma, USA) 용액을 각 well에 100 ㎖씩 첨가한 후 (3 ㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 ㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.
구분 세포생존률 (%)
B16F10
0.5 % 1.0 % 2.0 %
자외선/미세먼지 × 123 129 125
대조군
(자외선/미세먼지 ○)		 100 100 100
실시예 1 101 100 101
실시예 2 100 101 102
실시예 3 98 98 96
실시예 4 99 100 99
실시예 5 100 99 98
실시예 6 101 99 99
실시예 7 98 99 96
상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물을 적용한 시료는 모든 농도에서 모두 95% 이상의 세포생존율을 나타냄에 따라 B16F10의 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
[실험예 2]자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 멜라닌 생성 저해 여부 확인
자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 멜라닌 생성 억제 효능을 확인해보기 위해 B16F10 세포를 24 well plate에 각각 4×105의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)으로 1회 세척한 후, PBS를 각 well에 1 ml 씩 넣었다. UV 조사기 안에 plate를 넣고 UV lamp를 이용하여 30mJ/cm2의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 미세먼지를 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 본 발명 의 제조예 및 실시예를 각각 1% 및 2%로 배지에 첨가하여 세포에 처리한 후 72시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로는 arbutin을 사용하였으며 샘플은 매일 1회 교체하였다.
멜라닌 생성률을 확인하기 위해 배지를 제거하고 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 이후 1 N의 NaOH를 각 well에 500 μl 씩 첨가하고 30분간 shaking하여 생성된 멜라닌을 녹여 multimicroplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 4에 나타내었다.
구분 멜라닌 생성률 (%)
B16F10
1.0% 2.0 %
자외선/미세먼지 × 49
대조군
(자외선/미세먼지 ○)		 100
실시예 1 62 58
실시예 2 76 72
실시예 3 93 91
실시예 4 95 96
실시예 5 73 69
실시예 6 77 69
실시예 7 89 85
상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 복합추출물은 상황버섯, 표고버섯, 느타리버섯 단독 추출물과 비교하여 더 우수한 멜라닌 생성 억제 효능을 나타내었다.
이는 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물의 경우 단독의 경우에 비하여 자외선과 미세먼지로 인해 발생하는 피부 과색소침착(hyperpigmentation)을 개선하는 효과가 우수하다는 것을 나타낸다.
[실험예 3] 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 멜라닌 생성 관련 MC1R 및 중금속 독성완화 관련 AhR mRNA 발현 억제 여부 확인
자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서 멜라닌 생성과 관련된 자외선 수용체인 MC1R과 환경 독성 물질이나 다환 방향족탄화수소, 박테리아 등에 의하여 유도된다고 알려진 미세먼지 수용체인 AhR의 mRNA 발현 억제 효능을 확인해보기 위해 B16F10 세포를 24 well plate에 각각 3×106의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)으로 1회 세척한 후 PBS를 각 well에 1 ml 씩 넣었다. UV 조사기 안에 plate를 넣고 UV lamp를 이용하여 30 mJ/cm2의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 미세먼지를 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 각각 1% 및 2%로 배지에 첨가하여 세포에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 B16F10 세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 MC1R 및 AhR 유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현량을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler (GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer , taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 μl로 조정 후 95℃ 5분 1 cycle/95℃ 1분/51℃ 2분/72℃ 1분 28 cycle 증폭, 72℃에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 각각의 primer sequence는 표 5에 나타내었다. MC1R와 AhR 발현량은 각각의 β-actin 발현량으로 나누어 그 값을 보정하였으며, 그 결과는 하기의 표 6에 나타내었다.
Gene Sequence (5'→3')
MC1R F: CCT CTG CCT CAA GGG TGC TG
R: TCA ACA GTG GAG CTG AGG ACG
AhR F: GGT GCC TGC TGG ATA ATT CAT CTG
R: TCG TCC TTC TTC ATC CGT CAG TG
β-Actin F: TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA
R: TAAA ACG CAG CTC AGT AAC AGT CCG
구분 mRNA 발현량
MC1R / β-actin AhR / β-actin
1.0 % 2.0 % 1.0 % 2.0 %
자외선/미세먼지 × 1.00
대조군
(자외선/미세먼지 ○)		 5.56 3.23
실시예 1 4.53 3.95 2.81 2.53
실시예 2 5.17 4.54 3.12 2.98
실시예 3 5.43 5.34 3.18 3.11
실시예 4 5.45 5.32 3.21 3.10
실시예 5 5.03 4.84 3.00 2.85
실시예 6 5.02 4.76 3.03 2.81
실시예 7 5.33 5.22 3.10 3.02
상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물은 단독 추출물과 비교해 볼 때, B16F10 세포주에서 자외선과 미세먼지에 의한 MC1R 및 AhR의 mRNA 발현 증가를 효과적으로 억제하였다. 결과적으로, 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물은 대조군과 비교 시, MC1R 및 AHR에 대한 mRNA 조절 효과가 우수하여, 자외선과 미세먼지로 인한 피부 과색소 침착억제 및 중금속 유래반응의 독소완화 효과를 확인할 수 있었다.
[실험예 4]Hyaluronic acid 생성량 확인
Hyaluronic acid(HA)는 분자량이 20-40만에 이르는 배당체 형태의 고분자화합물로써 주로 각질형성세포(keratinocyte) 및 섬유아세포(fibroblast)의 hyaluronic acid synthase(HAS)에 의하여 합성되어 세포외기질에 축적되며, HA의 감소는 주름형성, 표피의 위축, 피부 결합수 감소, 피부의 탄력 저하 등 피부노화의 원인이 된다.
Keratinocyte인 HaCaT에서 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물이 hyaluronic acid(HA) 생성량을 증가하는지 확인하기 위해 ELISA kit로 측정하였고, 그 결과는 표 7와 같다. 표 7에서 N(normal)은 BP(Benzo[α]pyrene) 미자극 그룹이고, C(control)은 BP(Benzo[α]pyrene) 자극 그룹이다.
N C 구분 (μg/mL) 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7 EGCG 10μg/mL
198

 99.3

 100 143.1 120.1 108.1 106.3 123.2 122.1 105.1 105.6
250 150.2 122.2 110.2 108.1 126.3 125.3 107.2
500 153.2 125.3 112.8 110.7 129.2 128.2 110.8
표 7에서 확인할 수 있듯이, 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물은 hyaluronic acid의 생성량을 500 μg/mL 농도에서 대조군 대비(C, control;99.3ng/mL) 53.9 ng/mL 증가하였으며, 대조군인 EGCG는 10μg/mL의 경우 6.3ng/mL의 증가율을 보였다.
결과적으로, 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물은 높은 Hyaluronic acid(HA) 생성의 증가를 보여 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯의 우수한 효과를 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물을 포함하는, 미세먼지 및 자외선에 의한 피부손상 케어용 화장료 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제2항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 전체 중량 중 0.001 내지 5 중량%로 포함되는, 미세먼지 및 자외선에 의한 피부손상 케어용 화장료 조성물.
  6. A)상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯에 추출용매를 가한 것을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 40~50℃, 60~80 MPa 조건의 물로 100~120분 동안 가압 처리하는 초고압 전처리 단계;
    (B)추출용매를 가하여 120~200℃, 압력 0.1~15 MPa의 조건에서 10~30분간 추출하는 아임계 추출 단계;
    (C)여과하는 단계를 포함하는, 미세먼지 및 자외선에 의한 피부손상 케어용 화장료 조성물의 제조방법
  7. 제6항에 있어서, 상기 (A) 또는 (B)단계에서 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리에칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용되는 것임을 특징으로 하는 미세먼지 및 자외선에 의한 피부손상 케어용 화장료 조성물의 제조방법.
  8. 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯을 40~50℃, 60~80 MPa 조건의 물로 100~120분 동안 가압 처리하는 초고압 전처리 후, 상기 전처리된 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯에 용매를 가하여 120~200℃, 0.1~15 MPa 조건에서 10~30분 동안 아임계 추출하여 제조되는 상황버섯, 표고버섯 및 느타리버섯 추출물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유하는 미세먼지 및 자외선에 의한 피부손상 케어용 화장료 조성물.
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