KR102018883B1

KR102018883B1 - 상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102018883B1
Application number: KR1020170049556A
Authority: KR
Inventors: 김종명; 이원석; 김세영; 이수정; 이상한; 손형우; 김대익
Original assignee: (주)팜바이오스
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2019-09-06
Also published as: KR20180116818A

Abstract

본 발명은 상황버섯 균사체(Phellinus baumii Mycelium)에 의한 복분자(Rubus coreanus) 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 상황버섯 균사체 배양액을 살균된 복분자에 접종 및 배양하여 수득되는 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물 및 상기 화장품 원료 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부 컨디셔닝 또는 두피 케어를 위한 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 복분자를 상황버섯으로 발효시킨 발효물은 세포 독성이 없는 천연물 유래의 조성물로서 항산화 활성, 피부 노화 억제, 항염증 활성, 비듬균 억제 활성이 우수하여 피부 컨디셔닝 및 두피 케어 용도의 화장품 원료 조성물로서 적용 가능하므로 화장품 산업상 매우 유용한 것이다.

Description

상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물{A COSMETIC BASE MATERIAL COMPOSITION A FERMENTATION PRODUCTS OF RUBUS COREANUS USING PHELLINUS BAUMII MYCELIUM AND A FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 상황버섯 균사체(Phellinus baumii Mycelium)에 의한 복분자(Rubus coreanus) 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 상황버섯 균사체 배양액을 살균된 복분자에 접종 및 배양하여 수득되는 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물 및 상기 화장품 원료 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부 컨디셔닝 또는 두피 케어를 위한 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 일상 생활에서 햇빛 노출에 의한 자외선 조사, 황사나 자동차 매연 등에 의한 대기 오염 물질 및 각종 세균 등에 노출되어 피부 트러블 및 자극이 유발되며 이로 인해 정상적인 피부 노화를 가속화시키게 된다. 이러한 피부 노화는 피부 외관상으로 피부의 탄력을 저하시켜 주름을 형성하거나 기미 및 노인성 반점을 형성하여 피부의 색소 침착을 유발하게 된다.

일반적으로 피부 노화는 체세포 돌연변이, 자유 라디칼의 과도한 생성, 자가면역반응, 독성물질의 축적, 유전자 복제중 발생된 에러, 진피구성 단백질의 변형 등 여러 가지 학설이 제기되고 있으며, 이 중에서 노화(aging)와 성인병과 같은 각종 질환의 원인이 활성산소종(reactive oxygen species)에 기인된다는 학설이 인정받음에 따라 산소나 질소로부터 유래되는 활성 산소종을 조절할 수 있는 천연 항산화제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

보통 유해산소로 알려져 있는 활성 산소종은 가장 안정한 형태인 삼중항 산소가 환원되면서 과산화물 음이온 라디칼, 과산화수소, 히드록시 라디칼, 과산화지질이나 여기서 발생되는 자유 라디칼 등의 과산화지질로서, 체내에는 이러한 활성산소종이 정상적인 상태에서도 발생을 하지만 항산화 효소인 슈퍼옥사이드디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathion peroxidase, GPx) 등이 존재하여 과도한 활성 산소종의 생성을 억제하고 있다. 그러나, 이러한 활성산소종이 스트레스 및 외부 환경적인 요인에 의해 비정상적으로 과도하게 발생이 되어 소거되지 않고 체내에 존재하게 되면 자유 라디칼로 인한 산화적 스트레스(oxidative stress)가 생체에 가해져 DNA, RNA, 단백질, 세포막 및 세포구조 손상, 암, 조직 손상, 노화 등을 유발한다고 추측된다.

현대에 급증하는 다양한 질병 및 노화의 가속화를 억제하기 위하여 이러한 활성산소종을 조절하거나 제거할 수 있는 항산화제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 대표적으로, 천연 항산화제인 토코페롤, 아스코르빈산, 카로테노이드, 플라보노이드, 글루타치온 등에 대한 효능 연구 및 이들의 안정화 기술에 대한 연구와 합성 항산화제인 부틸화된 히드록시 톨루엔(BHT), 부틸화된 히드록시 아니졸(BHA) 등 다양한 항산화제가 알려져 있고, 그 외 많은 항산화제에 관한 연구가 지속적으로 진행되고 있다. 이들 항산화제 중 토코페롤은 항산화 효과가 비교적 낮은 편이고, 효과가 우수한 BHA, BHT 등의 합성 항산화제가 의약품 및 식품분야 등에서 이용되고 있으나, 돌연변이원성 및 독성에 대한 지적이 있으며, 아스코르빈산의 경우에는 안정성이 확보된 유도체 및 제형 개발이 진행되고 있어, 더욱 안정하고 효과가 우수한 천연 항산화 소재의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 최근 각광받고 있는 식물 화학물질(phytochemical) 중에서 상대적으로 독성이 낮고 안전하며 피부에 유효한 효능을 나타내는 추출물을 이용한 화장료 조성물에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으나 일반적인 추출 방법에 의해 수득된 성분은 그 효과가 미미한 한계점을 나타내어 효능을 극대화시킨 소재의 개발이 요구되고 있다.

한편, 발효를 통한 천연 추출물의 경우에는 인체에 유해한 유기용매를 사용하지 않고 천연물 내에 존재하는 당 성분을 미생물의 대사과정에서 탄소원으로 사용되어 알코올로 전환시키게 되므로, 천연물 내의 유효성분, 특히, 플라보노이드, 폴리페놀, 카테킨 등은 당화되어 안정한 화합물로 존재하게 되어 있어 발효를 통해 유효성분 함량 추출율을 증가시키고 당이 배제되어 활성화된 유효성분에 의해 우수한 피부 효능이 기대되고 있다.

최근 버섯에 대한 소비자의 인식이 식용뿐만 아니라 약용 및 기호식품으로 확대되고, 버섯의 자실체 및 균사체의 추출물이나 균사체 배양물이 각종 질환의 예방과 치료에 효과가 있다고 밝혀지면서 버섯류는 새로운 바이오 산업 소재로써 기능성 식품 및 의약품 개발에 필요한 중요한 생물 자원으로 대두되었다. 버섯류는 세계적으로 약 20,000여 종이 알려져 있으며, 그중 식용으로 개발 가능한 것은 약 2,000여 종이다. 국내 분포하는 버섯류는 약 992종이 기록되어있고 이중 식용 버섯이 100여 종, 독버섯이 50여 종이며, 특히 맹독성을 가진 버섯이 20여 종으로 확인되어 있다. 약 20여 종 이상의 버섯이 국내에서 재배 가능하며 항암, 콜레스테롤 저하, 혈당강하 등이 입증된 바 있다.

상황버섯은 목질진흙버섯이라고도 불리기도 하며, 갓은 지름 6 내지 12cm, 두께 2 내지 10cm, 반원모양, 편평한 모양, 둥근 산 모양, 말굽 모양 등 여러 가지 모양을 하고 있다. 표면에는 어두운 갈색의 털이 짧고 촘촘하게 나있다가 자라면서 없어지고 각피화한다. 성장 초기에는 진흙 덩어리가 뭉쳐진 것처럼 보이다가 다 자란 후에는 나무 그루터기에서 혓바닥을 내민 모습이어서 수설(樹舌)이라고도 한다. 1968년 일본 Kiekawa 등에 의해 항암 효과가 있다고 알려진 이래로 많은 연구가 진행되고 있으며, 항암 효과 외에도 면역 조절 효과, 항산화 효과, 간기능 개선 작용, 고지혈증 개선 작용, 미백 효과 등 다양한 약리 효과를 나타낸다. 약용하기 위해 달이면 노란색이거나 연한 노란색으로 맑게 나타나고 맛과 향이 없는 것이 특징이다. 한국, 일본, 오스트레일리아, 북아메리카 등에 자생한다.

또한, 복분자는 장미과의 복분자딸기의 채 익지 않은 열매로 만든 약재로, 이것을 먹으면 요강이 소변 줄기에 뒤집힌다고 하여 붙은 이름이다. 신(腎) 기능을 북돋아 유정(遺精), 몽정(夢精), 유뇨(遺尿) 등에 사용하며 시력 약화를 방지하고, 몸을 가볍게 하며 머리를 검게한다. 또한, 살결을 부드럽고 아름답게 하기도 한다.

또한, 복분자는 폴리페놀을 다량 함유하고 있으며, 항염 작용, 항산화 작용, 항헬리코박터 파이로리 작용, 항암 작용, 노화 억제, 동맥경화 예방, 혈전 예방, 살균 효과 등이 있다는 것이 밝혀졌다.

KR

10-0643852

B

KR

10-0910655

B

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 세포 독성이 없는 천연물 유래로서 항산화 활성, 피부 노화 억제, 항염증 활성, 비듬균 억제 활성 등의 피부 컨디셔닝 및 두피 케어에 적합한 복분자를 상황버섯 균사체로 고체 발효시킨 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물 및 상기 화장품 원료 조성물을 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 상황버섯 균사체(Phellinus baumii Mycelium)에 의한 복분자(Rubus coreanus) 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 화장품 원료 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 피부 컨디셔닝 또는 두피 케어용인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 헤어 스프레이, 헤어 로션, 헤어 젤, 헤어 왁스, 샴푸 및 린스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것이 바람직하다.

본 발명의 복분자를 상황버섯으로 발효시킨 발효물은 세포 독성이 없는 천연물 유래의 조성물로서 항산화 활성, 피부 노화 억제, 항염증 활성, 비듬균 억제 활성이 우수하여 피부 컨디셔닝 및 두피 케어 용도의 화장품 원료 조성물로서 적용 가능하므로 화장품 산업상 매우 유용한 것이다.

도 1은 본 발명의 상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물의 제조 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물의 5α-reductase assay 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물의 염증 관련 인자의 유전자 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물의 비듬균 억제 활성을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 천연물을 이용한 기능성 화장료 조성물의 소재를 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 복분자에 상황버섯 균사체를 접종하고, 이를 고체 배양법에 따라 배양하여 수득되는 상황버섯의 복분자 발효물이 우수한 항산화 활성, 피부 노화 억제, 항염증 활성, 비듬균 억제 활성을 가짐을 확인하고 본 발명의 상황버섯의 복분자 발효물을 기능성 화장료 조성물의 원료 조성물로서 이용할 수 있음을 제안한다.

따라서, 본 발명은 상황버섯 균사체(Phellinus baumii Mycelium)에 의한 복분자(Rubus coreanus) 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물을 제공한다.

본 발명의 원료용 화장료 조성물의 제조에 사용되는 상황버섯은 장수상황버섯일 수 있고, 복분자는 복분자딸기일 수 있다.

본 발명의 상황버섯 균사체는 상황버섯 종균을 종배양시켜 제조될 수 있다. 상기 상황버섯 종균은 사용시까지 주기적으로 계대 배양하여 유지할 수 있는데, 바람직한 구체예로서, PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 상황버섯 균사체를 접종한 후 20~25℃의 온도에서 3~4주 간격으로 계대 배양하여 유지할 수 있다. 상기 종배양은 보관 중인 상황버섯 균사체 종균을 본 배양에 앞서 배양하는 과정이다. 바람직한 구체예로서, 상기 종배양은 상황버섯 균사체용 배지에 종균, 즉 균사체를 접종한 후, 이를 회전 진탕 배양하여 액상의 배양물로서 수득할 수 있다.

본 발명의 복분자는 열매를 의미하며, 상기 복분자의 살균은 준비된 복분자 열매를 수세한 후, 이를 탈수 및 건조시키고, 공지된 다양한 살균 방법을 적용할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 상기 살균은 121℃에서 30분 동안 고압멸균방식으로 수행될 수 있다.

본 발명의 상황버섯 균사체를 멸균된 복분자에 접종하는 방법은 상기 설명된 상황버섯 종배양에 의하여 수득된 액상의 배양물의 일정량을 멸균된 복분자에 무균적으로 접종하는 것이다. 예를 들어, 복분자 100중량부에 대하여 상황버섯 배양액 30~70중량부를 접종할 수 있다.

상황버섯 균사체를 접종한 후, 배양 과정을 거치는데, 상기 배양의 조건은 온도 20~35℃, 상대습도 70~90%, 배양 기간 7~45일인 것이 바람직하며, 바람직한 구체예로서, 24℃의 온도에서 상대습도 85%의 배양기에서 20일 동안 배양시킬 수 있다.

발효가 완성된 상황버섯 균사체의 복분자 고체 발효물은 복분자의 표면에 상황버섯 균사체가 전체적으로 덮여 있는 형상이며, 이를 건조 및 분쇄한 후, 상황버섯 균사체의 복분자 고체 발효물의 추출물을 제조할 수 있다.

추출에 사용되는 용매로는 물 또는 저급 에탄올일 수 있으나, 바람직하게는 열수 추출이다. 바람직한 구체예로서, 건조 및 분쇄된 상황버섯 균사체의 복분자 고체 발효물에 약 5~150배 부피의 열수를 가하고, 1~5시간 동안 진탕시키고, 여과 또는 원심분리하여 추출액을 취할 수 있다. 상기 과정은 1~5회 수행될 수 있으며, 바람직하게는 3회 반복 추출할 수 있다. 수득된 추출액은 상기 설명된 멸균 과정과 동일한 방식으로 살균한다.

상기와 같은 구체적인 제조 공정에 의하여 본 발명의 상황버섯 균사체에 의한 복분자 고체 발효물 내지 이의 추출물을 제조할 수 있으며, 이는 화장품의 원료 조성물로서 아래에 설명되는 기능성 화장료 조성물의 소재로서 적용 가능하다.

따라서, 본 발명은 상기 본 발명의 상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물을 포함하는 화장품 원료 조성물을 함유하는 화장료 조성물 또는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기 기능성이라 함은, 항산화 활성, 피부 노화 억제, 항염증 활성, 비듬균 억제 활성 등을 의미한다.

따라서, 본 발명의 상기 화장료 조성물은 피부 컨디셔닝 또는 두피 케어용인 것이 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물의 주 성분인 상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 50중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는, 0.01 내지 20중량%, 더욱 바람직하게는, 0.1 내지 10중량%이다. 이러한 함량 범위에서 적절한 제형 안정성을 확보할 수 있으며, 목적하는 항산화 활성, 피부 노화 억제, 항염증 활성, 비듬균 억제 활성을 기대할 수 있다.

본 발명의 상기 화장품 원료 조성물은 상황버섯 균사체에 의한 복분자 발효물 외에도 본 발명의 유효 활성을 저해하지 않는 범위에서 항산화, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진의 효과를 위한 공지의 천연물 추출물이나 기타 성분을 추가로 포함시켜 이용할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제와 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제나 담체를 포함하여 특정 제형으로 성형될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 헤어 스프레이, 헤어 로션, 헤어 젤, 헤어 왁스, 샴푸 및 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하에서는, 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것은 아니다.

[실시예]

1. 상황버섯 균사체에 의한 복분자 고체 발효물의 열수 추출물 제조

장수상황버섯(Phellinus baumii)은 ㈜팜바이오스에서 계대중인 균주를 사용하여 25℃에서 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco, Co., USA) 배지를 사용하여 배양하여, 4주 간격으로 계대배양하면서, 4℃에 보관하면서 사용하였다. 500ml 플라스크에 100ml 용량의 버섯 균사체 고체 배지(1 cm × 1 cm, 3개)에 계대 중인 장수상황버섯 균사체를 접종한 후, 회전 진탕 배양기(Daihan Labtech Co.Korea, 25±1℃, 130rpm)에서 7일간 배양하여 액체 종균으로 사용하였다.

복분자는 대구 한약재 시장에서 구입하여, 복분자 열매를 사용 전 수세하여 불순물을 제거한 후 탈수하였으며, 복분자 100g을 3L 배양 용기에 넣고, 121℃에서 30분간 고압 멸균 후 상온에서 냉각하고, 상기 제조된 액체 종균 60ml을 멸균된 복분자 100g에 무균적으로 접종하였다. 발효는 24℃, 상대습도 85%의 배양기에서 20일간 진행하였다. 발효 후 10배 부피의 열수를 첨가하여 2시간 동안 진탕 시킨 후, 72시간 침지하고, 10,000rpm으로 10분간 원심분리 후 상등액을 취하였으며, 이를 3회 반복 후 추출액을 감압 하에서 농축하여 분말로 조제하여 사용하였다(도 1).

2. 활성 평가

2.1. 항산화 활성 평가

상기 제조된 상황버섯 균사체에 의한 복분자 고체 발효물의 항산화 활성을 평가하였다. 대조군으로는 복분자 원물 및 아스코르브산을 사용하였다. 구체적으로, 제조된 상황버섯 균사체의 복분자 고체 발효물의 열수 추출물(100μg/ml)을 대상으로 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) radical 소거능 및 FRAP 활성 측정에 의해 평가하였다.

DPPH 소거능의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 20μl에 99.5% 에탄올에 용해시킨 2x10^-4M DPPH 용액 380μl를 넣고 혼합하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 516nm에서 microplate reader(Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. DPPH free radical 소거능은 아래 표 1에 나타낸 바와 같이 백분율로 표시하였다.

시료	DPPH radical scavenging activity (520nm)
Ascorbic acid(6.25μM)	0.049±0.001
Ascorbic acid(12.5μM)	0.060±0.009
Ascorbic acid(25μM)	0.116±0.050
Ascorbic acid(50μM)	0.169±0.004
복분자 원물(100μg/ml)	0.079±0.016
상황버섯 균사체에 의한 복분자 고체 발효물(100μg/ml)	0.224±0.003

FRAP 활성은 제조된 상황버섯 균사체의 복분자 고체 발효물의 열수 추출물(100μg/ml)을 대상으로 공지된 방법에 따라 수행되었다.

시료	FRAP (% of control)
Ascorbic acid(6.25μM)	0.180±0.002
Ascorbic acid(12.5μM)	0.261±0.009
Ascorbic acid(25μM)	0.403±0.006
Ascorbic acid(50μM)	0.707±0.021
복분자 원물(100μg/ml)	0.915±0.037
상황버섯 균사체에 의한 복분자 고체 발효물(100μg/ml)	1.085±0.048

2.2. 항염증 활성 평가

항염증 활성 측정으로 Griess reagent assay를 수행하였다. 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5×10³ cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, 5% CO₂ incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 1 μg/ml의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 1, 10, 100 μg/ml의 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.

시료		NO (%)		MTT (%)
시료		원물	발효물	원물	발효물
복분자	25 μg/ml	78.15	76.60	75.28	74.38
	50 μg/ml	31.88	29.68	49.21	63.65
	100 μg/ml	7.62	1.08	8.75	40.62

RAW 264.7 세포에서 LPS 유도군의 NO 생성량을 100% 기준으로 하였을 때, 결과는 전반적으로 NO 생성 억제 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 발효 후 NO 생성량이 감소하는 경향을 나타내었으나, 대부분의 고농도 시료는 독성을 나타내어 독성에 의한 NO 생성량 감소가 의심되었다. 그러므로, MTT assay를 이용한 세포 독성 시험을 진행하여 검증한 결과 발효 전에는 세포 독성이 나타나면서 NO 생성량이 감소되었으나, 발효 후에는 세포 독성이 현저히 감소하면서 NO 생성량이 감소하였다. 이는 세포 독성에 의한 영향이 아니라 직접적으로 NO 생성량을 감소하는 것을 의미한다.

2.3. 5α - reductase assay

5α-Reductase 활성 저해 효과는 rat prostate에서 5α-reductase를 직접 분리하여 평가하였다. 구체적인 방법으로는, 7주령 SD rat 수컷을 sacrifice하여 전립선을 취하고, 이를 액체질소를 이용하여 균질화하였다. 균질화된 조직은 cold lysis buffer (20 mM potassium phosphate (pH 6.6), 0.32 M sucrose, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mM phenylmethyl-sulfonylfluoride (PMSF))로 단백질을 lysis 시켰다. 균질화된 조직은 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)를 3배 비율로 넣고, 원심분리를 이용하여 상등액은 수확한 다음에 다시 원심분리 해서 중간층은 5α-Reductase로 사용하였다. Working solution은 10 mM Tris-HCl buffer (pH 6.0) 90 μL, 20 μM testosterone 50 μL, 2 mM NADPH, 10 μL, 100 mg/mL enzyme 50 μL로 제조하였다. 시료의 첨가량은 총 반응액의 1% 농도로 처리하여 저해 정도를 측정하였다. 효소반응은 37 ℃에서 1 h incubation하고, 이의 흡광도 변화량을 UV-spectrophotometric 340 nm 조건에서 측정하였다.

실험 결과, 시간별로 O.D. 값이 변하여 효소반응이 정상적으로 일어난 것을 확인하였다. 양성대조군으로는 finasteride를 10, 100 μM 농도로 사용한 결과, 100 μM에서 약 20% 정도의 저해활성이 확인되었다. 복분자는 원물에서도 높은 활성을 나타내었으나, 상황버섯 발효 후 상대적으로 높은 활성을 나타내었다(도 2).

2.4. 면역 관련 유전자 발현 양상 평가

RAW 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5×10³ cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 μg/ml의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 0, 1, 10, 100 μg/ml의 추출물/시료을 처리하여 24시간 배양하였다. 항염증관련 인자의 발현을 확인하기 위하여 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)으로 분석을 실시하였다. TRIzol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 4 ℃에서 1 시간 동안 처리하여 RNA를 분리/정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 50 V에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 차이를 확인하였으며, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.

RAW264.7 세포에서의 LPS 처리 결과 염증 관련 factor인 TNF-α, COX-2, IL-1β가 증가하는 양상을 확인하였다. 반면, 복분자를 처리한 세포에서는 일부 활성이 감소하는 것을 확인하였으며, 상황버섯 균사체의 복분자 고체 발효물의 경우 상기 유전자의 발현량이 보다 더 감소함을 확인하였다(도 3 및 도 4).

2.5. 비듬균 억제 활성 평가

비듬은 흔히 두피에 존재하는 Pityrosporum 효모가 스트레스 등의 원인에 의해 과대 증식될 경우 나타나므로 이의 억제 활성을 평가하였다. Pityrosporum ovale 균주는 ATCC에서 구매하여(ATCC12078) 보존된 것을 사용하였다. 균주의 종균배양은 Luria-Bertani broth에 7일간 배양하여 사용하였다. Luria-Bertani agar를 autoclave시키고, 이를 petri dish에서 굳혀서 종균 배양된 균주를 도말하였다. Petri dish 가운데에 8 mm paper disc를 올려놓고, 시료 20 μl를 넣어 35℃ 조건에서 3일간 배양하였다. 시료의 Pityrosporum 균주 저해에 따른 clear zone을 caliper로 측정하여 저해 정도를 평가하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 원물 복분자와 대비하여 상황버섯 균사체의 복분자 발효물에서의 활성은 약 2배 높게 나타났으며, 이는 발효 후에 복분자의 비듬균 억제 성분이 증가했음을 예상할 수 있는 것이다.

Claims

장수상황버섯 균사체(Phellinus baumii Mycelium)에 의한 복분자(Rubus coreanus) 발효물의 열수 추출물을 포함하는 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터 및 팩으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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