KR101872010B1

KR101872010B1 - 하라케케에서 추출된 신규한 화합물, 이를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101872010B1
Application number: KR1020160179469A
Authority: KR
Inventors: 정민석; 박창민; 윤정노
Original assignee: 주식회사 한국화장품제조
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2018-06-28

Abstract

본 발명은 하라케케의 뿌리 또는 잎에서 추출된 신규한 화합물, 이를 포함하는 보습, 노화방지용 또는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

하라케케에서 추출된 신규한 화합물, 이를 포함하는 화장료 조성물{A novel compounds from Phormium tenax, and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 하라케케에서 추출된 신규한 화합물, 이를 포함하는 화장료 조성물로, 보다 자세하게는 하라케케의 뿌리 또는 잎에서 추출된 신규한 화합물, 이를 포함하는 보습, 노화방지용 또는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데, 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 이러한 피부에서의 노화의 원인에 대해서는 크게 두 가지로 연구되고 있는데, 하나는 "내적 노화"로서 연령의 증가에 따른 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인한 것이고, 다른 하나는 "외적 노화"로서 외부 환경 즉 자외선, 공해, 스트레스 등에 의한 것으로 나눌 수 있다.

피부의 세포는 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 인간의 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 끊임없이 일어나는 생화학 반응에서 발생하는 활성산소종에 의해 산화적 스트레스가 가해지게 되면, 세포 구성 성분들인 지질, 단백질, 탄수화물과 DNA 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 피부암 등의 각종 질병을 일으키는 원인이 되며, 노화를 촉진시킨다. 아울러 외적 노화의 원인 중에서 가장 큰 부분을 차지하고 있는 것은 자외선에 의한 광노화로서 UV에 지속적인 노출을 통해 피부암 등의 급성 및 만성적인 피부의 상해가 유발된다.

피부 진피층 기질을 이루는 중요한 성분의 하나인 콜라겐의 생합성과 분해는 피부 노화 억제에 핵심이 되고 있는데, 상기 활성산소종은 피부 섬유아세포에서 MMPs(matrix metalloproteinases)의 발현을 촉진하며, 자외선에 의한 콜라게나제의 합성을 촉진시킴으로써 피부 노화를 유발한다.

또한, 엘라스틴(elastin) 섬유는 콜라겐과 가교 결합을 형성하며 피부 탄력에 관여하고 있는 주름 생성에 중요한 피부 구성성분이다. 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스틴 분해 효소인 엘라스타아제(elastase)의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름생성 요인 중의 하나로 밝혀지고 있다. 엘라스타아제는 엘라스틴을 분해할 수 있는 유일한 효소로서 이에 대한 저해는 피부 주름 개선을 근본적으로 줄여줄 수 있다고 알려져 있다.

한편, 사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 피부 표피층에 있는 멜라노사이트에서 합성되는데, 멜라노사이트 내 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시킨다. 따라서, 피부 내의 티로시나제 활성을 저해하여 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

따라서, 화장품 분야에서는 보습, 미백 및 주름 개선효과를 가지는 기능성 화장품에 대한 연구 및 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 특히 피부에 독성이나 자극을 주지 않기 위하여 천연 물질을 이용한 연구가 계속되고 있다.

한편, 하라케케라고 불리우는 신서란(Phormium tenax)은 뉴질랜드가 원산지이며 높이는 1~2m로서, 옆으로 뻗은 뿌리줄기에서 긴 칼 모양의 잎이 뭉쳐나며, 잎은 끝이 뾰족하고 길이가 1~3m, 폭이 5~10cm 이상이며 섬유질이 잘 발달한 식물로서, 뉴질랜드와 오스트레일리아를 비롯해 아시아의 온난한 지방에 분포한다. 이 식물은 관상용으로 정원에 심거나 분재하기도 한다. 온대에서도 재배할 수 있는 유일한 경질섬유 원료 식물로 잎에서 12%의 섬유를 얻을 수 있다. 섬유는 유연하고 탄력이 있으며 잘 썩지 않고 소금기에 강하기 때문에 선박용 밧줄·돛·깔개·종이의 원료(골판지, 도배지, 판지 등)로 이용한다. 그러나, 상기 하라케케의 약리학적 효능에 대하여는 아직 알려져 있지 않다.

본 발명은 하라케케의 뿌리로부터 추출된 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 하라케케의 잎으로부터 추출된 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 하라케케의 뿌리 또는 잎에서 추출된 신규한 화합물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 사용하여 노화방지, 보습 및 미백 등의 효과를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 혼합용매에 하라케케 뿌리 또는 잎을 침적하여 추출하는 것을 특징으로 하는, 하라케케 추출물 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 2의 4-(1-하이드록시뷰탄-2-일)-2,6-디메틸-1,3-디옥산(4-(1-hydroxybutan-2-yl)-2,6-dimethyl-1,3-dioxane) 화합물을 제공한다.

[화학식 2]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2의 4-(1-하이드록시뷰탄-2-일)-2,6-디메틸-1,3-디옥산(4-(1-hydroxybutan-2-yl)-2,6-dimethyl-1,3-dioxane) 화합물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

또한, 본 발명은 에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 9:1 내지 6:4의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 뿌리 또는 잎을 침적하여 추출하는 것을 특징으로 하는 하라케케 추출물 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 하라케케의 뿌리 또는 잎에서 추출된 신규한 화합물을 포함하는 화장료 조성물은 노화방지, 보습 및 미백 등의 효과를 갖는다.

도 1은 화학식 1을 얻기 위한 분리 및 정제 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 화학식 1의 ¹H-NMR 그래프이다.
도 3은 화학식 1의 ¹³C-NMR 그래프이다.
도 4는 화학식 1의 2D-NMR 스펙트럼으로서, HMQC 그래프이다.
도 5는 화학식 1의 2D-NMR 스펙트럼으로서, HMBC 그래프이다.
도 6은 화학식 1의 2D-NMR 스펙트럼으로서, COSY 그래프이다.
도 7은 화학식 2를 얻기 위한 분리 및 정제 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 8은 화학식 2의 ¹H-NMR 그래프이다.
도 9는 화학식 2의 ¹³C-NMR 그래프이다.
도 10은 화학식 2의 2D-NMR 스펙트럼으로서, HMQC 그래프이다.
도 11은 화학식 2의 2D-NMR 스펙트럼으로서, HMBC 그래프이다.
도 12는 화학식 2의 2D-NMR 스펙트럼으로서, COSY 그래프이다.
도 13은 화학식 2(PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)의 NHDF 세포 독성을 측정한 그래프이다.
도 14는 화학식 2(PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(35D-PT-2), 화학식 5(35D-PT-7), 대조군(control) 및 양성 대조군(positive control)의 COL1A1 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 15는 화학식 2(PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(35D-PT-2), 화학식 5(35D-PT-7), 대조군(control) 및 양성 대조군(positive control)의 MMP1 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 16은 화학식 2(PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)의 HaCaT 세포 독성을 측정한 그래프이다.
도 17은 화학식 2(PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)의 Has2 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 18은 화학식 2(PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)의 B16F10 세포 독성을 측정한 그래프이다.
도 19는 화학식 2(PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)의 멜라닌 색소를 분석한 것이다.
도 20은 화학식 2(PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)의 멜라닌 함량을 측정한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물은 신서란(Phormium tenax)이라고도 불리우는 하라케케 식물의 뿌리에서 추출된 물질이다.

본 발명에서는 하라케케 식물의 뿌리에서 추출된 상기 화학식 1의 화합물을 TS-하라플랙스 α(TS-Haraflax α)로 명명하기로 한다.

상기 추출은 에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 9:1 내지 6:4의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 뿌리를 침적하여 추출하는 것이며, 상기 부피비는 바람직하게는 8:2 내지 7:3, 가장 바람직하게는 7:3이다.

상기 부피비의 혼합 용매에 하라케케 뿌리를 약 일주일 동안 침적시켜 분리 및 정제 과정을 거친 후, 상기 화학식 1의 화합물을 얻을 수 있다.

상기 분리 및 정제 과정의 일 실시예는 하기와 같다.

에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 7:3의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 뿌리를 일주일 동안 침적시킨 후 필터하여 하라케케 뿌리 침출액을 얻는다.

상기 하라케케 뿌리 침출액을 디클로로메탄 및 물로 분획하여 디클로로메탄 분획 및 물 분획을 얻는다.

상기 디클로로메탄 분획을 n-헥센 용매와 혼합한 후, 아세톤을 가하여 순서대로 3개의 분획을 얻는다.

상기 3개의 분획 중, 두번째로 얻어진 분획을 헥센:에틸에세테이트를 18:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 메탄올:아세톤:물을 10:1:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 역상 YMC RP-18 컬럼크로마토그래피를 실시하여 4가지 화합물(35D-PT-2, 35D-PT-3, 35D-PT-4 및 35D-PT-7)을 얻는다.

상기 4가지 화합물을 각각 동정하여 신규한 화합물은 상기 화학식 1(TS-하라플랙스 α(TS-Haraflax α))을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 2의 4-(1-하이드록시뷰탄-2-일)-2,6-디메틸-1,3-디옥산(4-(1-hydroxybutan-2-yl)-2,6-dimethyl-1,3-dioxane)화합물에 관한 것이다.

[화학식 2]

상기 화학식 2의 화합물은 신서란(Phormium tenax)이라고도 불리우는 하라케케 식물의 잎에서 추출된 물질이다.

본 발명에서는 하라케케 식물의 잎에서 추출된 상기 화학식 2의 화합물을 TS-하라플랙스(TS-Haraflax)로 명명하기로 한다.

상기 분리 및 정제 과정의 일 실시예는 하기와 같다.

에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 7:3의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 잎을 일주일 동안 침적시킨 후 필터하여 하라케케 잎 침출액을 얻는다.

상기 하라케케 잎 침출액을 디클로로메탄 및 물로 분획하여 디클로로메탄 분획 및 물 분획을 얻는다.

상기 디클로로메탄 분획을 n-헥센 용매와 혼합한 후, 아세톤을 가하여 순서대로 4개의 분획을 얻는다.

상기 4개의 분획 중, 두번째로 얻어진 분획을 아세톤:물을 4:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 RP-18 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 아세톤:물을 3:2의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 RP-18 컬럼크로마토그래피를 실시하여 2가지 화합물(PT-A 및 PT-B)을 얻는다.

또한, 상기 4개의 분획 중, 세번째로 얻어진 분획을 디클로로메탄:메탄올을 1:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 Sephandex LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 아세톤:물을 3:2의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 RP-18 컬럼크로마토그래피를 실시하여 3가지 화합물(PT-C, PT-D 및 PT-E)을 얻는다.

상기 5가지 화합물을 각각 동정하여 신규한 화합물은 상기 화학식 2(TS-하라플랙스(TS-Haraflax))를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2의 4-(1-하이드록시뷰탄-2-일)-2,6-디메틸-1,3-디옥산(4-(1-hydroxybutan-2-yl)-2,6-dimethyl-1,3-dioxane)화합물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화장료 조성물은 상기 화학식 1 또는 2의 화합물을 포함함으로써, 노화방지, 보습 및 미백 등의 효과를 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 9:1 내지 6:4의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 뿌리 또는 잎을 침적하여 추출하는 것을 특징으로 하는 하라케케 추출물 제조 방법에 관한 것이다.

상기 방법으로 제조된 하라케케 추출물은, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 포함할 수 있다.

상기 부피비는 바람직하게는 8:2 내지 7:3, 가장 바람직하게는 7:3이다.

상기 부피비의 혼합 용매에 하라케케 뿌리 또는 잎을 약 일주일 동안 침적시켜 분리 및 정제 과정을 거친 후, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 얻을 수 있다. 바람직하게는 하라케케 뿌리 추출물에서는 상기 화학식 1의 화합물, 하라케케 잎 추출물에서는 상기 화학식 2의 화합물을 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 화학식 1의 추출

에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 7:3의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 뿌리를 일주일 동안 침적시킨 후 필터 페이퍼(Advantec 5C)로 필터하여 하라케케 뿌리 침출액을 얻고, 50% 부피로 농축시켰다.

상기 하라케케 뿌리 침출액을 디클로로메탄 및 물로 분획하여 디클로로메탄 분획(CH₂Cl₂ fraction, B 분획, 98 mg) 및 물 분획(C 분획)을 얻었다.

상기 디클로로메탄 분획을 n-헥센 용매와 혼합한 후, 아세톤을 가하여 아세톤의 농도를 높여가면서 3개의 분획(B-1(17.3 mg), B-2(31.5 mg), B-3(49.2 mg))을 얻었다.

상기 3개의 분획 중, 두번째로 얻어진 B-2 분획을 헥센:에틸에세테이트를 18:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 메탄올:아세톤:물을 10:1:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 역상 YMC RP-18 컬럼크로마토그래피를 실시하여 4가지 화합물(35D-PT-2(4.3 mg), 35D-PT-3(1.3 mg), 35D-PT-4(2.3 mg) 및 35D-PT-7(4.6 mg))을 얻었다(도 1).

상기 세번째로 얻어진 B-3 분획을 헥센:에틸에세테이트를 10:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 분석하였으나, 대부분의 화합물이 1,3-부틸렌글리콜이었다.

상기 B-2 분획에서 얻어진 4가지 화합물의 구조를 동정하였다.

¹H-NMR, ¹³C-NMR, 2D-NMR 스펙트럼으로 HMQC, HMBC 및 COSY 스펙트럼을 측정하였다.

( 1)35D -PT-2

35D-PT-2 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 35D-PT-2 화합물은 (4R,6R)-4-(2-hydroxyethyl)-2,2,6-trimethyl-1,3-dioxane으로 동정하였으며, 기존에 보고되지 않은 천연에서 처음으로 분리된 신규물질로 동정한 바, 신규한 물질인 것이 확인되었다.

본 발명에서는 상기 신규한 물질을 TS-하라플랙스 α(TS-Haraflax α)로 명명하기로 한다.

상기 35D-PT-2의 구조는 하기 화학식 1이며, 문헌에 보고된 화학식 1a 및 1b와 비교한 δ값을 하기 표 1에 나타내었다.

[화학식 1]

Chemical fomula : C₈H₁₆O₃

분자량 : 160

상기 화학식 1의 HMBC 및 COSY는 하기와 같다.

상기 HMBC는 수소(H)로부터 2 내지 4번째 결합되어 있는 탄소의 구조를 확인하는 것이며, 상기 COSY는 기준이 되는 수소로부터 3번째 결합까지의 탄소의 위치를 확인하는 것을 의미한다.

[화학식 1a]

[화학식 1b]

Position	화학식 1a	화학식 1b	δ _C ^a,b	δ _H ^a,c (mult., J in Hz)
1	-	-	-	-
2	98.60	98.4	98.49	4.67 (m)
3	-	-	-	-
4	75.98	65.6	75.60	3.81 (m)
5	37.83	40.1	38.33	1.27 m/1.44 (m)
6	75.20	65.1	72.37	3.72 (m)
7	37.35	39.3	37.91	1.66 (m)/1.78 (m)
8	60.74	60.1	60.32	3.73 (m)
9	21.23	-	21.22	1.28 (d, 6.0)
10	-	22.2	21.60	1.18 (d, 6.0)

종래의 알려진 화합물인 화학식 1a 및 화학식 1b를 레퍼런스로 하여, 본 발명의 화학식 1의 구조를 알 수 있었으며, 본 발명의 화학식 1은 신규한 물질인 것을 확인하였다.

( 2)35D -PT-3

35D-PT-3 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 35D-PT-3 화합물은 Stigmast-5en-3β-ol로 동정하였다.

상기 35D-PT-3의 구조는 하기 화학식 3이며, NMRδ값을 하기 표 2에 나타내었다.

[화학식 3]

Chemical fomula : C₂₉H₅₀O

분자량 : 414

Position	Ref. [1]	δ _C ^a,c	δ _H ^a,b (mult., J in Hz)
1	37.27	37.19	1.31 (m)/1.56*
2	31.64	31.59	1.52 (m)/1.27 (m)
3	71.77	71.79	3.53 (tt, 5.1, 11.7)
4	42.29	42.24	1.96 (m)/2.20 (m)
5	140.76	140.83	-
6	121.69	121.77	5.36 (br d, 5.1)
7	31.92*	31.84*	1.95/2.19
8	31.92*	31.84*	1.28*
9	50.15	50.09	1.17*
10	36.51	36.44	-
11	21.10	21.00	1.35 (m)/1.63 (m)
12	39.80	39.72	1.32*/1.57 (m)
13	42.33	42.24	-
14	56.78	56.73	1.04 (m)
15	24.31	24.22	1.89*/1.65 (m)
16	28.25	28.18	1.90/1.66
17	56.08	46.01	1.12 (m)
18	11.89	11.76	0.68 (s)
19	19.39	19.31	1.01 (s)
20	36.15	36.08	1.29 (m)
21	18.80	18.69	0.92 (d, 6.5)
22	33.96	33.88	1.18*
23	26.11	25.99	1.20*
24	45.85	45.78	1.10 (m)
25	29.18	29.07	1.55*
26	19.82	19.73	0.85 (d, 7.5)
27	19.05	18.94	1.41 (m)
28	23.08	22.98	0.81 (d, 6.5)
29	11.99	11.89	0.83 (t, 7.5)

( 3)35D -PT-4

35D-PT-4 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 35D-PT-4 화합물은 (9Z,12Z,15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid (linolenic acid)로 동정하였다.

상기 35D-PT-4의 구조는 하기 화학식 4이며, NMRδ값을 하기 표 3에 나타내었다.

[화학식 4]

Chemical fomula : C₁₈H₃₀O₂

분자량 : 278

Position	Ref. [1]	δ _C ^a,b	δ _H ^a,c (mult., J in Hz)
1	180.3	180.52	-
2	34.0	34.16	2.34 (t, 7.6)
3	24.5	24.72	1.64 (br m)
4	28.9	29.10	1.32 (br s)
5	28.9	29.14	1.32 (br s)
6	29.4	29.64	1.32 (br s)
7	29.0	29.22	1.32 (br s)
8	27.0	27.27	2.07; 2.12
9	127.0*	127.32	5.30-5.43 (m)
10	127.6*	127.96	5.30-5.43 (m)
11	25.5	25.69	2.80 (t, 6.0)
12	128.1*	128.49	5.29-5.43 (m)
13	128.1*	128.48	5.30-5.43 (m)
14	25.4	25.61	2.80 (t, 6.0)
15	130.1*	130.44	5.29-5.43 (m)
16	131.8*	132.16	5.29-5.43 (m)
17	20.4	20.62	2.07 (m)/ 2.12 (m)
18	14.1	14.32	0.97 (t, 7.2)

( 4)35D -PT-7

35D-PT-7 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 35D-PT-7 화합물은 (2S)- 4'-hydroxy-7-methoxyflavane로 동정하였다.

상기 35D-PT-7의 구조는 하기 화학식 5이며, NMRδ값을 하기 표 4에 나타내었다.

[화학식 5]

Chemical fomula : C₁₆H₁₆O₃

분자량 : 256

Position	Ref. [1]	δ _C ^a,b	δ _H ^a,c (mult., J in Hz)
2	77.6	77.75	4.96 (dd, 3.0, 10.2)
3	24.5	24.60	2.71 (m)/2.92 (m)
4	29.9	30.01	2.04 (m)/2.15 (m)
5	129.9	130.03	6.96 (d, 7.8)
6	107.4	107.50	6.46 (m)
7	159.1	159.09	-
8	101.6	101.62	6.45 (m)
9	155.9	155.32	-
10	113.9	113.99	-
1'	135.1	134.03	-
2'	127.4	127.73	7.29 (d, 8.5)
3'	116.3	115.42	6.83 (d, 8.5)
4'	156.9	155.94	-
5'	116.3	115.42	6.83 (d, 8.5)
6'	127.4	127.73	7.29 (d, 8.5)
OCH ₃	55.3	55.41	3.75 (s)

실시예 2. 화학식 2의 추출

에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 7:3의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 잎을 일주일 동안 침적시킨 후 필터 페이퍼(Advantec 5C)로 필터하여 하라케케 잎 침출액을 얻고, 50% 부피로 농축시켰다.

상기 하라케케 잎 침출액을 디클로로메탄 및 물로 분획하여 디클로로메탄 분획(CH₂Cl₂ fraction, B 분획, 98 mg) 및 물 분획(C 분획)을 얻었다.

상기 디클로로메탄 분획을 n-헥센 용매와 혼합한 후, 아세톤을 가하여 아세톤의 농도를 높여가면서 4개의 분획(B-1(189 mg), B-2(12 mg), B-3(28 mg), B-4(30 mg))을 얻었다.

상기 4개의 분획 중, 두번째로 얻어진 B-2 분획을 아세톤:물을 4:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 RP-18 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 아세톤:물을 3:2의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 RP-18 컬럼크로마토그래피를 실시하여 2가지 화합물(PT-A (2 mg), PT-B (5 mg))을 얻었다.

상기 4개의 분획 중, 세번째로 얻어진 B-3 분획을 디클로로메탄:메탄올을 1:1의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하고, 아세톤:물을 3:2의 부피비로 혼합한 혼합용매를 전개용매로 사용하여 RP-18 컬럼크로마토그래피를 실시하여 3가지 화합물(PT-C (2 mg), PT-D (3 mg), PT-E (3 mg))을 얻었다(도 6).

상기 B-2 및 B-3 분획에서 얻어진 5가지 화합물의 구조를 동정하였다.

( 1)PT -A

PT-A 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 PT-A 화합물은 linolenic acid로 동정하였다.

상기 PT-A의 구조는 하기 화학식 6이며, NMRδ값을 하기 표 5에 나타내었다.

[화학식 6]

Chemical fomula : C₁₈H₃₀O₂

분자량 : 278

Position	Ref. [1]	δ _C ^a,b	δ _H ^a,c (mult., J in Hz)
1	180.3	180.4	-
2	34.0	34.0	2.35 (t, 7.6)
3	24.5	24.6	1.64 (m)
4	28.9	28.9	1.33 (br s)
5	28.9	29.0	1.33 (br s)
6	29.4	29.5	1.33 (br s)
7	29.0	29.1	1.33 (br s)
8	27.0	27.1	2.07; 2.12
9	127.0	127.2	5.29-5.43 (m)
10	127.6	127.8	5.29-5.43 (m)
11	25.5	25.5	2.82 (t, 6.0)
12	128.1	128.3	5.29-5.43 (m)
13	128.1	128.3	5.29-5.43 (m)
14	25.4	25.4	2.82 (t, 6.0)
15	130.1	130.3	5.29-5.43 (m)
16	131.8	130.2	5.29-5.43 (m)
17	20.4	20.5	2.07; 2.12
18	14.1	14.2	0.98 (t, 7.2)

( 2)PT -B

PT-B 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 PT-B 화합물은 linoleic acid로 동정하였다.

상기 PT-B의 구조는 하기 화학식 7이며, NMRδ값을 하기 표 6에 나타내었다.

[화학식 7]

Chemical fomula : C₁₈H₃₂O₂

분자량 : 280

Position	Ref. [1]	δ _C ^a,b	δ _H ^a,c (mult., J in Hz)
1	178.9	177.7	-
2	33.8	34.8	2.21 (t, 8.0)
3	24.6	25.9	1.54 (m)
4	29.0	30.0	1.27 (m)
5	29.1	30.0	1.27 (m)
6	29.1	30.1	1.27 (m)
7	29.7	30.3	1.27 (m)
8	27.2	27.9	2.00 (m)
9	130.0	130.8	5.25-5.31 (m)
10	128.0	129.0	5.25-5.31 (m)
11	25.6	26.3	2.72 (t, 6.0)
12	127.9	129.0	5.25-5.31 (m)
13	130.0	130.8	5.25-5.31 (m)
14	27.2	27.9	2.80 (t, 8.0)
15	29.3	30.5	1.27 (m)
16	31.5	30.5	1.27 (m))
17	22.6	23.4	2.00 (m)
18	14.1	14.1	0.85 (m)

( 3)PT -C

PT-C 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 PT-C 화합물은 4-(1-hydroxybutan-2-yl)-2,6-dimethyl-1,3-dioxane으로 동정하였으며, 기존에 보고되지 않은 천연에서 처음으로 분리된 신규물질의 혼합물로 동정한 바, 신규한 물질인 것이 확인되었다.

본 발명에서는 상기 신규한 물질을 TS-하라플랙스(PT-C)로 명명하기로 한다.

상기 PT-C 의 구조는 하기 화학식 2이며, NMRδ값을 하기 표 7에 나타내었다.

[화학식 2]

Chemical fomula : C₁₀H₂₀O₃

분자량 : 188

[화학식 2a]

[화학식 2b]

Position	화학식 2a δ _C ^a,b	화학식 2a δ _H ^a,c (mult., J in Hz)	화학식 2b δ _C ^a,b	화학식 2b δ _H ^a,c (mult., J in Hz)
1	-	-	-	-
2	98.9	4.70*	98.7	4.70*
3	-		-	-
4	72.5*	3.75*	72.5*	3.75*
5	33.4	1.56* / 1.41*	36.7	1.56* / 1.41*
6	80.4	3.69	79.5	3.88
7	45.6	1.74	46.5	1.49
8	63.8	3.82* / 3.62*	63.2	3.82* / 3.62*
9	19.3	1.32*	20.4	1.32*
10	11.6	0.93*	12.2	0.93*
11	21.7	1.25*	21.7	1.25*

상기 *는 중복된 신호를 나타낸 것이다.

( 4)PT -D

PT-D 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 PT-D 화합물은 3-hydroxybutyl (Z)-but-2-enoate (mixture of PT-E (E form))로 동정하였다.

상기 PT-D의 구조는 하기 화학식 8이며, NMRδ값을 하기 표 8에 나타내었다.

[화학식 8]

Chemical fomula : C₈H₁₄O₃

분자량 : 158

Position	δ _C ^a,b	δ _H ^a,c (mult., J in Hz)
1	166.9	-
2	120.4	5.80 (dq, 1.2, 10.8)
3	145.9	6.36 (m)
4	15.5	2.15 (dd, 1.8, 7.2)
1'	61.5	4.16; 4.42 (m)
2'	38.3	1.73; 1.82 (m)
3'	64.9	3.89 (m)
4'	23.5	1.23 (d, 6.0)

( 5)PT -E

PT-E 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR의 케미컬 시프트(chemical shift)값을 문헌에 보고된 값과 비교한 결과, 상기 PT-E 화합물은 3-hydroxybutyl (E)-but-2-enoate 로 동정하였다.

상기 PT-E의 구조는 하기 화학식 9이며, NMRδ값을 하기 표 9에 나타내었다.

[화학식 9]

Chemical fomula : C₈H₁₄O₃

분자량 : 158

Position	δ _C ^a,b	δ _H ^a,c (mult., J in Hz)
1	167.0	-
2	122.5	5.85 (dq, 1.8, 15.6)
3	145.3	7.00 (dq, 6.6, 1.8)
4	18.1	1.90 (dd, 1.8, 7.2)
1'	61.5	4.44; 4.17 (m)
2'	38.3	1.82; 1.73 (m)
3'	64.9	3.88 (m)
4'	23.5	1.23 (d, 6.0)

상기 실시예 1 및 2에서 하라케케의 뿌리와 잎으로부터 cucurbitan은 분리되지 않았으며, 저분자 화합물을 타겟으로 하였으므로, 다당류는 제외되었다.

<화학식 1 또는 2를 포함하는 화장료 조성물>

실험예 1. 노화방지 효과 측정-인간 진피섬유아세포에서의 콜라겐 생성 촉진 및 분해 억제 평가

1-1. 세포배양

Cell은 인간 진피섬유아세포(Normal human dermal fibroblast; NHDF) (Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하였다. 배지는 Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone), 1% penicillin/streptomycin (10,000 units/ml penicillin G sodium, 10,000 μg/ml streptomycin; Gibco-BRL/Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

1-2. 세포독성 평가(Cell cytotoxicity )

화학식 2(TS-하라플랙스, PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(TS-하라플랙스 α, 35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)의 세포독성을 확인하기 위하여 실시한 Water-soluble tetrazolium salt (WST-1) assay는 세포 내의 미토콘드리아 탈수소효소에 의하여 tetrazolium salt를 유색의 formazan으로 환원시켜 세포 내 mitochondrial activity를 확인하는 검사법이다(Toimela T and Tahti H, 2004). NHDF 세포를 96-well plate에 2×10³ cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양시킨 후에 상기 화학식 2(TS-하라플랙스, PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(TS-하라플랙스 α, 35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)을 0, 2, 4, 6, 8 및 10μg/mL로 첨가하였다.

24시간 처리 후, 각 well에 WST-1용액(EZ-CYTOX, DOGEN, Korea)을 배지양의 10%씩 첨가하여 추가적으로 0.5 내지 1시간 동안 배양기에서 반응 시킨 후, iMark microplate reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 13). Reference 흡광도는 655 nm에서 측정하여 결과값을 보정하였다. 결과값은 세 번의 독립적 실험으로부터 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05는 Student's t-test를 통해 검증하였으며, 결과값의 유의성을 나타낸다.

1-3. 콜라겐 생성 관련 유전자의 mRNA 발현량 분석 (Quantitative real-time PCR assay)

세포 내 콜라겐 생성 정도를 확인하기 위해 해당하는 대표적 유전자의 mRNA 발현량 변화를 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)분석법을 활용하여 측정하였다(Marisa L et al, 2005).

본 시험에서 측정한 유전자는 type 1 collagen alpha 1 (COL1A1)으로 콜라겐 합성에 관여하는 대표적인 유전자이다(Lovell CR et al, 1987). NHDF 세포를 60mm culture dish에 3×10⁵ 개씩 분주하여 24시간 배양 후 적정농도의 시험물질을 첨가하였다. 24시간 동안 추출물을 처리 한 후, 1 ml의 TRIzol reagent (Life Technology)을 첨가하여 세포 용해 및 total mRNA 추출을 수행하였다. Total mRNA의 농도 및 순도(A260/A280 and A260/A230 ratio)는 MaestroNano® microvolume spectrophotometer (Maestrogen, Las Vegas, NV, USA)을 이용하여 검증하였으며, 2.0 이상의 순도가 높은 total mRNA만을 선별하였다.

Total mRNA는 M-MLV reverse transcriptase (Life Technologies, USA)를 이용하여 cDNA로 치환되었고, qRT-PCR 유전자 발현 측정시험에 사용하였다. qRT-PCR은 HOT FIREPol EvaGreen PCR Mix Plus (Solis BioDyne, Estonia)를 사용하여 수행하였으며, StepOnePlus RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 해당 유전자의 발현을 분석하였다.

PCR반응 조건은, 94에서 5분간 유전자의 변성과정을 거친 후, 변성(94, 30초), DNA primer의 결합(60, 30초), 중합효소에 의한 상보적 DNA의 합성(72, 30초)을 1 회로로 하여 총 40 회로를 진행하였다.

유전자의 발현량 변화 측정은 β-ACTIN의 유전자 발현량을 세포 내 대조군으로 사용하여 비교 측정하였으며, 실험 결과의 신뢰도 향상을 위하여 TGF-β를 양성대조 물질로 사용하였다(Chung JH et al, 1997). qRT-PCR 시험에 사용된 primer는 하기 표 10과 같다. 결과값은 세 번의 독립적 실험으로부터 평균값 ± 표준편차로 나타내었다(도 14). *P<0.05는 Student's t-test를 통해 검증하였으며, 결과값의 유의성을 나타낸다.

Primer set	Forward	Reverse
COL1A1	5'-AGGGCCAAGACGAAGACATC-3'	5'-AGATCACGTCATCGCACAACA-3'
β-ACTIN	5'-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3'	5'-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3'

실험 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 본 발명의 신규 화합물인 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 2(PT-C)는 매우 우수한 콜라겐 생성 관련 유전자의 발현 증가 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

1-4. 콜라겐 분해 관련 유전자의 mRNA 발현량 분석 (Quantitative real-time PCR assay)

세포 내 콜라겐 분해 정도를 확인하기 위해 해당하는 대표적 유전자의 mRNA 발현 변화를 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)분석법을 활용하여 측정하였다(Marisa L et al, 2005).

본 시험에서 측정한 유전자는 Matrix metalloproteinase 1 (MMP1)으로 콜라겐 분해에 관여하는 대표적인 효소의 유전자이다(Lovell CR et al, 1987). NHDF 세포를 60mm culture dish에 3×10⁵ 개씩 분주하여 24시간 배양 후 적정농도의 시험물질을 첨가하였다. 24시간 동안 추출물을 처리 한 후, 1 ml의 TRIzol reagent (Life Technology)을 첨가하여 세포 용해 및 total mRNA 추출을 수행하였다. Total mRNA의 농도 및 순도(A260/A280 and A260/A230 ratio)는 MaestroNano® microvolume spectrophotometer (Maestrogen, Las Vegas, NV, USA)을 이용하여 검증하였으며, 2.0 이상의 순도가 높은 total mRNA만을 선별하였다.

Total mRNA는 M-MLV reverse transcriptase (Life Technologies, USA)를 이용하여 cDNA로 치환하였고, qRT-PCR 유전자 발현 측정시험에 사용하였다. qRT-PCR은 HOT FIREPol EvaGreen PCR Mix Plus (Solis BioDyne, Estonia)를 사용하여 수행하였으며, StepOnePlus RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 해당 유전자의 발현을 분석하였다.

PCR반응 조건은, 94에서 5분간 유전자의 변성과정을 거친 후, 변성(94, 30초), DNA primer의 결합(60, 30초), 중합효소에 의한 상보적 DNA의 합성(72, 30초) 을 1 회로로 하여 총 40 회로를 진행하였다.

유전자의 발현량 변화 측정은 β-ACTIN 유전자 발현량을 세포 내 대조군으로 사용하여 비교 측정하였으며, 실험 결과의 신뢰도 향상을 위하여 TGF-β를 양성대조 물질로 사용하였다(Chung JH et al, 1997). qRT-PCR 시험에 사용된 primer는 하기 표 11과 같다. 결과값은 세 번의 독립적 실험으로부터 평균값 ± 표준편차로 나타내었다(도 15). *P<0.05는 Student's t-test를 통해 검증하였으며, 결과값의 유의성을 나타낸다.

Primer set	Forward	Reverse
MMP-1	5'-TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3'	5'-CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC-3'
β-ACTIN	5'-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3'	5'-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3'

실험 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 화합물인 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 2(PT-C)는 양성 대조군(PC)에 비해 매우 우수한 콜라겐 분해 관련 유전자의 발현 감소 효과는 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 2. 보습 효과 측정- 인간 각질형성세포에서의 보습관련 유전자 평가

2-1. 세포배양

Cell은 인간 각질형성세포는(HaCaT cell line) (CLS, Germany)를 사용하였다. 배지는 Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone), 1% penicillin/streptomycin (10,000 units/ml penicillin G sodium, 10,000 μg/ml streptomycin; Gibco-BRL/Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.

2-2. 세포독성 평가(Cell cytotoxicity )

화학식 2(TS-하라플랙스, PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(TS-하라플랙스 α, 35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)의 세포독성을 확인하기 위하여 Water-soluble tetrazolium salt (WST-1) assay를 실시하였다.

NHDF 대신 HaCaT를 사용한 것을 제외하고는 상기 1-2와 동일하게 실시하였다(도 16).

2-3. 보습 관련 유전자의 mRNA 발현량 분석 (Quantitative real-time PCR assay)

본 시험에서 측정한 유전자는 Hyaluronic acid synthase 2(HAS2)로 표피에서 Hyaluronic acid 합성에 관여하는 대표적인 유전자이다(Lovell CR et al, 1987). HaCaT 세포를 60mm culture dish에 3×10⁵ 개씩 분주하여 24시간 배양 후 적정농도의 시험물질을 첨가하였다. 24시간 동안 추출물을 처리 한 후, 1 ml의 TRIzol reagent (Life Technology)을 첨가하여 세포 용해 및 total mRNA 추출을 수행하였다. Total mRNA의 농도 및 순도(A260/A280 and A260/A230 ratio)는 MaestroNano® microvolume spectrophotometer (Maestrogen, Las Vegas, NV, USA)을 이용하여 검증하였으며, 2.0 이상의 순도가 높은 total mRNA만을 선별하였다.

유전자의 발현량 변화 측정은 β-ACTIN의 유전자 발현량을 세포 내 대조군으로 사용하여 비교 측정하였다(도 17). 상기 β-ACTIN은 외부자극에 따라 유전적인 발현을 하지 않는 유전자로, 실험이 올바르게 수행되었는지 또는 처리한 시료의 세포 발현량이 일정한 상태로 실시되었는지를 보는 지표 유전자이다.

qRT-PCR 시험에 사용된 primer는 하기 표 12와 같다. 결과값은 세 번의 독립적 실험으로부터 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05는 Student's t-test를 통해 검증하였으며, 결과값의 유의성을 나타낸다.

Primer set	Forward	Reverse
HAS2	5'- GAAAGGGCCTGTCAGTCTTATTT-3'	5'- TTCGTGAGATGCCTGTCATCACC-3'
β-ACTIN	5'-GACCTTTGCCATGTGCTTCCT-3'	5'-CCAAAAACTATTCCAGCACCCA-3'

실험 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 화합물인 화학식 1(35D-PT-2) 및 화학식 2(PT-C)는, 매우 우수한 보습 관련 유전자의 발현 증가 효과는 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 3. 미백 효과 측정- 멜라닌 생성세포에서의 멜라닌 생성 억제 활성 평가

3-1. 세포 배양(Cell culture)

Cell은 쥐의 melanoma 세포주인 B16F10 Cell line (ATCC, Manassas, VA, USA) 을 사용하였다. 배지는 Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone), 1% penicillin/streptomycin (10,000 units/mL penicillin G sodium, 10,000 μg/mL streptomycin; Gibco-BRL/Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) 을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

3-2. 세포독성(Cell cytotoxicity)

B16F10 세포를 96-well plate에 2×10³ cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양시킨 후에 화학식 2(TS-하라플랙스, PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(TS-하라플랙스 α, 35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)을 0, 2, 4, 6, 8 및 10μg/mL(저농도), 0, 10, 20, 30, 40 및 50μg/mL(고농도)로 첨가한다. 48시간 후, 각 well에 WST-1용액(EZ-CYTOX, DOGEN, Korea)을 배지양의 10%씩 첨가하여 추가적으로 0.5~1시간 동안 배양기에서 반응 시킨 후, iMark microplate reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 18 및 19). Reference 흡광도는 655 nm에서 측정하여 결과값을 보정하였다.

3-3. 멜라닌량 측정(melanin contents assay)

화학식 2(TS-하라플랙스, PT-C), 화학식 8(PT-D), 화학식 9(PT-E), 화학식 1(TS-하라플랙스 α, 35D-PT-2) 및 화학식 5(35D-PT-7)에 의한 멜라닌형성(melanogenesis) 저해능을 알아보기 위해 melanin contents assay를 이용하여 측정하였다(Eisinger M et al, 1982; Siegrist W and Eberle AN, 1986).

B16F10 세포를 60 mm culture dish에 1.5x10⁵cells/well로 접종한 후 24시간동안 배양하였다. 그 후, 멜라닌 형성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 시험물질을 배지에 같이 처리하였다(Virador VM et al, 1999).

48시간 후, 세포를 수확하여 PBS로 1회 세척 후, 1N NaOH lysis buffer 120㎕를 넣고 95에서 10분간 끓여 세포를 용해하였다. 이 후, microplate reader를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 음성대조군(무처리군), 양성대조군(α-MSH 처리군), 실험군의 멜라닌 색소를 비교 분석하였다(도 18 내지 20).

실험 결과, 도 18 내지 20에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 화합물인 화학식 1 및 화학식 2는, 멜라닌 생성저해를 통한 미백 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]
청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하라케케 뿌리로부터 추출된 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 2에 있어서, 상기 추출은 에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 9:1 내지 6:4의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 뿌리를 침적하여 추출하는 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식 2의 4-(1-하이드록시뷰탄-2-일)-2,6-디메틸-1,3-디옥산(4-(1-hydroxybutan-2-yl)-2,6-dimethyl-1,3-dioxane)화합물:
[화학식 2]
청구항 4에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은 하라케케 잎으로부터 추출된 것을 특징으로 하는 화합물.
청구항 5에 있어서, 상기 추출은 에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 1:9 내지 4:6의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 잎을 침적하여 추출하는 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2의 4-(1-하이드록시뷰탄-2-일)-2,6-디메틸-1,3-디옥산(4-(1-hydroxybutan-2-yl)-2,6-dimethyl-1,3-dioxane)화합물을 포함하는 화장료 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]
청구항 7에 있어서, 상기 화장료 조성물은 노화방지용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 화장료 조성물은 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜을 9:1 내지 6:4의 부피비로 혼합한 혼합용매에 하라케케 뿌리 또는 잎을 침적하여 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 추출하는 것을 특징으로 하는, 하라케케 추출물 제조 방법:
[화학식 1]

[화학식 2]
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