KR100967805B1

KR100967805B1 - 새우나무 잎 추출물을 포함하는 피부주름 개선용 화장료조성물

Info

Publication number: KR100967805B1
Application number: KR1020080037349A
Authority: KR
Inventors: 유병삼; 임자훈; 김재우; 문지영; 윤명석; 김철수; 김대신
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2008-04-22
Publication date: 2010-07-05
Also published as: KR20090111641A

Abstract

본 발명은 주름개선 효과를 갖는 새우나무(Ostrya japonica Sarg) 잎 추출물에 관한 것으로, 새우나무(Ostrya japonica Sarg) 잎 추출물이 우수한 항산화활성 및 MMP-1을 저해함과 동시에 콜라겐 합성을 촉진하는 효과가 있음을 밝혀 피부주름개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

새우나무, 화장료, 피부주름, 항산화, MMP-1, 콜라겐합성촉진

Description

새우나무 잎 추출물을 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물 {cosmetic compositions containing extract of Ostrya japonica Sarg used for antiwrinkle}

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 새우나무 잎 추출물에 관한 것으로, 새우나무 잎 추출물이 우수한 항산화활성 및 MMP-1을 저해함과 동시에 콜라겐 합성을 촉진하는 우수한 효과가 있음을 밝혀 피부주름 개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

사람의 피부는 25세를 전후해서 노화가 촉진되는데 자연노화와 외적노화로 구분되며, 자연노화는 유전적 요소에 주로 기인하므로 조절하기 어렵다. 외적노화는 오염물과 먼지, 공해, 자외선 등 외부 요인에 의해 발생하므로 인위적 조절이 가능하다. 이 중 특히 피부가 자외선에 노출 되었을 때 섬유아세포에서 활성산소종이 생성되어 콜라게네이즈(collagenase, 이하 "MMP-1"라 한다)의 발현이 유도된다.(Yoshiharu Kawaguchi et al. ,1996)

MMP-1은 세포의 기질인 콜라겐을 분해하는 효소로서 기질 금속단백질분해효소(matrixmetalloprpteinase, 이하 'MMP'라 칭함)의 한 종류이다.

MMP-1은 콜라겐 타입 I을 분해한다. 따라서 MMP-1의 발현이 유도되면 콜라겐 의 합성이 감소하여 피부에 주름이 발생하게 된다.(Laure Rittie et al., 2002)

항산화물질은 동·식물체 및 미생물에 이르기까지 자연계에 널리 분포하는 물질로서 산화적피해를 야기하는 프리라디칼을 억제하여 피부노화를 예방하고 억제할 수 있다.

지금까지 연구 보고된 주름완화 및 피부노화 예방 물질로는 레티놀, 아데노신, AHA 등이 개발되어 있으나 안전성이 떨어지며 피부자극을 유발하고 뚜렷한 가시적인 효과가 미흡하다는 문제점을 안고 있다. 따라서 앞선 문제점들을 보완할 수 있는 주름개선 및 피부노화예방 소재 연구가 필요한 상황이다.

새우나무는 자작나무과 식물로서 산 중턱 이하의 산골짜기에 나는 낙엽관목으로 20m가량 자라며, 잎은 호생, 난형 또는 난상 타원형이며 길이는 5~13cm이고, 폭은 3~5㎝ 정도 자란다. 가장자리에 겹톱니가 있고, 양면에 곧게 선 잔털이 있으며, 개화기는 5월이다. 우리나라 남부지방 특히 제주도에 자생하며, 함지박용, 신탄재로 쓰이고 있다. 새우나무의 성분으로는 새우나무 수피 추출물에서 5종류의 phenolics(Mokuzai Gakkaishi et . al . 1995)와 3종류의 p-hydroquinone 당 유도체들(Mokuzai Gakkaishi et . al.1995)이 보고되어졌다. 또한 새우나무 수피 추출물에서 중금속 흡착 능력이 있다(Cellulose Chemistry and Technology et . al 1993)고 보고되었으며, 이것의 잎 추출물에서는 집먼지 진드기에 의한 알레르기원들의 강도를 약화시키는 중화제 성분이 포함되어 있다고 보고 되어있으나(공개특허 10-2007-0065927) 현재까지 새우나무 잎 추출물에 대한 생리활성 연구는 활발히 진행되어 있지 않다.

본원 발명은 천연유래추출물을 함유하는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것으로, 새우나무 잎 추출물이 피부주름개선에 효과가 있음을 밝혀 이를 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 새우나무(Ostrya japonica Sarg) 추출물에 관한 것으로, 구체적으로는 새우나무 잎 추출물이 MMP-1을 저해하며, 콜라겐합성을 촉진하는 효과가 있음을 밝혀 새우나무 잎 추출물을 함유하는 피부주름 개선용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 새우나무 추출물을 제조하기 위한 추출용매로는 메탄올, 에탄올, 등이 있으며, 에탄올이 가장 바람직하다.

본 발명의 피부주름 개선용 화장료조성물은 새우나무 잎 추출물을 조성물 전체 중량의 0.005 내지 1 중량% 함유한다.

0.005 중량% 이하 함유시는 본 발명의 피부주름개선효과를 기대하기 어렵고, 1 중량% 이상 함유시는 제제화에 어려움이 있을 수 있다.

본 발명의 피부주름 개선용 화장료조성물은 일반화장수, 크림제, 맛사지팩 등으로 제공될 수 있으며, 통상적인 제제화 방법에 따라 제형화할 수 있다.

본 발명의 새우나무 잎 추출물은 항산화활성이 우수하고, MMP-1을 저해함과 동시에 콜라겐합성을 촉진하는 효과가 있으며, 또한 피부에 대한 자극이 없으므로 피부주름개선용 화장료조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

실시예 1: 새우나무 잎 에탄올추출물 제조

새우나무 잎을 채취하여 시료를 정제수로 세척하고 건조하여 분쇄하였다. 건조 분쇄된 새우나무 잎 100g을 80중량% 에탄올 2L로 상온에서 초음파를 이용하여 4시간 동안 2회 반복 추출한 다음 어드반택 NO.4(제조판매원: Toyo Roshi Kaisha Ltd.) 여과포로 여과 하였다. 여액을 감압회전농축기를 이용하여 건조중량 18.49g을 얻었다.

실시예 2: 새우나무 잎 에탄올추출물의 용매 분획물 제조

실시예 1에서 얻은 새우나무 잎 에탄올추출물 10g을 충분한 용량의 증류수에 용해한 후, 이것과 동일 부피의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가한 후 용매분획을 실시하여 헥산 분획물 1.194g, 클로로포름 분획물 1.220g, 에틸아세테이트 분획물 1.046g, 부탄올 분획물 1.925g을 얻어냈다.

실험예 1: DPPH 라티칼 소거활성능력 측정에 의한 항산화 효능 평가

본 실험예에서는 수득한 시료들의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하여 항산화력을 확인하였다. 추출물들의 항산화능력을 기존의 항산화제인 vitamin C와 비교 측정하였다. DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴히드라진) 2.96㎎을 에탄올 50㎖에 녹여 0.2mM DPPH 용액을 만들었다. 항산화능을 측정하고자 하는 시료를 에탄올에 녹여 희석한 96공 평판 플레이드에 150㎕씩 분주한 다음 DPPH 용액 150㎕를 시료액과 30 분간 반응시키고 microplate reader를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 대신 에탄올을 넣은 반응액을 대조군으로 하여 라디칼 소거능력을 측정하였다. 이때 사용된 계산식은 아래와 같다.

Scavenge(%) = {1-(A-B)/C}×100

A : 시료액과 DPPH 용액을 반응시킨 실험군의 흡광도

B : 시료액 자체 흡광도

C : 에탄올과 DPPH 용액을 반응시킨 실험군의 흡광도

DPPH 라티칼 소거 효과

시료	DPPH Scavenge(%)				SC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)
	1	10	50	100
새우나무 잎 에탄올추출물	8.32	32.52	92.09	94.12	23.80
새우나무 잎 에탄올추출물의 헥산 분획물	6.02	8.88	17.31	27.46	>100
새우나무 잎 에탄올추출물의 클로로포름 분획물	6.78	15.30	46.61	73.84	54.06
새우나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획물	7.55	50.03	94.55	95.50	7.68
새우나무 잎 에탄올추출물의 부탄올 분획물	9.51	37.03	93.87	94.63	22.29
	1	5	10	-	-
Vitamin C	7.68	43.27	93.90	-	5.51

표 1에서 나타난 바와 같이 새우나무 잎 에탄올추출물의 자유라디칼 소거 효과는 농도 의존적으로 증가함을 확인하였고, 특히 위 추출물을 에틸아세테이트 용매 분획할 경우 약 3배가량 자유라디칼 소거 효과가 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 양성대조군인 vitamin C의 항산화활성에 비교할 경우 매우 우수함을 확인 할 수 있었다. 그리고 새우나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물에는 항산화 활성 유효지표물질이 존재할 것으로 예상 된다.

실험예 2: 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해 측정 실험

본 실험예에서는 수득한 시료들의 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해효과를 관찰하기 위해 수행 하였으며, 정제된 콜라게나제와 플루오레세인에 접합된 콜라겐의 이용을 기초로 한다. 먼저, 반응 완층액(0.05M Tri-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂, 0.02mM NaN₃, pH7.3) 100㎕에 0.25㎎/㎖의 DQ^TM콜라겐 용해액(Molecular probes, USA) 20㎕와 농도별 시료를 40㎕씩 첨가한 다음, 5Unit의 콜라게나제(GIBCO, USA) 40㎕와 잘 혼합하여 암소, 상온에서 20분간 반응하였다. 그 후 형광분광광도계를 이용하여 흡수파장 495nm, 방출파장 515nm에서 형광값을 측정하였다. 양성 대조군으로서는 실시예의 물질 대신 녹차추출물(S. Pillai, C. Oresajo, and J. Hayward, Int. J. Cosmet. Sci., 27, 17-34, 2005)을 사용하였다. 참고로, 녹차 추출물에 대한 콜라게네이즈 효소생성억제 작용은 대한민국 특허 특1999-0056976에 개시되어 있으며, 녹차 추출물이 자외선에 의한 콜라게네이즈 생성을 억제하며 홍반 및 과산화지질의 억제 정도가 탁월하여 화장료조성물로 활용이 가능하다고 밝힌바 있다.

각 시료의 콜라게나제의 활성 저해효과는 효소활성을 50% 소거하는 농도인 IC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 실험액의 형광값으로 하였다.

MMP-1 저해효과

시료	MMP-1 Inhibition(%)			IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)
	10	50	200
새우나무 잎 에탄올추출물	9.89	44.35	94.62	47.05
새우나무 잎 에탄올추출물의 헥산 분획물	12.12	23.62	31.55	>200
새우나무 잎 에탄올추출물의 클로로포름 분획물	16.77	28.38	66.45	136.00
새우나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획물	19.05	40.97	87.78	88.78
새우나무 잎 에탄올추출물의 부탄올 분획물	32.66	68.68	98.06	21.84
녹차추출물	24.65	27.87	57.76	159.78

표 2에서 나타난 바와 같이 새우나무 잎 에탄올추출물 및 이것의 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물에서 기존의 MMP-1 저해제로 잘 알려진 녹차추출물보다 더 높은 MMP-1 저해효과를 나타냄을 확인하였다. 특히 새우나무 잎 추출물을 부탄올 용매 분획할 경우 MMP-1 저해효과가 2배 이상 증가되었고, 녹차 추출물보다는 7배 이상 우수함을 확인하였다. 따라서 부탄올 분획물에서 주름개선 효능과 관련된 유효지표물질이 존재할 것으로 예상된다.

실험예 3: 콜라겐 합성 촉진 효과 측정 실험

본 실험예에서는 수득한 시료들의 콜라겐의 합성 촉진효과를 측정하기 위해서 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다.

96공 평판 배양기(96-well plate)에 5% 우태아혈청이 함유된 IMD(Iscove's Modified Dulbesco's Media) 배지와 함께 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 구입한 인간의 정상섬유아세포(CCD-985sk)를 5000 세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 10% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24시간 후 시료를 우태아혈청이 포함되지 않은 IMDM 배지에 농도별로 희석하여 2일 동안 처리하고 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 콜라겐 단백질 측정기구(Procollagen Type I-C-peptide EIA Kit(MK101), Takara. Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐(Procollagen) 타입 IC-펩타이드(Type IC-peptide : PICP) 합성양을 측정하였다.

측정방법은 우선 콜라겐 항체가 균일하게 도포되어 있는 96공 평판배양기에 POD(perosidase) 효소가 결합된 항체용액 100㎕와 채취된 세포배양액 20㎕를 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후 상등액을 모두 제거하고 각 well을 400㎕의 PBS(phosphate buffered saline)로 4회 세척하였다. 세척 후 각 well에 POD와 반응하는 기질용액 100㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위해 1N 황산용액 100㎕를 첨가하여 혼합한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. PICP양은 콜라겐 측정 키트에 포함되어 있는 표준용액을 희석하여 작성된 표준농도곡선에 샘플의 흡광도를 대입하여 계산하였다. 또한 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

콜라겐 합성 촉진 효과

시료	콜라겐 합성율(%, control)
	처리농도(㎍/㎖)
	0.5	1	2
새우나무 잎 에탄올추출물	134.77±3.94	138.03±2.95	140.26±7.97
새우나무 잎 에탄올추출물의 헥산 분획물	119.05±4.82	120.16±8.69	138.93±6.04
새우나무 잎 에탄올추출물의 클로로포름 분획물	138.54±6.80	138.82±18.94	140.66±8.82
새우나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획물	117.97±7.97	118.60±5.13	119.45±17.72
새우나무 잎 추출물의 부탄올 분획물	108.37±4.44	109.08±3.83	109.76±4.43
대조군	100

표 3에 나타난 바와 같이 새우나무 잎 에탄올추출물 및 이것의 모든 분획물들에서 대조군에 비교하여 콜라겐 합성율이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과로 새우나무 잎 추출물의 MMP-1 저해활성 효과를 재검증할 수 있었다.

실험예 4. 안전성 평가

본 실험예에서는 수득한 시료 추출물과 정제분획물 중 항산화활성이 우수했던 에틸아세테이트 분획의 인체 피부 일차 자극 시험에 의한 안전성 조사를 전문 임상 시험 기관인 (주)더마프로에 의뢰하여 수행하였다. 임상용 시료 추출물은 1,3-Buthylene glycol(1,3-BG) 용액에 1%(weight/volume)의 농도로 준비하였다.

임상 시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 여성 30명을 선정하였다. 피험자를 대상으로 등 부위에 시료물질을 도포한 후 48시간 후에 제거하였다. 제거 후 30분, 24시간 후에 시험부위를 관찰하였다. 피부 평가는 표 4의 기준으로 평가하였고, 48시간 및 72시간의 평균 반응도를 비교하였으며, 각 물질에 대한 평균 반응도를 기준으로 하여 그 결과를 판정하였다.

Criterion about the responses after human skin patch test.

Symbol	Grade	Clinical observation
+	1	Slight erythema, either spotty or diffuse
++	2	Moderate uniform erythema
+++	3	Intense erythema with edema
++++	4	Intense erythema with edema & vesicles

인체 피부 일차 자극 시험 결과

시료	No. of responder	48시간			72시간			반응도
시료	No. of responder	1+	2+	3+	1+	2+	3+	48h	72h	Mean
새우나무 잎 에탄올추출물	0	-	-	-	-	-	-	0.0	0.0	0.0
새우나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획물	0	-	-	-	-	-	-	0.0	0.0	0.0
대조군 (1,3-BG)	0	-	-	-	-	-	-	0.0	0.0	0.0

표 5에서 나타난 바와 같이 새우나무 잎 에탄올추출물 및 이것의 에틸아세테이트 분획물은 인체 피부 일차 자극 시험결과에서 자극이 없는 것으로 나타났다.

Claims

새우나무 잎 추출물을 포함하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
새우나무 잎 추출물에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가한 후 분획하여 얻은 1종 이상의 용매분획물을 포함하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 새우나무 잎 추출물은 에탄올 추출물이며, 새우나무 잎 추출물 또는 용매분획물의 함량은 조성물 전체중량의 0.005 내지 1 중량% 임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름개선효과가 콜라겐 합성 촉진 효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물.
삭제