KR101008833B1

KR101008833B1 - 팥배나무 잎 추출물을 포함하는 피부주름 개선용 화장료조성물

Info

Publication number: KR101008833B1
Application number: KR1020070131283A
Authority: KR
Inventors: 유병삼; 김재우; 문지영; 임자훈; 김기옥
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2011-01-19
Also published as: KR20090063789A

Abstract

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) 추출물에 관한 것으로, 팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) 잎 추출물이 우수한 항산화활성 및 elastase와 MMP-1을 저해함과 동시에 콜라겐합성을 촉진하는 효과가 있음을 밝혀 피부주름개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

팥배나무, 화장료, 피부주름, elastase, MMP-1, 콜라겐합성촉진

Description

팥배나무 잎 추출물을 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물 {cosmetic compositions containing extract of (Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) used for antiwrinkle}

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) 추출물에 관한 것으로, 팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch)잎의 추출물이 elastase와 MMP-1을 저해하며 콜라겐합성을 촉진하는 효과가 있음을 밝혀 피부주름 개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

사람의 피부는 25세를 전후해서 노화가 촉진되는데 자연노화와 외적노화로 구분되며 자연노화는 유전적요소에 주로 기인하므로 조절하기 어렵다. 외적노화는 오염물과 먼지, 공해 자외선 등 외부 요인에 의해 발생하므로 인위적 조절이 가능하다. 이 중 특히 피부가 자외선에 노출 되었을 때 섬유아세포에서 활성산소종이 생성되어 콜라게네이즈(collagenase, 이하 MMP-1)의 발현이 유도된다.(Yoshiharu Kawaguchi et al. ,1996)

MMP-1은 세포외 기질인 콜라겐을 분해하는 효소로서 기질 금속단백질분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 'MMP'라 칭함) 의 한 종류이다. MMP-1은 콜라겐 타입 I을 분해한다. 따라서 MMP-1의 발현이 유도되면 콜라겐의 합성이 감소하여 피부에 주름이 발생하게 된다.(Laure Rittie et al., 2002)

또한, 엘라스틴(elastin)는 콜라겐과 같이 피부 탄력에 관여하고 있는 주름 생성에 중요한 섬유 조직이다. 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스타아제의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름 생성 요인 중의 하나이다. 엘라스틴을 분해할 수 있는 유일한 효소인 엘라스타아제를 저해하는 것은 피부 주름을 근본적으로 줄여 줄 수 있다고 알려져 있다.

지금까지 연구보고된 주름완화 및 피부노화 예방 물질로는 레티놀, 아데노신, AHA 등이 개발되어 있으나 안정성이 떨어지며 피부자극을 유발하고 뚜렷한 가시적인 효과가 미흡하다는 문제점을 안고 있다. 따라서 앞선 문제점들을 보완할 수 있는 주름개선 및 피부노화예방 소재 연구가 필요한 상황이다.

한편, 팥배나무는 우리나라 전역 산지에 표고 100~1,300m에서 자생하며 낙엽활엽교목으로 군집성이 강하고 내한성,내음성이 강하며 건조지에서도 잘 자라고, 왕팥배나무의 과실을 수유과(水楡果) 라고하며 약용한다. 목재는 가구재 공예재로 쓰이고 관상가치가 높아 정원수, 공원수, 가로수로 많이 쓰이나 아직까지 팥배나무에 대한 생리활성 연구는 활발히 진행되어 있지 않다.

본원 발명은 천연유래추출물을 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하고자 하는 것으로, 팥배나무 추출물이 피부주름개선에 효과가 있음을 밝혀 이 를 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) 추출물에 관한 것으로, 팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) 잎의 추출물이 elastase와 MMP-1을 저해하며, 콜라겐합성을 촉진하는 효과가 있음을 밝혀 피부주름 개선용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 피부주름 개선용 화장료조성물은 팥배나무 추출물을 조성물 전체중량의 0.0001 내지 1 중량% 함유한다.

0.0001 중량% 이하 함유시는 본발명의 피부주름개선효과를 기대하기 어렵고, 1중량% 이상 함유시는 제제화에 어려움이 있을 수 있다.

본 발명의 피부주름 개선용 화장료조성물은 일반화장수, 크림제, 맛사지팩 등으로 제공될 수 있으며, 통상적인 제제화방법에 따라 제형화할 수 있다.

본 발명은 주름 개선 효과를 갖는 팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) 잎추출물에 관한 것으로, 팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) 잎 추출물은 우수한 항산화활성이 있고, 엘라스타제와 MMP-1을 저해함과 동시에 콜라겐합성을 촉진하는 효과가 있어 피부주름개선용 화장료조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

실시예 1: 팥배나무 잎 에탄올추출물의 제조

팥배나무 잎은 한라수목원에서 채취, 동정되었다. 시료를 정제수로 세척하고 건조하여 분쇄하였다. 건조 분쇄된 팥배나무 잎 150g을 80중량% 에탄올 5L로 상온에서 초음파를 이용하여 4시간 동안 추출한 후 어드반텍 NO. 4 (제조판매원:Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)여과포로 여과한다. 여액을 감압회전농축기를 이용하여 건조중량 23.4g 을 얻었다.

실시예 2: 팥배나무 잎 에탄올 추출물의 용매 분획물 제조

실시예 1에서 얻은 팥배나무 잎 에탄올추출물에 대해 용매분획을 실시하여 정제된 분획물들을 얻고자 하였다.

팥배나무 잎 에탄올추출물 12g을 통상적인 방법으로 용매분획을 실시하여 헥산 분획물 1.63g, 클로로포름 분획물 1.88g, 에틸아세테이트 분획물 1.21g, 부탄올 분획물 4.75g을 얻어냈다.

실시예 3: 팥배나무 잎 에탄올 추출물과 정제분획물의 DPPH 라디칼 소거활성능력 측정실험

본 실험예에서는 수득한 시료들의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하여 항산화력을 확인하였다. 추출물들의 항산화능력을 기존의 항산화제인 vitamin C와 비교 측정하였다.

DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴히드라진) 2.96mg을 에탄올 50㎖에 녹여 0.2mM DPPH 용액을 만들었다. 항산화능을 측정하고자 하는 시료를 에탄올에 녹여 희석하고 96공 평판 플레이드에 150㎕씩 분주한 다음 DPPH 용액 150㎕를 시료액과 30분간 반응시키고 microplate reader를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료대 신 에탄올을 넣은 반응액을 대조군으로 하여 라디칼 소거능력을 측정하였다. 이때 사용된 계산식은 아래와 같다.

Scavenge(%) = {1-(A-B)/C}×100

A : 시료액과 DPPH 용액을 반응시킨 실험군의 흡광도

B : 시료액 자체 흡광도

C : 에탄올과 DPPH 용액을 반응시킨 실험군의 흡광도

팥배나무 잎 에탄올 추출물과 분획물의 항산화능

시료	DPPH Scavenge(%)				SC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)
	1	10	50	100
팥배나무 잎 에탄올 추출물	4.22	26.54	89.73	93.83	20.64
팥배나무 잎 헥산 분획물	3.22	9.77	26.94	46.69	>100
팥배나무 잎 클로로포름 분획물	2.06	10.82	37.23	63.69	75.08
팥배나무 잎 에틸아세테이트 분획물	3.93	48.81	94.35	95.00	10.39
팥배나무 잎 부탄올 분획물	5.10	43.80	93.82	94.76	11.14
Vitamin C	14.07	59.96	96.68	-	5.71

표 1에서 나타난 바와 같이 팥배나무 잎 에탄올 추출물의 자유라디칼 소거 효과는 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. 특히, 에틸아세테이트와 부탄올 정제 분획물에서 에탄올 추출물의 경우 보다 약 2배 더 높은 항산화 활성능력을 나타내었다.

실시예 4: 팥배나무 잎 에탄올 추출물과 정제분획물의 엘라스타아제(elastase)의 활성저해측정

본 실시예에서 수득한 시료들의 엘라스타아제 활성 저해 효과를 관찰하기 위해 수행 하였다. 먼저, 트리스 완충액(0.2M Tris buffer, pH8.00) 140㎕와 농도별 시료20㎕, 그리고 5mM N-Succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide(Sigma, S4760) 20㎕씩 기질용액을 첨가한 다음, 10㎍/ml의 elastase(Sigma, E7885) 20㎕와 잘 혼합하여 상온(25℃)에서 15분간 반응시킨 후 410nm에서 생성된 p-nitroaniline의 양을 측정하였다. 양성 대조군으로서는 빈랑자 추출물(대한민국 특허 출원 :1997-78817, 1999-0056924 ; Int. J. Cosmet. Sci., 21 , 71-82, 275-295, 1999)을 사용하였다. 각 시료의 엘라스타아제 활성 저해효과는 효소활성을 50% 소거하는 농도인 IC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 실험액의 흡광도 값으로 하였다.

팥배나무 잎 에탄올 추출물과 정제 분획물의 elastase 저해효과

시료	elastase inhibition(%)				IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)
	1	10	50	100
팥배나무 잎 에탄올 추출물	13.21	25.61	43.21	53.77	96.00
팥배나무 잎 헥산 분획물	10.86	14.68	14.57	24.64	>100
팥배나무 잎 클로로포롬 분획물	10.11	20.23	43.19	64.84	68.95
팥배나무 잎 에틸아세테이트 분획물	8.05	8.77	20.50	47.64	>100
팥배나무 잎 부탄올 분획물	14.80	10.2	22.42	38.55	>100
빈랑자 추출물	17.98	31.61	62.82	-	34.68

표 2에서 나타난 바와 같이 모든 용매 분획물에서 농도 의존적으로 엘라스타아제 저해활성이 나타났으며, 그중에서 클로로포름 분획물은 팥배나무 잎 에탄올 추출물보다 약 1.4배 더 높은 저해 효과를 나타내었다.

실시예 5: 팥배나무 잎 에탄올 추출물과 정제분획물의 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해 측정

본 실시예에서는 수득한 시료들의 콜라게나제(MMP-1)의 활성 저해효과를 관찰하기 위해 수행 하였으며 정제된 콜라게나제와 플루오레세인에 접합된 콜라겐의 이용을 기초로 한다.

먼저, 반응 완충액(0.05M Tris-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂, 0.02mM NaN₃, pH7.3) 100㎕에 0.25㎎/㎖의 DQ^TM콜라겐 용해액(Molecular probes, USA) 20㎕와 농도별 시료를 40㎕씩 첨가한 다음, 5 Unit의 콜라게나제(GIBCO, USA) 40㎕와 잘 혼합하여 암소, 상온에서 20분간 반응하였다. 그 후 형광 분광광도계를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚에서 형광값을 측정하였다. 양성 대조군으로서는 실시예의 물질 대신 녹차추출물(S. Pillai, C. Oresajo, and J. Hayward, Int. J. Cosmet.Sci., 27, 17-34, 2005)을 사용하였다.

참고로, 녹차 추출물에 대한 콜라게네이즈 효소생성억제 작용은 대한민국 특허 특1999-0056976에 개시되어 있다. 각 시료의 콜라게나제의 활성 저해효과는 효소활성을 50% 소거하는 농도인 IC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 실험액의 형광값으로 하였다.

팥배나무 잎 에탄올 추출물과 정제분획물의 MMP-1 저해효과

시료	MMP-1 Inhibition(%)			IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)
	10	50	200
팥배나무 잎 에탄올 추출물	16.99	50.94	97.62	47.82
팥배나무 잎 헥산 분획물	17.95	19.16	26.74	>200
팥배나무 잎 클로로포롬 분획물	11.02	22.70	65.20	146.46
팥배나무 잎 에틸아세테이트 분획물	29.44	41.44	91.19	74.36
팥배나무 잎 부탄올 분획물	27.10	75.97	99.15	22.62
녹차추출물	17.43	32.93	56.29	142.54

표 3에서 나타난 바와 같이 팥배나무 잎 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 및 부탄올 정제분획물들은 기존의 MMP-1 저해제로 잘 알려진 녹차추출물보다 더 높은 MMP-1 저해효과를 나타냄을 확인하였다. 특히 팥배 잎 에탄올추출물의 부탄올 분획물은 녹차추출물 보다 6배 이상 높은 저해 활성을 나타내었다. 따라서 부탄올 정제분획물에 MMP-1 활성을 저해하는 유효 물질이 존재할 것으로 예상된다.

실시예 6: 팥배나무 잎 에탄올 추출물과 정제분획물의 콜라겐 합성 촉진 효과 측정

본 실시예에서는 수득한 시료들의 콜라겐 합성 촉진효과를 측정하기위해서 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다.

96공 평판배양기(96-well plate)에 5% 우태아혈청이 함유된 IMDM(Iscove's Modified Dulbesco's Media) 배지와 함께 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 구입한 인간의 정상섬유아세포(CCD-985sk)를 5000 세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 10% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24시간 후 시료를 우태아혈청이 포함되지 않은 IMDM 배지에 농도별로 희석하여 2일 동안처리하고 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 콜라겐 단백질 측정기구(Procollagen Type I-C-peptide EIA Kit(MK101), Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐(Procollagen) 타입 I C-펩타이드(Type I C-peptide : PICP) 합성양을 측정하였다.

측정방법은 우선 콜라겐 항체가 균일하게 도포되어 있는 96공 평판배양기에 POD(perosidase)효소가 결합된 항체용액 100㎕와 채취된 세포배양액 20㎕를 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후 상등액을 모두 제거하고 각 well을 400㎕의 PBS(phosphate buffered saline)로 4회 세척하였다. 세척 후 각 well에 POD와 반응하는 기질용액 100㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위해 1N 황산용액 100㎕를 첨가하여 혼합한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. PICP양은 콜라겐 측정 키트에 포함되어 있는 표준용액을 희석하여 작성된 표준농도곡선에 샘플의 흡광도를 대입하여 계산하였다. 또한 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

팥배나무 잎 에탄올 추출물과 분획물의 콜라겐 합성 촉진 효과

시료	콜라겐 합성율(%, control) 처리농도(㎍/㎖)
시료	0.1	0.5	1
팥배나무 잎 에탄올 추출물	254.92±3.95	265.97±6.15	255.78±4.74
팥배나무 잎 헥산 분획물	259.34±11.10	262.67±11.50	203.94±9.15
팥배나무 잎 클로로포롬 분획물	233.68±9.73	209.45±15.88	202.38±16.40
팥배나무 잎 에틸아세테이트 분획물	229.65±5.71	232.27±12.19	176.31±14.73
팥배나무 잎 부탄올 분획물	193.30±1.87	204.63±5.33	175.03±0.95
대조군	100

표 4에 나타난 바와 같이 팥배나무 잎 에탄올 추출물과 정제된 분획물들 모두 시료를 처리하지 않은 대조군보다 2배 이상의 콜라겐 합성을 증가시켰음을 확인하였다.

실시예 7: SLS(Sodiul lauryl sulfate)에 의해 유발되는 세포독성 완화 효과

SLS(Sodiul lauryl sulfate)는 화장품에 첨가되는 계면활성제로 접촉성 피부염을 일으키는 대표적인 부식성 자극물질로 피부장벽 기능의 손실을 유발하며 경표피 수분손실을 증가시킨다. 본 실시예에서는 수득한 시료들의 인간 정상섬유아세포에 대한 SLS 자극완화 효과를 평가하고자 세포 배양 기술을 이용하여 실험을 수행하였다.

사람의 정상 섬유아세포 (Human normal fibroblast)를 IMDM 배지가 들어 있는 96-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고 (2x10⁴ 세포/well), 10% CO₂ 조건에서 37℃로 24시간 배양하였다. 상기 사람의 정상 섬유아세포는 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 구입하였다. 먼저 예비 실험을 통해 팥배나무 잎 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물이 10㎍/㎖ 농도 이내에서 세포 독성이 없음을 동일조건의 실험을 통해 확인하였다. 그 후 100㎍/㎖ SLS와 농도별로 희석된 각 시료를 동시에 처리하고 음성대조군으로 100㎍/㎖ SLS를 단독으로 처리하여 24시간동안 추가 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 각 웰 당 MTT 용액 [3-(4,5-Dimethyl-thiazole-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide : 2.0 ㎎/㎖] 50㎕를 첨가하였다. 4시간 동안 반응 후, MTT 용액을 제거하고 각 웰당 200㎕의 디메틸설폭시드 (DMSO :Dimethyl sulfoxide)용액을 가하여 20분간 교반하여 생성된 formazan을 녹였다. 마이크로플레이트 리더(microplate Reader)를 사용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하여 시료의 SLS에 의한 세포 독성 완화 효과를 확인하였다.

SLS에 의해 유도된 세포독성 완화효과

시료 (㎍/㎖)	세포생존률(%, control)
팥배나무 잎 에탄올 추출물(1) + SLS(100)	128.52
팥배나무 잎 에탄올 추출물(5) + SLS(100)	135.19
팥배나무 잎 에탄올 추출물(10) + SLS(100)	137.96
SLS(100)	46.51

표 5의 결과로부터 팥배나무 잎 추출물은 화장료 조성물에 포함되었을 때 계면활성제에 의해 나타날 수 있는 피부자극을 완화할 수 있는 물질임을 확인하였다.

Claims

팥배나무(Sorbus alnifolia (S. et Z.) K. Koch) 잎 추출물을 포함하는 피부주름개선용 화장료조성물.
제1항에 있어서, 팥배나무잎 추출물은 에탄올추출물 또는 에탄올추출물의 에틸아세이트분획물, 클로로포름분획물 또는 부탄올분획물이며, 그 함량은 조성물 전체중량의 0.0001 내지 1 중량% 임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름개선효과가 elastase의 활성저해효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름개선효과가 MMP-1의 활성저해효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름개선효과가 콜라겐합성촉진효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부세포독성 완화 효과가 있는 피부주름 개선용 화장료조성물.