KR20090089982A

KR20090089982A - 시로미 추출물을 포함하는 피부주름 개선효과를 갖는화장료 조성물

Info

Publication number: KR20090089982A
Application number: KR1020080015181A
Authority: KR
Inventors: 유병삼; 문지영; 김재우; 현진원; 김철수; 김대신
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2008-02-20
Filing date: 2008-02-20
Publication date: 2009-08-25

Abstract

본 발명은 피부주름개선 효과를 갖는 시로미(Empetrum nigrum var . japonicum)추출물을 함유하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 시로미 잎과 가지 추출물이 엘라스타아제와 콜라게네이즈(MMP-1)활성을 저해하고, 콜라겐합성을 촉진하는 효과가 있음을 밝혀 피부주름개선용 화장료조성물에 사용하고자 하는 것이다.

시로미, 엘라스타아제, 콜라게네이즈, 콜라겐합성 촉진

Description

시로미 추출물을 포함하는 피부주름 개선효과를 갖는 화장료 조성물 {Cosmetic compositions containing extract of Empetrum nigrum var. japonicum used for antiwrinkle}

사람의 피부는 25세를 전후해서 피부노화가 촉진된다. 피부노화와 관련하여 여러 이론이 제시되고 있으나, 크게 연령의 증가에 따라 나타나는 자연노화와 자외선에 의한 광노화로 나눌 수 있다(M. Wlaschek et al., J. Photochem. Photobiol. B. Biology, 63(41), 2001). 나이가 들면 섬유아세포의 작용과 세포수가 감소하여 섬유성분인 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)의 합성량이 줄어들고, 피부세포 내 수분이 손실되며, 각질층의 구조가 변화된다. 또한, 콜라게나아제(collagenase, 이하 MMP-1)의 작용이 증가하여 콜라겐의 가교된 형태가 증가함으로써 매끄러움, 보습, 팽팽함이 감소된다(Matsumura, Y. et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 195, 2004). 많은 양의 자외선에 노출되면 피부에는 높은 농도의 활성산소종(reactive oxygen species(ROS))이 생성된다. 피부는 복잡한 항산화 방어망이 발달되어 있어서 ROS에 대항하여 보호작용을 나타내지만, 계속된 활성산소의 공격은 피부의 효소적, 비효소적 항산화 방어체계의 불균형을 초래하여, 단백질, 지질, DNA와 같은 세포성분들에 대한 산화적인 스트레스를 유발한다(Cho, S. H. et al., J. Anim . Sci . & Technol. Kor. 48(4), 2006). 활성산소종은 진피의 extracellular matrix(ECM) 결합조직인 콜라겐 및 엘라스틴 분자의 절단 및 비정상적인 교차결합 등의 손상을 야기한다(Chung, J. H. et al., J. Invest. Dermatol., 117, 2001). 진피 층의 90%는 콜라겐으로 구성되어 있어 콜라겐의 감소는 피부노화와 밀접한 관계를 가진다(S. D. Shapiro et al., Curr . Opin . Cell Biol ., 10, 1998).

콜라겐은 가장 강력한 천연 단백질로서 피부의 중요한 구성물들을 지탱하고 있으면서 피부에 내구성과 탄력성을 부여해 주고 있다(Kim, Y. M. et al., Medical skincare & SPA, 2003). MMP-1은 세포외 기질인 콜라겐을 분해하는 효소로서 기질 금속단백질분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 'MMP'라 칭함)의 한 종류이다. MMP-1은 콜라겐 타입 I을 분해한다. 따라서 MMP-1의 발현이 유도되면 콜라겐의 합성이 감소하여 피부에 주름이 발생하게 된다(Laure Rittie et al., Ageing research reviews , 1(4), 2002).

또한, 엘라스틴(elastin)은 콜라겐과 같이 피부 탄력에 관여하고 있는 주름 생성에 중요한 섬유 조직이다. 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스타아제의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름 생성 요인 중의 하나이다. 엘라스틴을 분해할 수 있 는 유일한 효소인 엘라스타아제를 저해하는 것은 피부 주름을 근본적으로 줄여 줄 수 있다고 알려져 있다.

피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위해 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있으며, 지금까지 연구보고 된 주름완화 및 피부노화 예방 물질로는 레티놀, 아스코르브산, 아데노신, AHA, α-토코페롤 등이 개발되어 있다 그러나, 이들은 가격이 고가일 뿐만 아니라 화학적 안정성이 떨어지며, 피부자극을 유발하는 등의 문제점을 안고 있다. 따라서 앞선 문제점들을 보완할 수 있는 주름개선 및 피부노화 예방 소재 연구가 진행 중이다. 이런 사례 중 식물자원을 활용한 연구가 주를 이루고 있으며, 피부 주름 개선을 위한 화장료로는 피부노화억제효과를 갖는 산수유 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 그 제조방법(대한민국 특허출원번호 제 10-2002-12877호), 빈랑자 추출물을 함유하는 자유라디칼 소거 화장료 조성물(대한민국 특허출원번호 제 10-1999-56924호)등이 있다. 이러한 천연물을 이용한 피부 주름개선용 화장료는 레티놀 등에 비하여 피부 부작용이 적고, 화장료의 안전성 및 안정성이 우수하다는 장점이 있어, 피부 주름 개선용 화장료로 천연물을 이용한 연구가 지속되고 있다(대한민국 특허 출원번호 제 10-2005-0019550).

시로미(Empetrum nigrum var. japonicum)는 상록관목식물로서 시로미과(Empetraceae)에 속하며 북유럽, 시베리아, 아시아, 북미 등에 광범위하게 자란다.(Eshbaugh, W. Phil. Soc. 1968) 북반구의 북부 고산지역과 남아메리카의 고산 지역에 약 3속 7종, 우리나라에는 1속 1종이 분포하며(Lee, Yong No, 2006), 한반도에는 시로미가 백두산, 관모봉, 두류산, 북수백산등의 북부지역과 제주도 한라산 정상부근 해발 1,700m 이상의 고원지에 주로 분포한다.(Kong and Watts, Kluwer Academic Publishers, 1993) 한라산에 분포하는 시로미는 지구상 분포의 남방한계선으로 식물 지리학적 가치가 매우 높으며 한라산에서도 비교적 넓은 분포지역을 가져 환경변화에 따른 식생패턴의 변화를 예측하기에 적합한 극지고산 식물의 대표적인 수종으로 볼 수 있다.(Kong, W. S., J. of the Korean Giographical Society, 37(4), 2002) 시로미는 고산지대 정상 가까운 곳에 나는 상록 관목으로 키는 10~20cm이다. 약용 및 관산용으로 이용되고 민간에서는 나무 전체를 방광염, 임질, 소화, 구토, 정혈, 신장염등에 약으로서 사용되기도 한다.(Kim, T. J., Korean Resources Plants II, 1996)

시로미 추출물에 대한 선행 발명의 예를 보면, 피부 보습 및 피부 개선 조성물(일본특허번호 2003-317786), 건강 기능성 개선제(일본특허번호 2003-327502), 여성위생제품(대한민국공개특허번호 10-2004-7009315), 항균활성(McCutcheon, A. R. et al ., Journal of ethnopharmacology, 44(3), 1994), 항산화 활성(Ermilova, E. V. et al ., Pharmaceutical Chemistry Journal . 34(11), 2000) 등이 있으나 본 발명에서 달성하고자 하는 피부주름개선 효과를 갖는 화장품 조성물과는 무관하다.

본원 발명은 천연유래추출물을 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하고자 하는 것으로, 시로미 추출물이 피부주름 개선에 효과가 있음을 밝혀 이를 함유하는 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 피부주름개선 효과를 갖는 시로미(Empetrum nigrum var . japonicum)추출물을 함유하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 시로미 잎과 가지 추출물이 엘라스타아제와 콜라게네이즈(MMP-1)활성을 저해하고, 콜라겐합성을 촉진하는 효과가 있음을 밝혀 피부주름개선용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 시로미 추출물은 시로미 잎과 가지 부위를 각각 60 ~ 95중량% 에탄올 등의 추출용매를 사용하여 추출한 것으로 본 발명에 따른 피부주름개선용 화장료 조성물에 함유되는 시로미 잎 또는 가지 추출물의 함량은 조성물 전체중량의 0.005 내지 1 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 피부주름 개선 효과를 갖는 시로미 추출물은 ROS 소거 활성을 나타내고, H₂O₂에 유도된 세포사멸 저해를 통해 세포 생존율을 보호하고, 카탈라아제, ERK 및 NK-κB 활성을 증진시키는 작용이 있으므로, ROS에 의한 조직 손상을 개선하여 염증, 노화, 암, 동맥경화, 고혈압 및 당뇨병의 치료뿐 아니라 주름 개선 및 피부 염증 완화 등에도 사용할 수 있을 것으로 보인다. 또한, 당업계에서 제조되는 일반 화장수, 유액, 크림제, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등 통상적인 제제화 방법에 따라 제형화 할 수 있다.

본 발명은 피부주름개선 효과를 갖는 시로미(Empetrum nigrum var . japonicum)추출물에 관한 것으로, 시로미 잎과 가지 추출물은 엘라스타아제와 콜라 게네이즈(MMP-1)활성을 저해하고, 콜라겐합성을 촉진하는 작용이 있어 피부주름개선에 유용한 화장료로서 사용가능하다.

실시예 1: 에탄올추출물의 제조

시로미는 제주시 소재 한라수목원에서 채취, 동정되었다. 시료를 정제수로 세척하고 건조하여 잎과 가지 부위를 나눈 후 각각 분쇄하였다.

시로미 잎과 가지 각 시료에 대한 추출물을 얻기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 건조 분쇄된 시로미 잎 10g에 80% 에탄올 0.6L, 가지 50g에 80% 에탄올 2L를 넣고 상온에서 초음파를 이용하여 4시간 동안 추출한 후 어드반텍 NO. 4 (제조판매원:Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)여과포로 여과하였다. 각 여액을 감압회전농축기를 이용하여 잎 추출물(이하 "EN-L"이라함) 건조중량 1.17g과 가지 추출물(이하 "EN-B"이라함) 건조 중량 1.6g을 얻었다.

실시예 2: 극성용매 및 비극성용매 가용분획추출물의 제조

실시예 1에서 얻은 EN-L 0.4g과 EN-B 0.5g을 각각 물에 분산시키고, 헥산과 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가한 후 분획하였다. 그 결과 잎 추출물에 대한 헥산 분획물 0.073g, 클로로포름 분획물 0.085g, 에틸아세테이트 분획물 0.045g, 부탄올 분획물 0.073g 물 분획물 0.116g을 수득하였고, 가지 추출물에 대한 헥산 분획물 0.10g, 클로로포름 분획물 0.079g, 에틸아세테이트 분획물 0.065g, 부탄올 분획물 0.112g, 물 분획물 0.124g을 수득하였다.

실시예 3: 항산화 효능 평가

3-1. DPPH 라디칼 소거활성능력 측정실험

본 실시예 1과 실시예 2에서 수득한 시료들의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하여 항산화력을 확인하였다. 각 시료들의 항산화능력을 기존의 항산화제인 비타민 C와 비교 측정하였다.

DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴히드라진) 2.96mg을 에탄올 50㎖에 녹여 0.2mM DPPH 용액을 만들었다. 항산화능을 측정하고자 하는 시료를 에탄올에 녹여 희석하고 96공 평판 플레이드에 150㎕씩 분주한 다음 DPPH 용액 150㎕를 시료액과 30분간 반응시키고 microplate reader를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료대신 에탄올을 넣은 반응액을 대조군으로 하여 라디칼 소거능력을 측정하였다. 이때 사용된 계산식은 아래와 같다.

Scavenge(%) = {1-(A-B)/C}×100

A : 시료액과 DPPH 용액을 반응시킨 실험군의 흡광도

B : 시료액 자체 흡광도

C : 에탄올과 DPPH 용액을 반응시킨 실험군의 흡광도

DPPH 라디칼 소거 효과

시료	DPPH Scavenge(%)					SC₅₀ (㎍/㎖)	시료	DPPH Scavenge(%)					SC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)							처리농도(㎍/㎖)
	1	5	10	20	50			1	5	10	20	50
EN-L	7.2	13.2	20.6	36.6	68.9	32.6	EN-B	11.6	22.7	33.3	52.5	93.5	18.7
EN-L의 헥산 분획물	7.2	10.4	16.6	23.7	38.2	>50	EN-B의 헥산 분획물	6.1	6.7	6.8	9.0	10.8	>50
EN-L의 클로로포름 분획물	3.31	4.5	5.4	7.3	17.3	>50	EN-B의 클로로포름 분획물	5.2	6.9	8.2	13.9	23.1	>50
EN-L의 에틸아세테이트 분획물	7.6	27.5	44.8	80.0	93.9	11.8	EN-B의 에틸아세테이트 분획물	8.0	24.7	42.7	66.6	94.1	13.2
EN-L의 부탄올 분획물	6.6	15.1	26.6	45.7	80.8	23.7	EN-B의 부탄올 분획물	11.5	29.2	48.1	81.8	94.6	10.5
EN-L의 물 분획물	6.2	8.8	6.0	24.7	49.0	>50	EN-B의 물 분획물	6.8	13.8	21.7	40.0	76.6	28.4
비타민 C	12.0	32.7	70.7	-	-	7.3

표 1에서 나타난 바와 같이 시로미 잎과 가지 각 추출물과 정제 분획물들의 자유라디칼 소거 효과는 농도에 의존하여 증가되었다. 특히 잎 추출물의 경우 에틸아세테이트 분획물이 에탄올 추출물 보다 약 2배 이상 항산화 활성이 향상됨을 확인하였고, 가지 추출물의 경우 부탄올 분획물이 에탄올 추출물 보다 항산화 활성이 더욱 향상됨을 확인하였다. 따라서, 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물과 가지 추출물의 부탄올 분획물에 자유라디칼을 소거하는 유효 활성 성분이 존재함을 예상할 수 있다.

3-2. DCF-DA 방법에 의한 세포내 활성 산소종 저해효과

본 실시예에서는 실시예 1과 실시예 2에서 수득한 시료들의 DCF-DA 방법에 의한 세포내 활성 산소종 저해효과를 확인하였다. V79-4 폐 섬유아세포들을 DMEM(10% 우태아 혈청 첨가, 1% 항생제 포함) 배지에 현탁하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하고 대수기에서 성장하는 세포를 주로 실험에 사용하였다. 웰당 약 4×10⁵ 세포 수가 되도록 96웰에 각각 접종한 후, 시료 추출물을 여러 처방으로 처리한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30분간 배양하였다. H₂O₂ (stock 20 mM)를 10 ㎕씩 가한 후(최종 농도 1 mM) 다시 37℃, 5% CO2 배양기에서 30분간 배양하고, DCF-DA(dichlorofluorescin diacetate, stock 500 mM)를 20 ㎕씩 가한 후 형광분광광도계(spectrofluorophotometer, excitation 485 ㎚, emission 535 ㎚)로 형광 측정하였다. 시료를 넣지 않고 활성 산소종(Reactive oxygen species)의 형성만을 측정한 것을 대조군으로 정하고, 시료를 넣어 활성 산소종을 소거시키는 시료 처치군과 비교하여, 상기 수학식으로 활성산소종 저해율을 구하였으며, 모든 실험은 3번 반복하였다.

세포내 활성 산소종 저해 효과

시료	DCF-DA Scavenge(%)			SC₅₀ (㎍/㎖)	시료	DCF-DA Scavenge(%)			SC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)					처리농도(㎍/㎖)
	1	5	10			1	5	10
EN-L	15.5	27.2	35.9	>10	EN-B	14.7	29.6	33.5	>10
EN-L의 에틸아세테이트 분획	33.9	52.6	67.2	4.5	EN-B의 에틸아세테이트 분획물	26.6	38.5	55.5	8.4
EN-L의 부탄올 분획	15.5	14.3	36.3	>10	EN-B의 부탄올 분획물	30.2	38.3	48.1	>10

표 2에서 나타난 바와 같이 시로미 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 에탄올 추출물을 포함한 다른 분획물들 보다 더 높은 항산활 활성이 나타남을 확인하였다. 시로미 가지 추출물의 경우 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물은 에탄올 추출물 보다 더 높은 항산활 활성이 나타남을 확인하였다. 이것은 표 1의 DPPH 라디칼 저해 효과의 결과와 유사한 경향을 나타내는 것이다.

실시예 4. 엘라스타아제(elastase)의 활성저해 측정

본 실시예에서는 실시예 1과 실시예 2에서 수득한 시료들의 엘라스타아제 활성 저해 효과를 확인하였다. 먼저, 트리스 완충액(0.2M Tris buffer, pH8.00) 140㎕와 농도별 시료20㎕, 그리고 5mM N-Succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide(Sigma, S4760) 20㎕씩 기질용액을 첨가한 다음, 10㎍/ml의 elastase(Sigma, E7885) 20㎕와 잘 혼합하여 상온(25℃)에서 15분간 반응시킨 후 410nm에서 생성된 p-nitroaniline의 양을 측정하였다. 양성 대조군으로서는 빈랑자 추출물(대한민국 특허 출원 :1997-78817, 1999-0056924 ; Int. J. Cosmet. Sci., 21 , 71-82, 275-295, 1999)을 사용하였다. 각 시료의 엘라스타아제 활성 저해효과는 효소활성을 50% 소거하는 농도인 IC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 실험액의 흡광도 값으로 하였다.

엘라스타아제(elastase) 활성저해 효과

시료	elastase inhibition(%)					IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)
	10	25	50	75	100
EN-L	18.1	24.9	39.4	55.2	65.1	67.2
EN-L의 헥산 분획물	35.8	46.8	47.2	51.8	52.1	73.2
EN-L의 클로로포름 분획물	23.8	62.6	72.0	76.2	80.0	20.2
EN-L의 에틸아세테이트 분획물	10.8	16.7	17.4	24.2	26.8	>100
EN-L의 부탄올 분획물	15.9	18.0	22.0	27.5	28.6	>100
EN-L의 물 분획물	15.7	22.7	26.4	27.1	33.4	>100
빈랑자 추출물	31.61	-	62.82	-	-	34.7

표 3에서 나타난 바와 같이 시로미 잎 에탄올 추출물과 클로로포름 분획물에서 농도 의존적으로 엘라스타아제 활성이 나타났으며, 그 중 클로로포름 분획물에서는 에탄올 추출물보다 약 3배 높은 저해 효과를 확인하였다. 따라서, 클로로포름 분획물에 엘라스타아제를 저해하는 유효 활성 성분이 존재함을 예상할 수 있다.

시로미 가지 추출물과 각 분획물들에서는 엘라스타아제 저해 효과가 나타나지 않았다.

실시예 5. 콜라게네이즈(MMP-1)의 활성 저해 측정 실험

본 실시예에서는 실시예 1과 실시예 2에서 수득한 시료들의 콜라게네이즈(MMP-1) 활성 저해 효과를 확인하였으며, 정제된 콜라게네이즈와 플루오레세인에 접합된 콜라겐의 이용을 기초로 한다.

먼저, 반응 완충액(0.05M Tris-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂, 0.02mM NaN₃, pH7.3) 100㎕에 0.25㎎/㎖의 DQ^TM콜라겐 용해액(Molecular probes, USA) 20㎕와 농도별 시료를 40㎕씩 첨가한 다음, 5 Unit의 콜라게네이즈(GIBCO, USA) 40㎕와 잘 혼합하여 암소, 상온에서 20분간 반응하였다. 그 후 형광 분광광도계를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚에서 형광값을 측정하였다. 양성 대조군으로서는 실시예의 물질 대신 녹차추출물(김지은, 인체피부 섬유아세포에서 열자극에 의해 유도되는 type Ⅰprocollagen, MMP-1과 TIMP-1 발현에 대한 녹차추출물(epigallocatechin-3-gallate)의 효과: 고려대학교 생명환경과학대학원 생명유전공학과, 2004. 2)을 사용하였다.

참고로, 녹차 추출물에 대한 콜라게네이즈 효소생성억제 작용은 대한민국 특허 특1999-0056976에 개시되어 있다. 각 시료의 콜라게네이즈의 활성 저해효과는 효소활성을 50% 소거하는 농도인 IC₅₀으로 표시하였다. 이때 음성 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 실험액의 형광값으로 하였다.

콜라게네이즈(MMP-1) 저해 효과

시료	MMP-1 inhibition(%)			IC₅₀ (㎍/㎖)	시료	MMP-1 inhibition(%)			IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도(㎍/㎖)			IC₅₀ (㎍/㎖)		처리농도(㎍/㎖)
	10	50	200	10		50	200
EN-L	8.0	36.3	89.7	88.2	EN-B	31.1	70.6	98.9	29.2
EN-L의 헥산 분획물	11.3	19.5	28.6	>200	EN-B의 헥산 분획물	2.6	7.4	17.5	>200
EN-L의 클로로포름 분획물	17.2	57.3	91.5	43.0	EN-B의 클로로포름 분획물	-2.6	24.4	67.5	139.4
EN-L의 에틸아세테이트 분획물	21.0	55.7	95.5	43.1	EN-B의 에틸아세테이트 분획물	25.8	76.7	99.0	28.8
EN-L의 부탄올 분획물	31.07	64.1	97.6	30.0	EN-B의 부탄올 분획물	48.4	96.2	99.6	11.4
EN-L의 물 분획물	20.3	45.8	88.8	64.7	EN-B의 물 분획물	26.2	61.2	97.6	37.3
녹차 추출물	17.0	29.3	58.0	159.3

표 4에서 나타난 바와 같이 시로미 잎과 가지 에탄올 추출물들은 MMP-1저해 효과가 우수하다고 잘 알려진 녹차추출물보다 더 높은 MMP-1 저해 효과를 나타내었다. 특히 시로미 잎 에탄올추출물의 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물은 에탄올 추출물 보다 2배 이상 더 높은 저해 활성을 나타내었고, 그 중 부탄올 분획물이 가장 높은 활성을 나타내었다. 시로미 가지 추출물의 경우도 부탄올 분획물이 에탄올 추출물보다 약 3배 더 높은 MMP-1 저해 효과를 나타내었다. 따라서, 이들 분획물에 MMP-1 저해 활성이 높은 유효 활성 성분이 존재함을 예상할 수 있다.

실시예 6. 콜라겐 합성 촉진 효과 측정 실험

본 실시예에서는 실시예 1과 실시예 2에서 수득한 시료들의 콜라겐 합성 촉진효과를 측정하기위해 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 시료를 처리하여 실험을 실시하였다.

96공 평판배양기(96-well plate)에 5% 우태아혈청이 함유된 IMDM(Iscove's Modified Dulbesco's Media) 배지와 함께 ATCC(Americal Type Culture Collection)에서 구입한 인간의 정상섬유아세포(CCD-985sk)를 5000 세포/well 농도로 분주하고 24시간 동안 37℃, 10% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24시간 후 시료를 우태아혈청이 포함되지 않은 IMDM 배지에 농도별로 희석하여 2일 동안처리하고 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 콜라겐 단백질 측정기구(Procollagen Type I-C-peptide EIA Kit(MK101), Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐(Procollagen) 타입 I C-펩타이드(Type I C-peptide : PICP) 합성양을 측정하였다.

측정방법은 우선 콜라겐 항체가 균일하게 도포되어 있는 96공 평판배양기에 POD(perosidase)효소가 결합된 항체용액 100㎕와 채취된 세포배양액 20㎕를 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후 상등액을 모두 제거하고 각 well을 400㎕의 PBS로 4회 세척하였다. 세척 후 각 well에 POD와 반응하는 기질용액 100㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위해 1N 황산용액 100㎕를 첨가하여 혼합한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. PICP양은 콜라겐 측정 키트에 포함되어 있는 표준용액을 희석하여 작성된 표준농도곡선에 샘플의 흡광도를 대입하여 계산하였다. 또한 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

콜라겐 합성 촉진 효과

시료	콜라겐 합성율(%, control)			시료	콜라겐 합성율(%, control)
	처리농도(㎍/㎖)				처리농도(㎍/㎖)
	0.5	1.0	2.0		0.5	1.0	2.0
EN-L	110.1	111.1	116.3	EN-B	240.6	327.8	201.8
EN-L의 에틸아세테이트 분획물	108.0	113.5	121.3	EN-B의 에틸아세테이트 분획물	166.4	205.9	218.5
EN-L의 부탄올 분획물	111.9	118.8	110.1	EN-B의 부탄올 분획물	125.0	141.3	135.7
대조군	100

표 5에서 나타난 바와 같이 시로미 잎과 가지의 에탄올 추출물과 이들의 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물들 모두 대조군 보다 콜라겐 합성이 증가됨을 확인하였다. 이것은 표 4의 MMP-1 저해 효과를 재 확인할 수 있는 결과이다. 특히 시로미 잎 보다는 가지의 추출물 성분들이 더 높은 콜라겐 합성 촉진효과를 나타내었다.

Claims

시로미 잎과 가지 추출물을 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
시로미 잎과 가지의 에탄올 추출물에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가한 후 분획하여 얻은 1종 이상의 용매분획물을 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 시로미 잎과 가지 추출물 또는 1종 이상의 용매분획물은 조성물 전체중량의 0.005 내지 1 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름개선효과가 엘라스타아제의 활성저해효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름개선효과가 콜라게네이즈(MMP-1) 활성 저해효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피부주름 개선효과가 콜라겐 합성촉진 효과에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.