KR102050545B1 - 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 포함하는 항노화 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미역귀(Undaria pinnatifida enzymatic-extracts fucoidan, UPEF), 감태 추출물(Ecklonia cava Ethanol-extracts, ECE) 및 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)의 유효성분을 포함하는 항노화 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 포함하는 항노화 기능성 화장료 조성물{An anti-aging functional cosmetic composition comprising an Undaria pinnatifida extract, an Ecklonia cava extract and glycosaminoglycan}

본 발명은 미역귀(Undaria pinnatifida enzymatic-extracts fucoidan, UPEF), 감태 추출물(Ecklonia cava Ethanol-extracts, ECE) 및 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)을 포함하는 피부 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 피부 보호효과 또는 피부 재생 효과를 갖는 항노화 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체에서 가장 큰 기관으로서 그 면적이 약 1.6㎡에 이르는 큰 크기이며, 무게로도 체중의 16%나 되는 큰 기관으로서, 피부는 내부 장기를 보호하기 위하여 신체를 덮고 있는 가장 기본적인 외피로서의 역할 이외에도 많은 기능을 수행하고 있는 매우 중요한 기관이다.

그러나, 피부를 구성하는 세포 외부로부터 가해진 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍, 자외선, 환경오염물질, 급격한 기온의 변화 등과 같은 세포를 손상시키는 세포손상자극들에 의하여 세포내의 다양한 생화학적 변화가 유도되면 피부 외관에 기미, 주근깨, 잡티, 탄력손실, 각질화, 주름생성과 같은 피부의 노화를 촉진시키게 된다.

피부노화 현상 중 피부의 착색이나 얼룩 등의 색소 침착의 요인으로는 생체 내에서의 대사 장해 등의 내인적 요소와 자외선 등에 의한 외인적 요소를 들 수 있는데, 일반적으로 후자의 외인적 요소에 의한 것이 주를 이루며, 이와 같이 피부에 자외선이 조사되는 경우 자외선에 의하여 멜라노사이트(melanocyte)가 자극을 받고, 멜라노사이트가 활성화되면 티로시나아제(tyrosinase) 효소가 작용하여 피부가 타서 갈색이 되는데, 이것은 멜라닌이 생성되어 과잉광선을 흡수하여 생체를 보호하기 위한 것으로 추측된다. 그래서 화장품업계에서는 이러한 현상을 방지하기 위해서 멜라노사이트의 활성을 억제하고 티로시나아제 효소 및 멜라닌 색소의 생성을 억제함으로써 피부의 착색이나 얼룩 등의 색소 침착을 방지하는 미백제를 개발하는 것이 종래부터 중요한 이슈가 되고 있다.

또한, 피부노화 현상 중 주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있으며, 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상에 관하여 지금까지의 연구결과에 의하면 진피 내 주 단백질인 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 콜라겐의 감소가 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다는 연구 결과가 보고되고 있다. 즉, 콜라겐 감소에 영향을 끼치는 자유 라디칼들은 피부 콜라겐 등의 결합조직 형성파괴, 세포막 기능 저해, DNA 변이 촉진, 단백질 작용 변형, 세포 간 에너지 전이, 신진 대사와 관련된 분자들의 변형을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 피부 노화에 자유 라디칼이 관여한다는 사실은 자유 라디칼을 불활성화시키는 항산화제들을 사용하여 노화 과정을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다. 한편, 정상적인 세포에서도 대사과정 중 어느 정도의 자유 라디칼과 기타 활성 산소 및 과산화물이 생성되며, 이들에 대한 생체방어기구에 이상이 초래되거나 각종 물리적, 화학적 요인들에 의하여 활성산소의 생성이 생체 방어계의 용량을 초과하게 될 경우 산화적 스트레스가 야기된다. 따라서, 활성산소를 억제하는 것은 피부노화를 방지하는 화장물 조성료에 중요한 요소이다.

대한민국 공개특허 제10-13038070000호

본 발명의 목적은 미역귀(Undaria pinnatifida enzymatic-extracts fucoidan, UPEF), 감태 추출물(Ecklonia cava Ethanol-extracts, ECE) 및 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAGs)의 상호 상승효과로 피부 미백, 주름 개선, 항산화, 자외선에 대한 보호 또는 피부 재생용 항노화 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로, 본 발명은 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 항노화 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효성분으로, 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 포함한다.

상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 항노화 효과를 가진다.

본 발명의 용어 “미역귀”는 바다에 서식하는 갈조류의 일종인 미역(Undaria pinnatifida)의 뿌리 부분에 위치하는 미역의 생식소로서 미역포자엽이라고 불리며, 알긴산과 후코이단 성분이 풍부한 것으로 알려져 있고, 항암기능, 항바이러스 기능, 면역 증강 기능 등 다양한 생리활성기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 용어 “추출물”이란 천연물로부터 그 안의 성분을 뽑아낸 물질로, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 “미역귀 추출물”은 미역귀의 효소 추출물을 의미한다. 상기 미역귀 추출물은 후코이단(fucoidan)을 유효성분으로 포함하며, 상기 효소는 셀루클라스트(Cellucalast)일 수 있다.

상기 미역귀 추출물은 미역귀 분말을 물에 용해한 후 셀루클라스트를 첨가하여 가수분해하고, 이를 원심분리한 뒤 상층액을 여과하고, 농축시키며, 농축시킨 상층액을 에탄올로 당을 침전하고 염화칼슘을 이용하여 알긴산을 제거하여 추출될 수 있으나, 효소를 이용하고, 후코이단을 포함하며 알긴산을 제거하는 추출방법이라면 제한없이 이용될 수 있다.

상기 후코이단(fucoidan)은 끈적끈적한 점질 구조의 황산염화한 다당류로 미역, 다시마 등의 갈조류에 함유되어 있으며, 항염, 항바이러스, 항알레르기 작용을 한다고 알려져 있다.

본 발명의 용어 “감태(Ecklonia cava)”는 미역과에 속하는 다년생 해조류로서 우리나라 동해 남부와 제주도를 포함한 남해안 일대에서 분포하여, 예로부터 식용으로 사용되어 왔다.

본 발명의 용어 “감태 추출물”은 상기 감태를 에탄올 용매로 추출한 것이며, 폴리페놀과 디에콜를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 감태 추출물은 총 폴리페놀 함량이 50% 이상이며, 디에콜을 5%이상 포함한다.

본 발명의 용어 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)은 피부를 구성하는 주요 성분중의 하나이며, 히알루론산(HA), 더마탄황산염, 콘드로이틴황산염, 케라탄황산염, 헤파란황산염, 헤파린 등이 이에 속한다. 글리코사미노글리칸은 주로 동물의 연골이나, 어류의 연골, 미더덕, 멍게껍질 등에서 추출 가능하다.

본 발명의 글리코사미노글리칸은 멍게(Halocynthia roretzi)의 껍질에서 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 용어 “노화”는 시간의 흐름과 함께 진행되는 신체의 기능 및 상태 변화로 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 색소 침착으로 인한 불균일한 피부 및 반점, 주름, 탄력저하 등의 증상이 있으며, 자외선 및 산화적 스트레스가 주된 원인으로 알려져 있다.

본 발명의 용어 “항노화”는 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 보호 효과 또는 피부재생 효과를 통해 상기 노화 증상을 완화, 감소, 예방, 지연, 개선 또는 제거시키는 것을 의미한다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션,왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르,폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제,미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸 트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 용어 “미백”은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부들을 포괄하여 의미하는 것으로 구체적으로 피부 미백을 의미한다.

상기 멜라닌(melanin)은 피부, 머리카락, 눈동자 등 생물체에 널리 분포되어 있는 색소 성분으로 인체의 표피층의 멜라닌 세포 내의 멜라노좀(melanosome)이 합성되는데, 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 티로신(tyrosine)을 시발 물질로 하여 DOPA(3,4-dihydroxy-phenylalanine) 또는 DOPA퀴논(dopaquinone)으로 변환되는 산화 및 중합 반응으로 멜라닌이 생합성 된다. 생합성된 멜라닌은 자외선과 같은 피부자극에 대해 저항력을 높여 주지만, 과도한 멜라닌의 합성을 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 색소 침착을 일으키기 때문에 티로시나아제의 활성 측정은 피부 미백효과를 나타내는 하나의 중요한 지표로 받아들여지고 있다.

본 발명의 일실시예에서 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 중량비율(w/v)에 따른 혼합시료의 미백 효과를 확인하고자, 티로시나아제 저해활성과 멜라닌 생성 저해 활성을 확인하였다.

티로시나아제 저해활성 측정 결과, 단일시료를 처리했을 때 보다 상승효능을 혼합시료를 확인하였으며, 중량비율(w/v)을 UPEF:ECE:GAGs와 같이 표기할 때, 티로시나아제 저해 활성의 상승 효능이 있는 2:6:2, 2:7:1, 3:5:2, 3:6:1, 4:3:3, 4:5:1, 7:2:1의 비율의 혼합시료를 흑색종 세포(B16F10)에 처리하여 멜라닌 생성 저해 효과를 측정하였으며, 모든 혼합시료에서 멜라닌 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 그중 유의적 차이가 있는 중량비율 3:5:2, 3:6:1 및 4:5:1인 혼합시료를 제브라피쉬 모델에서 멜라닌 생성 저해활성을 확인하였고 그 결과, 4:5:1의 비율의 혼합시료에서 멜라닌 저해효능이 가장 우수함을 확인하였다.

상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 혼합시료가 티로시나아제 활성을 저해시키고, 흑색종 세포 및 제브라피쉬 모델에서 멜라닌 생성을 감소시키는 것을 확인하여, 미백효능을 확인하였으며, 중량비율(w/v)에 따라 미백효능이 차이가 있음을 확인하였고, 그중 4:5:1의 중량비율에서 미백효능이 가장 우수함을 확인하였다.

본 발명의 용어 “주름개선”은 콜라겐 또는 엘라스틴을 분해하는 효소를 저해하거나, 콜라겐의 합성을 촉진시켜 주름을 개선시키는 것을 의미한다. 상기 콜라겐 및 엘라스틴은 피부 진피층을 구성하여, 상기 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 또는 변형이 주름 생성과 피부탄력 저하에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일실시예에서 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 중량비율(w/v)에 따른 혼합시료의 주름개선 효과를 확인하고자, 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 저해 활성을 확인하였다.

콜라게나아제 및 엘라스타아제 저해활성 측정결과, 단일시료보다 상승효능 가지는 혼합시료들을 확인하였으며, 상승효능을 가지는 혼합시료를 처리한 인간 섬유아세포에서 프로 콜라겐(pro-collagen)의 함량을 측정한 결과 중량비율이 3:5:2, 3:6:1, 4:5:1, 7:2:1인 혼합시료 처리한 세포에서 프로 콜라겐의 함량이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 혼합시료가 콜라게나아제 및 엘라스타아제를 저해시키고, 프로 콜라겐을 증가시키는 것을 확인하여, 주름개선 효능을 확인하였으며, 중량비율에 따라 주름개선의 효능의 차이가 있음을 확인하였고, 그 중 중량비율이 3:5:2, 3:6:1, 4:5:1, 7:2:1인 혼합시료가 주름개선 효과가 우수함을 확인하였다.

본 발명의 용어, "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. 상기와 같은 활성산소는 체내에서 세포를 산화시켜 파괴시키며, 그에 따라 각종 질환에 노출되게 된다. 또한 상기 항산화는 세포 내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼 또는 활성산소종에 의한 세포산화를 억제하는 기능을 의미하여, 자유 라디칼 또는 활성 산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 발명의 일실시예에서 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 중량비율에 따른 혼합시료의 항산화 효과를 확인하고자, 제브라피쉬 모델에 과산화수소를 처리하고 혼합비율에 따른 생존률과 활성산소 억제 활성을 확인하였다. 중량비율이 3:5:2, 4:5:1인 혼합시료에서 농도 의존적으로 생존율이 증가하는 것을 확인하였으며, 중량비율이 4:5:1인 혼합시료를 처리하였을 때 과산화수소로 인해 증가한 활성산소가 감소하는 것을 확인하였다.

상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 특정 비율의 혼합시료가 과산화수소 처리한 제브라피쉬의 생존율을 증가시키고, 활성산소를 감소시키는 것을 확인하여, 항산화 효과가 있음을 확인하였고, 중량비율이 4:5:1인 혼합시료가 항산화 효과가 우수함을 확인하였다.

본 발명의 용어 “자외선에 대한 보호”는 자외선에 의해 세포에 유발된 스트레스에 대해 세포를 보호하는 것으로, 상기 자외선은 자외선 B일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 중량비율에 따른 혼합시료의 자외선 B의 보호효과를 확인하고자 제브라피쉬 모델에서 자외선 B로 조사 후 생존율과 자외선 B로 발생한 일산화질소(NO)에 대한 소거 효과를 확인하였다.

상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 중량비율이 3:5:2, 3:6:1, 4:5:1인 혼합시료를 처리한 제브라피쉬 모델에서 생존율이 증가함을 확인하였으며, 생존율이 증가한 혼합시료 처리한 제브라피쉬 모델에서 일산화질소 소거활성을 측정한 결과, 중량비율 4:5:1인 혼합시료를 처리한 제브라피쉬에서 일산화질소가 감소하는 것을 확인하였다.

상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 혼합시료가 자외선 처리한 제브라피쉬의 생존율을 증가시키고, 일산화질소를 감소시킴을 확인하여, 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸이 자외선 보호효과를 가짐을 확인하였으며, 중량비율이 4:5:1인 혼합시료가 자외선보호 효능이 우수함을 확인하였다.

본 발명의 용어 “피부재생”은 피부세포의 증식을 향상시키거나, 손상된 피부의 회복을 촉진하는 것을 의미한다.

본 발명의 일실시예에서 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 중량비율에 따른 혼합시료의 피부재생 효능을 확인하고자, 피부섬유아세포(NIH3T3)에서 세포증식능(cell proliferation)과 세포이동(cell migration)을 확인하고, 제브라피시 모델에서 상처를 낸 뒤 재생되는 것을 확인하여 피부재생 효과를 확인하였다.

혼합시료의 세포증식능 측정결과 글루코사미노글리칸의 비율이 증가할수록 세포증식능이 증가함을 확인하였으며, 단일시료를 처리했을 때 보다 혼합시료에서 상승효과를 가지는 시료들을 확인하였다. 상승효과를 가지는 시료 중 7개를 선별하여 표피생장인자를 양성 대조군으로 세포 증식능을 확인한 결과 중량비율 3:5:2, 3:6:1, 4:3:3, 4:5:1, 7:2:1인 혼합시료에서 유의적으로 세포증식이 향상됨을 확인하였고, 특히 4:5:1인 혼합시료에서 세포증식이 가장 우수함을 확인하였으며, 증식이 향상된 시료 중 미백 및 주름개선 효능이 좋은 중량비율 3:5:2, 3:6:1, 4:5:1인 혼합시료를 제브라피쉬 모델에서 상처재생(피부재생)을 확인한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군을 제외한 모든 그룹에서 시료처리 2일 뒤에 상처가 회복되는 것을 확인하였다. 또한 중량비율 4:5:1인 혼합시료에서 세포이동을 확인한 결과 대조군에 비해 세포이동이 증가하는 것을 확인하였다.

상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 혼합시료가 피부 섬유아세포의 증식을 향상시키고 제브라피쉬 모델의 상처재생(피부재생)을 촉진하는 것을 확인하여, 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸이 피부재생 효능을 가짐을 확인하였으며, 특히 중량비율이 4:5:1인 혼합시료가 피부재생 효과가 우수함을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서, 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 보호 효과 및 피부재생 효과를 비교하여 혼합시료에서의 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 보호 효과 및 피부재생 등의 항노화 효과를 확인한 바, 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 항노화 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)이 2~7:3~7:1~3의 중량비(w/v)이거나 또는, 미역귀 추출물이 1을 기준으로 상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)이 1:0.1~4:0.1~1의 중량비(w/v)로 혼합된 시료에서 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 보호 효과 및 피부재생의 상승효과를 확인하였으며, 4:5:1의 중량비(w/v)로 혼합된 시료에서 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 보호 효과 및 피부재생 효과가 가장 우수하였다. 따라서 상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)은 1:0.1~4:0.1~1의 중량비(w/v)로 혼합될 수 있으며, 구체적으로 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸은 4:5:1의 중량비(w/v)로 혼합될 것일 수 있다.

또한, 상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)의 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 보호 및 피부재생의 상승효과를 확인한 바, 상기 화장료 조성물은 피부 미백, 주름개선, 항산화, 자외선에 대한 피부 보호 또는 피부 재생용으로 이용할 수 있다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)을 유효성분으로 포함하는, 항노화 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 의약외품 조성물은 피부 미백, 주름 개선, 항산화, 자외선 차단 또는 피부 재생용인 것인, 의약외품 조성물일 수도 있다.

상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs), 항노화, 피부 미백, 주름 개선, 항산화, 자외선 차단 또는 피부 재생에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.

본 발명의 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드 워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제 등일 수 있다.

본 발명의 조성물을 항노화 용도로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하여 사용하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있으며, 본 발명에 의한 의약외품 조성물은 상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)을 유효성분으로 포함하는, 항노화 피부외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 피부외용제 조성물은 피부 미백, 주름 개선, 항산화, 자외선에 대한 피부 보호 또는 피부 재생용인 것인, 피부외용제 조성물일 수도 있다.

상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs), 항노화, 피부 미백, 주름 개선, 항산화, 자외선 차단 또는 피부 재생에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 의한 피부외용제 조성물은, 예를 들어, 연고, 로션, 가용화상, 현탁액, 에멀젼, 크림, 젤, 스프레이, 파프제, 경고제, 패치제 또는 물파스 등을 들 수 있지만, 이들에만 한정되지 않고, 당업계에 주지된 어떠한 기제에도 배합될 수 있다. 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 상기 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 미역귀(Undiaria pinnatifida) 추출물, 감태(Ecklonia cava)의 추출물 및 글리코사미노클리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)을 함유하는 화장료 조성물은 항산화, 미백, 주름개선, 자외선에 대한 보호 효과 또는 피부재생 효과가 있다.

도 1은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)단일시료를 각 25, 50, 100㎍/㎖ 농도별로 처리한 후 티로시나아제 저해 활성을 측정한 것이다. 대조군으로 알부틴을 350μM을 사용하였다.
도 2는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료를 각 25, 50, 100㎍/㎖ 농도별로 처리한 후 멜라닌 생성저해 활성을 측정한 것이다. 대조군으로 알부틴을 350μM을 사용하였다(좌측부터 각 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE),글리코사미노글리칸(GAGs)).
도 3은 제브라피쉬 배아에 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료를 각 25, 50㎍/㎖ 농도별로 처리한 후 생존율을 측정한 것이다.
도 4는 제브라피쉬 모델에서 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료를 각 25, 50㎍/㎖ 농도별로 처리한 후 미백 활성을 측정한 것이다.
도 5는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료를 50㎍/㎖ 농도 처리한 후 콜라게나아제 저해 및 엘라스타아제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 6은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료를 각 25, 50㎍/㎖ 농도별로 처리한 후 섬유아세포 증식능을 측정한 것이다.
도 7은 제브라피쉬 모델에서 상처재생(피부재생) 실험 모델을 도식화 한 것이다.
도 8은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료를 각 25, 50㎍/㎖ 농도별로 처리한 한 제브라피쉬 모델에서 상처재생(피부재생) 효능을 확인한 것이다
도 9는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 혼합시료의 티로시나아제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 10은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료 중 선택된 262, 271, 352, 361, 433, 451, 721 총 7개의 시료의 멜라닌 생성저해 활성을 측정한 것이다.
도 11은 제브라피쉬 배아에 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료의 352, 361, 451을 각 25, 50㎍/㎖ 농도별로 처리한 후 생존율을 측정한 것이다.
도 12는 제브라피쉬 배아에 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료 352, 361, 451을 각 25, 50㎍/㎖ 농도별로 처리한 후 미백 활성을 측정한 것이다.
도 13은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 혼합시료의 콜라게나아제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 14는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 혼합시료의 엘라스타아제 저해 활성을 측정한 것이다.
도 15는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료의 중 선택된 262, 271, 352, 361, 433, 451, 721 총 7개의 시료의 콜라게나아제 생성저해 활성을 측정한 것이다.
도 16은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료의 중 선택된 262, 271, 352, 361, 433, 451, 721 총 7개의 시료의 엘라스타아제 생성저해 활성을 측정한 것이다.
도 17은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료의 중 선택된 262, 271, 352, 361, 433, 451, 721 총 7개의 시료의 프로 콜라겐 합성 촉진 활성을 측정한 것이다.
도 18은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 혼합시료의 섬유아세포 증식능을 측정한 것이다.
도 19는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료의 중 선택된 262, 271, 352, 361, 433, 451, 721 총 7개의 시료의 섬유아세포 증식능을 측정한 것이다.
도 20은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료 352, 361, 451의 제브라피쉬 모델에서 상처, 피부 재생 효능을 확인한 것이다.
도 21은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료의 451의 세포이동(cell migration) 효능을 측정한 것이다.
도 22는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료 451의 세포재생 메커니즘을 확인한 것이다.
도 23은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료 352, 361, 451의 제브라피쉬의 생존율을 확인한 것이다(과산화수소 5mM 처리시).
도 24는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료 352, 361, 451의 활성산소 소거활성을 측정한 것이다(과산화수소 5mM 처리시).
도 25는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료 352, 361, 451의 제브라피쉬 생존율을 확인한 것이다(UV 50mJ/㎠ 조사).
도 26은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)혼합시료의 352, 361, 451의 활성산소(ROS) 소거활성을 측정한 것이다(UV 50mJ/㎠조사).
도 27은 미역귀 추출물(UPEF)의 제조방법이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

A. 실험방법

<실시예 1> In vitro 미백 효능 평가

1) 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성 측정

티로시나아제 저해 검정법은 존스 등에 의해 보고된 방법을 사용하였고(Jones et al. (2002) Pigment. Cell Res. 15:335), 티로시나아제의 기질인 L-Dopa의 도파크롬(dopachrome)으로의 전환은 450㎚에서 흡수 모니터링에 의해 수행하였다.

티로시나아제는 200U/㎖의 pH 6.8(검정 완충액), 50mM 포타슘 포스페이트 완충액으로 제조하였다. 기질인 L-DOPA의 2mM 모액(working solution)은 각 검정법을 위한 검정 완충액으로 제조, 시료들은 10%의 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 0.5㎖에 용해하고 5㎖의 검정 완충액으로 희석하였다. 반응 혼합물은 0.050㎖의 2mM L-DOPA, 0.050㎖ 200U/㎖ 머쉬룸 티로시나아제 및 0.050㎖ 저해제로 이루어진다. 반응 부피는 200μL의 검정 완충액으로 조정하였고, 검정은 96 웰 플레이트(well plate)에서 수행하였다. 테스트 시료에 의한 티로시나아제 저해 퍼센트는 대조군에 대한 시료의 흡광도의 비교에 의해 측정하였다.

(음성 대조군 흡광도 - 시료 흡광도) / 음성 대조군 흡광도 X 100

2) 멜라닌 생성 저해 활성

멜라닌 생성의 저해는 알파-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte stimulation hormone, α-MSH) 유도하에 측정되었다. 흑색종 세포주(B16F10)가 완전히 차게(confluency) 자란 후 well 당 40,000 세포로 분주하고, 세포가 자랄 수 있도록 5% 이산화탄소(CO₂)를 포함한 습한 환경의 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 다음날 저해제를 50nM 농도로 세포에 첨가하고 시료를 처리한 후 총 4일간 배양하였다. 색깔의 발색은 매 아침마다 육안으로 관찰하며, 색깔의 발색 후에, 200μL의 세포 상층액을 각 웰(well)로부터 제거하고 흡광도를 450㎚에서 측정하였다.

<실시예 2> In vitro 주름개선 효능 평가

1) 콜라게나아제 저해 활성 측정

피부 노화 억제 효과를 확인하기 위하여 콜라게나아제 저해활성 측정은 아래와 같이 측정하였다. 0.1M Tris-HCI buffer(pH 7.5)에 4mM 염화칼슘(CaCl₂)를 가하여, 4-phenyl azobenzy loxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (0.3㎎/㎖)를 녹인 기질액 0.25㎖ 및 시료용액 0.1㎖의 혼합액에 0.2mg/㎖ 농도의 콜라게나아제 0.15㎖를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% 시트르산(citric acid) 0.5㎖를 넣어 반응을 정지시킨 후, 에틸아세테이트(ethylacetate) 1.5㎖을 첨가하여 상등액을 320㎚에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나아제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타냈다.

2) 엘라스타아제(elastase) 저해 활성 측정

피부 주름 개선효과를 확인하기 위하여 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 30분간 p-nitroanilide의 생성량을 측정함으로서 돼지의 췌장 엘라스타아제(elastase) 저해 활성을 조사하였다. 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.1㎖ 씩 시험관에 취하고 50mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 엘라스타아제(elastase) 용액(Type I： From Porcine Pancreas 유래, 0.6 units/㎖) 0.05㎖를 가한 후 기질로 50mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (1mg/㎖)을 0.1㎖를 첨가하여 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 410㎚에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제(elastase) 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타냈다.

3) 세포배양

인간 섬유아세포주인 HDFn 세포와 인간 각질형성 세포주인 HaCaT세포는 DMEM에 100U/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)을 혼합한 배지를 사용하여, 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂) 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다. 세포배양 배지는 2일마다 새로운 배지로 갈아준 후, 실험을 위하여 4×10⁴개/300㎕의 세포를 48well 및 2×10⁶개/2㎖의 세포를 6well plate에 접종하여 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착된 후에 실험에 사용하였다.

4) 콜라겐 합성능 시험

48 well plate에 HDFn 세포를 5×10⁴개로 접종한 후 5% CO₂ 37℃하에서 24시간 배양하였다. 이후 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체하고, 시료를 첨가하여 24시간 동안 배양 후, 배양액을 모아서 프로콜라겐 타입 원 단백질 합성 키트(procollagen type Ⅰ protein synthesis kit)를 이용하여 콜라겐 전구체의 C-말단의 양을 측정하였다.

<실시예 3> 자외선 보호 효과 평가

1) 자외선 조사

자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 세포사멸에 대한 시료의 보호효과를 확인하기 위해서 자외선 B를 하기와 같은 조건으로 처리하였다. HDFn 세포를 80% 밀도가 되도록 배양한 뒤 배지를 걷어내고 인산완충용액으로 1회 세척한 다음 자외선 조사장치를 사용하여 50mJ/㎠의 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사 후 다양한 농도의 시료를 처리하여 24시간 배양하였다.

2) 세포생존율 평가

HDFn 세포를 48well plate에 4×10⁴cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 serum을 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 시료를 처리한 다음 12시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 세척 후, 인산완충생리식염수(phosphate buffer saline, PBS) 200㎕를 well에 분주 후 자외선 B를 50mJ/㎠로 조사하였다. 자외선 B 조사 후에 PBS를 제거하고 배지로 교환한 후 시료를 처리한 다음 24시간 후에 배지를 제거하고 MTT solution을 제거하고 생성된 formazan crystal을 DMSO에 녹여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.

3) 자외선 조사에 의한 주름 억제 활성 측정

HDFn 세포는 48 well plate에 4×10⁴cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 세럼(serum)을 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 시료를 처리한 다음 12시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 세척 후, PBS 200㎕를 well에 분주 후 자외선 B를 50mJ/㎠로 조사하였다. 자외선 B 조사 후에 PBS를 제거하고 배지로 교환한 후 시료를 처리한 다음 24시간 후에 배지를 제거하고 세포를 얻었다. 그 후에 HDFn 세포에서 자외선 B를 조사하였을 때 발현하는 콜라겐 분해 효소(Matrix metalloproteinase-1, MMP-1)가 시료를 처리하였을 때 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 웨스턴 블랏(western blot)을 수행하여 단백질 발현량을 확인하였다.

<실시예 4> 세포재생 효능 평가

1) 세포증식(Cell proliferation) 측정

NIH3T3 세포를 96 well plate에 5×10⁴cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 serum을 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 시료를 처리한 다음 24시간 종료 2시간 전에 미리 브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine, BrdU)시약을 처리 후 고정시약을 상온에서 30분간 반응 후 plate를 세척 후 BrdU 항체를 붙여 증식된 정도를 확인하였다.

2) 세포이주(Cell migration) 측정

NIH3T3 세포를 6well plate에 1×10⁵cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 serum을 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하고, 시료를 처리하기 전 세포의 표면에 스크래치를 낸 후, 시료를 처리하고 24시간 후에, 스크래치 난 부분이 얼마나 채워졌는지 측정하여 상처의 재생을 확인하였다.

<실시예 5> 제브라피쉬를 이용한 미백효능 평가

1) 제브라피쉬 배아의 미백 활성 측정

24 well plate에 well당 15-20개의 난을 넣은 후 아워 포스트 펄티리제이션(hour post fertilization, hpf)이 지난 제브라피쉬 배아를 넣고, 배아 배지(media)를 0.95㎖을 채워준 후 시료를 농도별로 처리하였다. 3dpf에 깨어난 제브라피쉬 larva 상태에서 현미경을 통하여 미백 활성 정도를 측정하고, 데이터는 3중으로 3회 반복하고 이를 평균 백분율로 표현하였다.

2) 제브라피쉬 배아의 멜라닌 함량

멜라닌 함량을 측정하기 위해 간단하게 9-48hpf까지 대략 제브라피쉬 배아 100마리에 멜라노제닉(melanogenic) 억제제를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 처리하여 Pro-Prep 단백질 추출 용액(Intron)에서 초음파 처리를 하였다. 원심분리 후, 펠릿을 1N 수산화나트륨(NaOH)를 1㎖에 녹여 100℃에서 30분 동안 반응시키고, 멜라닌 색소를 가용화하기 위해 혼합물을 강하게 볼텍스(vortex) 하였다. 상층액은 490㎚에서 흡광도를 측정하고 처리하지 않은 그룹은 100%로 나타내며 데이터는 3중으로 3회 반복하고 이를 평균 백분율로 표현하였다.

3) 제브라피쉬 배아에서 티로시나아제 저해 활성

티로시나아제 억제 활성은 티로시나아제 방법을 따라 수행하였다. 9-48hpf까지 대략 제브라피쉬 배아 100마리에 melanogenic 억제제(시료)를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 처리하여 Pro-Prep 단백질 추출 용액(Intron)에서 초음파 처리를 하고, 용해물은 5분동안 10,000g에서 원심분리 후 정화하였다. Lysis buffer 100㎕에 있는 전체 단백질 250㎍를 96-well plate에 옮긴 후 1.5mM L-티로시나아제 100㎕를 첨가하였다. 처리하지 않은 그룹 well에는 100㎕ lysis buffer와 1.5mM L-티로시나아제 100㎕가 존재하게 된다. 28℃에서 60분 동안 반응 후 475㎚에서 micro-reader(Packard Spectrocount)로 흡광도를 측정하였다. 페닐티오우레아(phenylthiourea, PTU)와 알부틴(arbutin)은 대조군로서 사용하였으며, 처리하지 않은 그룹은 100%로 나타내며 데이터는 3중으로 3회 반복하고 이를 평균 백분율로 표현하였다.

<실시예 6> 제브라피쉬를 이용한 항산화 효능 평가

1) 제브라피쉬에서 활성산소(Reactive oxygen species,ROS) 측정

항산화 효능을 갖는지 확인하기 위해 제브라피쉬 유생(larva) 상태에서 자극제인 과산화수소를 처리하였다. 노출 후 96시간에 활성산소를 측정하고, 형광측정을 위해 각 well의 제브라피쉬 유생(larva)를 96well plate에 옮겨 새로운 제브라피쉬 배아 medium을 채워 넣어 수행하였다. 활성산소 생성량을 측정하기 위해 활성산소와 반응하여 형광물질을 만들어내는 2,7-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA, Sigma)를 사용하였다. DCFH-DA 용액 20㎍/㎖를 각각의 well에 넣어 28.5±1°C 온도에서 1시간 동안 반응시킨 후, 제브라피쉬 larva를 제브라피쉬 배아 medium으로 2차례 세척하여 0.01% MS-222로 마취시켜 CoolSNAP-Pro dolor digital camera(Olympus, Japan)를 이용하여 활성산소 생성량을 측정하고, 각각의 제브라피쉬 larva의 형광강도는 image J program을 이용하여 정량화하였다.

2) 제브라피쉬에서 일산화질소(Nitric oxide, NO) 측정

자외선 조사로 인한 스트레스로 생성된 일산화질소를 시료가 얼마나 감소시키는지 알아보기 위해 제브라피쉬 larva 상태에서 최대한 물을 제거한 후 자외선 조사를 하였다. 노출 후 96시간에 일산화질소(NO)를 측정하였다. 형광측정을 위해 각 well의 제브라피쉬 larva를 96well plate에 옮겨 새로운 제브라피쉬 배아 medium을 채워넣어 수행하고, 일산화질소는 형광시약인 2′,7′-difluorofluorescein diacetate(DAF-FM DA, Sigma)를 사용하였다. 5mM DAF-FM DA 용액을 각각의 well에 넣어 28.5±1°C 온도에서 2시간 동안 반응 후 수행하고, 반응시킨 제브라피쉬 larva를 제브라피쉬 배아 medium으로 2차례 세척하여 0.01% MS-222로 마취시켜 CoolSNAP-Pro dolor digital camera(Olympus, Japan)를 이용하여 일산화질소 생성량을 측정하였다. 각각의 제브라피쉬 larva의 형광강도는 image J program을 이용하여 정량하였다.

<실시예 7> 제브라피쉬를 이용한 피부재생 효능 평가

제브라피쉬 larva 상태에서 꼬리지느러미를 일정하게 자른 후 시료 처리 후 3일간 꼬리 부분이 얼마나 회복되었는지 측정하였다.

<실시예 8> 혼합시료의 제조

본 실시예에서는 대량생산 된 미역귀 추출물(Undaria pinnatifida enzymatic-extracts fucoidan, UPEF) 및 멍게(Halocynthia roretzi)의 껍질에서 분리된 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans, GAGs)을 사용하였다. 또한, 감태의 에탄올 추출물(Ecklonia cava Ethanol-extracts, ECE)은 아쿠아그린텍(주)에서 구입하였으며, 총 폴리페놀 함량이 50% 이상이며, 디에콜 함량이 5% 이상인 제품을 사용하였다(제품명: 감태 디에콜).

1) 미역귀 추출물의 제조방법

증류수 1L에 미역귀 분말 50g, 셀루클라스트(Celluclast) 500㎕를 첨가하여 50℃에서 24시간 교반을 하며 가수분해를 시켰으며, 가수분해 반응이 끝나는 시점에 효소를 불활성화 시키기 위하여 100℃에서 10분간 끓여주었다. 3,000rpm에서 20분간 원심분리한 뒤, 상층액만을 여과한 후 1/10로 농축시킨 후 3배수 에탄올을 첨가하여 5℃에서 24시간 동안 당을 침전시켰다. 침전된 당을 회수하기 위하여 10,000rpm에서 20분간 원심분리하여 당을 얻고, 당에 포함되어 있는 알긴산을 제거하기 위하여 3배수에 달하는 4M 염화칼슘을 첨가하여 5℃에서 6시간 반응하여 알긴산을 침전시킨 후, 원심분리(10,000rpm, 20분)하여 알긴산을 제거하였다.

상층액에 다시 3배수 에탄올을 첨가하여 5℃에서 24시간 동안 반응하여 당을 얻고, 원심분리(10,000rpm, 20분)하여 얻어진 당을 동결건조하여 실험에 사용하였다.

2) 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸의 혼합방법

미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 표 1에 기재된 중량비(w/v)로 혼합하여 표 1의 혼합 시료를 제조하였다. 혼합비율에 따른 항노화 기능의 상승효과를 확인하기 위하여 총 36개의 혼합시료를 만들었다.

미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합시료 혼합비율(중량비율w/v)

혼합 시료명칭	미역귀 추출물 (UPEF)	감태 추출물 (ECE)	글리코사미노글리칸 (GAGs)
118	1	1	8
127	1	2	7
136	1	3	6
145	1	4	5
154	1	5	4
163	1	6	3
172	1	7	2
181	1	8	1
217	2	1	7
226	2	2	6
235	2	3	5
244	2	4	4
253	2	5	3
262	2	6	2
271	2	7	1
316	3	1	6
325	3	2	5
334	3	3	4
343	3	4	3
352	3	5	2
361	3	6	1
415	4	1	5
424	4	2	4
433	4	3	3
442	4	4	2
451	4	5	1
514	5	1	4
523	5	2	3
532	5	3	2
541	5	4	1
613	6	1	3
622	6	2	2
631	6	3	1
712	7	1	2
721	7	2	1
811	8	1	1

B. 실험결과

<비교실험예 1> 단일시료의 미백 효능 평가

도 1은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)이 갖고 있는 미백 활성을 알아보고자 단일시료의 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성을 측정한 것으로, 티로시나아제 저해 활성은 티로시나아제에 의해 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하였다. 각 시료들을 농도별 (25, 50 및 100㎍/㎖)로 처리하여 티로시나아제 저해 활성을 측정한 결과, 감태 추출물(ECE) 농도 50 및 100㎍/㎖의 농도에서 양성 대조군(positive control)인 알부틴(arbutin)보다도 저해활성이 더 우수함을 확인하였다.

도 2는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료의 멜라닌 생성 억제 활성 효과를 측정한 것이다. 각 시료들의 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하고자 농도별 (25, 50 및 100㎍/㎖)로 처리하여 멜라닌 함량을 확인한 결과 감태 추출물(ECE) 시료에서 농도의존적으로 멜라닌 함량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 또한 미역귀 추출물(UPEF) 및 글리코사미노글리칸(GAGs)의 100㎍/㎖ 농도에서 멜라닌 함량이 유의적으로 줄었음을 확인하였다.

또한, 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 제브라피쉬 모델에서의 미백 효과를 확인하였다. 제브라피쉬는 인간과 매우 유사한 유전자를 가지고 있어 최근 각광받고 있는 동물모델이다. 기존의 마우스 모델과 비교하였을 시 좁은 공간에서도 사육이 가능하며 비교적 관리가 편하고, 마우스에 비해 가격이 싸며, 생애 주기가 짧아 실험하기에 매우 용이하기 때문에 제브라피쉬를 활용하여 미백 활성을 측정하였다.

도 3은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료의 미백 활성을 제브라피쉬 모델에서 측정하기 위해 먼저 독성을 확인한 것이다. 산란된 후 8시간이 되는 제브라피쉬 배아에 각 시료들을 농도별(25, 50㎍/㎖)로 부화가 되기까지 계속 처리하였으며 부화되는 숫자를 세어 생존율을 측정하였다. 그 결과, 미역귀 추출물(UPEF) 50㎍/㎖ 농도에서 90%으로 생존율이 약간 떨어지는 것을 확인하였으나 유의적인 차이는 없어 모든 시료에서 독성이 없음을 확인하여 동일한 농도로 미백 활성 실험을 진행하였다.

도 4는 제브라피쉬 모델에서 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료를 각 25, 50㎍/㎖ 농도별로 처리한 후 미백 활성을 비교한 것이다. 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 미백 활성을 측정하기 위해 산란된 후 8시간이 되는 제브라피쉬 배아에 각 시료들을 농도별(25, 50㎍/㎖)로 35시간까지 처리한 후 부화가 되었을 때 멜라닌 함량을 확인하였다. 제브라피쉬 larva 이미지 및 멜라닌 함량을 모두 측정하였으며, 그 결과를 살펴보면 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 시료들을 처리하였을 시 농도 의존적으로 멜라닌 함량이 감소함을 확인할 수 있었으며, 감태 추출물(ECE) 및 글리코사미노글리칸(GAGs) 50㎍/㎖ 농도에서 미백 효능이 우수하였다.

<비교실험예 2> 단일시료의 주름개선 효능 평가

도 5는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 단일시료의 콜라게나아제(collagenase) 및 엘라스타아제(elastase) 저해활성 효능을 측정한 것이다. 양성대조군(Positive control)으로 주름개선 효능이 있다고 알려져 있는 에피갈로칼테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)를 사용하였으며 콜라게나아제(collaganase) 저해 활성의 경우 에피갈로칼테킨 갈레이트보다도 감태 추출물에서 저해 활성이 80%로 유의적으로 높은 활성을 나타냄을 확인하였다. 엘라스타아제(elastase) 저해 활성 또한 미역귀 추출물(UPEF)와 감태 추출물(ECE)에서 유의적으로 높은 저해활성을 가짐을 확인하였다.

<비교실험예 3> 단일시료의 세포재생 효능 평가

도 6은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 섬유아세포 증식능을 확인한 것이다. 마우스 섬유아세포인 NIH3T3 세포를 96well plate에 5×10⁴ cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 세럼(serum)을 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양 후, 시료를 처리한 다음 24시간 종료 2시간 전에 미리 BrdU 시약를 처리하였다. 처리 후 고정시약을 상온에서 30분간 반응 후 plate를 세척 후 BrdU 항체를 붙여 증식된 정도를 확인하였다.

양성 대조군(Positive control)로 표피생장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)를 사용하였으며, 미역귀 추출물(UPEF) 및 감태 추출물(ECE)에서 유의적으로 positive control보다 세포증식능이 우수함을 확인하였다.

도 7은 제브라피쉬 모델에서 상처, 피부재생 효능을 확인 실험을 도식화한 것이다.

도 8은 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 제브라피쉬 모델에서의 상처, 피부재생 효능 확인한 것이다. 제브라피쉬 larva 상태에서 꼬리 부분을 일정하게 자른 후 시료 처리 후 2일 간격으로 총 4일간 꼬리 부분이 얼마나 회복되었는지를 관찰하였다.

꼬리 부분을 자르고 시료 처리 후 2일째 되는 날(5 days)을 살펴보면 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 50㎍/㎖ 농도에서 완전히 회복되는 것을 확인할 수 있었으며, 4일째 되는 날(7 days)에는 25㎍/㎖ 농도에서도 회복되는 것을 확인하였다. 하지만 아무것도 처리하지 않은 control 그룹에서는 4일째에도 회복이 다 되지 않았음을 확인하였다.

<실험예 1> 혼합시료의 미백 효능 평가

도 9는 혼합시료의 미백 효능을 평가하기 위해 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 티로시나아제 저해 활성 효과를 측정한 것이다. 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 상승효능이 있는지를 확인하기 위하여 총 36개의 혼합비율을 만들어 티로시나아제 저해 활성을 측정하였다(실시예 8의 표 1 참조).

혼합비율에 따른 시료의 티로시나아제 저해 활성 측정 결과, 감태 추출물(ECE)의 비율이 증가할수록 또는, 글리코사미노글리칸(GAGs)의 비율이 감소할수록 미백 활성이 증가함을 확인하였으며, 단일 시료를 처리하였을 때 보다 혼합 비율에 따라 상승효능을 갖는 시료들을 확인할 수 있었다. 따라서 상승효능을 갖는 혼합비율 중 262, 271, 352, 361, 433, 451, 721 총 7개를 선정하여 세포에서의 멜라닌 억제 활성을 확인하기로 하였다.

도 10은 티로시나아제 저해 활성을 통해 상승효능을 가지는 중 262, 271, 352, 361, 433, 451, 721 총 7개의 시료의 멜라닌 억제 활성을 비교한 것이다. 멜라닌 함량을 확인한 결과 모든 혼합비율에서 α-MSH 처리그룹보다 멜라닌 함량이 감소함을 확인하였고, 특히 352, 361, 451이 다른 혼합비율보다 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. 따라서 유의적인 차이가 있었던 352, 361, 451 혼합비율 시료를 이용하여, 제브라피쉬 모델에서의 미백 활성을 확인하였다.

가장 활성이 좋았던 352, 361, 451 혼합시료의 미백 활성을 제브라피쉬 모델에서 측정하기 위해 먼저 독성이 있는지를 확인하였다. 단일 시료 실험방법과 동일하게 진행하였다. 도 11은 상기 혼합시료의 독성을 확인한 결과이며, 모든 시료에서 독성이 없음을 확인하였다.

352, 361, 451 혼합비율 시료의 미백 활성을 단일 시료 실험방법과 동일하게 진행하였다. 도 12는 제브라피쉬 larva 이미지 및 멜라닌 함량을 모두 측정한 결과이며, 아무것도 처리하지 않은 control 그룹에 비해 시료들을 처리하였을 시 농도 의존적으로 멜라닌 함량이 감소함을 확인할 수 있었으며, 그 중 451 혼합비율 시료의 50㎍/㎖ 농도에서 유의적으로 가장 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 혼합시료의 주름개선 효능 평가

1) 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 콜라게나아제(Collagenase) 및 엘라스타아제(elastase) 저해 활성 효과

도 13과 14는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 상승효능이 있는지를 확인하기 위하여 총 36개의 혼합비율 시료의 콜라게나아제(collaganase) 및 엘라스타아제(elastase) 저해 활성을 측정한 것이다. 혼합비율에 따른 시료의 콜라게나아제(collaganase) 저해 활성 측정 결과, 글리코사미노글리칸(GAGs)의 비율이 증가할수록 저해활성이 증가함을 확인할 수 있었고, 엘라스타아제(elastase) 저해활성에서는 미역귀 추출물(UPEF) 및 감태 추출물(ECE)의 함량이 증가할수록, 글리코사미노글리칸(GAGs)의 함량이 감소할수록 저해활성이 증가함을 확인하였다. 또한 단일 시료를 처리하였을 때보다 혼합 비율에 따라 상승효능을 갖는 시료들을 확인할 수 있었다.

도 15와 16은 상승효능을 갖는 혼합비율 262, 271, 352, 361, 433, 451, 721 총 7개를 선정하고, 상기 혼합시료의 콜라게나아제(collaganase)와 엘라스타아제(elastase) 저해 활성들을 양성대조군(positive control)과 함께 다시 측정한 것이다. positive control로 에피갈로칼테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG) 및 우르솔산(Ursolic acid, UA)을 사용하였다. 효소들의 저해 활성들을 확인한 결과 모든 혼합비율에서 positive control보다 유의적으로 저해활성이 높았으며, 그 중 433, 721 혼합비율의 시료에서 높은 활성을 나타내었다.

도 17은 상기 7개의 혼합 시료를 처리한 세포에서의 프로 콜라겐(pro-collagen) 합성 촉진 효과를 측정한 것이다

세포외기질의 주요 구성 성분인 콜라겐(collagen)은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로 피부의 기계적 견고성, 결합 조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 등의 기능을 가지고 있다. 콜라겐(type I, II, III, IV, V)들은 프로 콜라겐(pro-collagen)이라는 전구물질의 형태로 합성이 되며, 콜라겐 중합 반응이 일어날 때 콜라겐 분자로부터 절단, 분리되는 기능을 가진 것으로 알려져 있다. 따라서 프로 콜라겐의 양을 측정함으로써 세포 내에서의 콜라겐 생합성 정도를 파악할 수 있다.

상승효능을 가지는 7개의 시료들의 프로 콜라겐(pro-collagen) 함량을 확인한 결과 352, 361, 451, 721 혼합비율에서 유의적으로 프로 콜라겐(pro-collagen) 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> 혼합시료의 세포재생 효능 평가

도 18에서는 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 세포재생 효능을 확인한 것이다. 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 상승효능이 있는지를 확인하기 위하여 총 36개의 혼합비율 시료의 섬유아세포 증식능을 확인하였다. 혼합비율에 따른 시료의 섬유아세포 증식능 측정 결과, 글리코사미노글리칸(GAGs)의 비율이 증가할수록 세포증식능이 증가함을 확인할 수 있었고, 세포증식능 또한 단일 시료를 처리하였을 때 보다 혼합 비율에 따라 상승효능을 갖는 시료들을 확인하였으며, 상승효능을 갖는 혼합비율 총 7개를 선정하였다.

섬유아세포 증식능을 측정결과를 통해 상승효능을 가지는 7개의 시료를 선택하였으며, 도 19에서는 상기 7개의 시료들의 세포재생 효능을 양성대조군(positive control)과 함께 다시 확인하였으며, positve control로 표피생장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)를 사용하였다. 세포재생 활성을 확인한 결과 352, 361, 433, 451, 721 혼합비율에서 positive control 보다 유의적으로 활성이 높았으며, 그 중 451 혼합비율의 시료에서 가장 높은 활성을 나타내었다.

도 20에서는 섬유아세포 증식능에서 유의적으로 효능이 좋았던 352, 361, 433, 451, 721 혼합비율 시료 중에서 미백 및 주름개선에서 공통적으로 활성이 좋았던 352, 361, 451 혼합비율의 시료들로 제브라피쉬 모델에서 상처 재생 효능을 확인하였다. 실험방법은 단일 시료 실험방법과 동일하게 진행되었으며 시료의 상처 재생 효능을 확인한 결과 아무것도 처리하지 않은 control 그룹을 제외한 모든 그룹에서 시료 처리 후 2일째 되는 날(5days)에 완벽하게 회복되는 것을 관찰할 수 있었다.

도 21은 451 혼합비율 시료의 세포이동(cell migration) 효능을 확인한 것이다. 그 결과 대조군에 비해 451 혼합비율 시료에서 세포이동이 증가한 것을 확인하였다.

도 22는 어떤 경로를 통해 세포재생이 일어나는지를 확인하기 위하여 p-EGFR과 p-AKT의 단백질 발현 정도를 western blot을 측정한 결과이다. 정량된 단백질 (40㎍)을 4×sample buffer을 사용하여 샘플링한 후 95℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE gel에 130V로 90분간 전기영동 하였다. 전기영동 후, 0.45㎛ 나이트로셀룰로오스 멤브레인(Nitrocellulose membrane)를 이용하여 단백질을 300 mA에 70분간 이동시켰다. 1×TBST에 5% 탈지유(skim milk)를 제조한 다음 1시간 실온에서 블락킹(blocking)하였고, 프라이머리 항체(primary anti-body)를 이용하여 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션(incubation)을 하였다. 모든 primary anti-body는 1% skim milk에 희석시켰다. 4℃에서 incubation 시킨 후, 상온에서 1×TBST로 10분간 3번, 총 30분 동안 washing 후, 1% skim milk에 1:3000으로 희석시킨 이차항체(secondary anti-body)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 incubation 시켰다. Secondary anti-body를 상온에서 부착 시킨 후, 1×TBST로 10분간 3번, 총 30분 동안 washing 후, ECL solution을 충분히 멤브레인(membarane)에 반응 시킨 뒤 Vilber Fusion solo 시스템으로 분석하였다.

분석결과, 양성대조군(positive control)인 표피생장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)의 경우는 표피생장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)와 결합하여 phosphor-AKT를 통해 세포증식이 일어나는 것을 확인하였지만, 451 혼합비율 시료의 경우는 EGFR 결합이 아닌 다른 수용체와 결합 후 하위기전인 phosphor-AKT를 통해 세포증식이 일어남을 확인하였다.

<실험예 4> 항산화 효능 평가

상기에서 선별된 7개의 시료 중 미백, 주름개선, 세포재생 활성을 종합적으로 평가했을 시 352, 361, 451 혼합비율 시료들이 가장 활성이 우수하였다.

도 23에서는 상기 352, 361, 451 시료의 제브라피쉬에서의 항산화 효능을 평가하기 위하여 5mM H₂O₂를 처리하였을 때, 생존율과 ROS 억제 활성을 측정한 것이다. 산란된 후 8시간이 되는 난에 352, 361, 451 혼합비율 시료를 25㎍/㎖에서 50㎍/㎖의 농도까지 처리한 후 1시간 뒤에 5mM H₂O₂를 처리하였다. 그리고 37℃에서 3일간 배양한 후 숫자를 세어 생존율을 측정하였다.

Control 그룹의 생존율이 약 96% 정도로 나타났고 5mM 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 그룹의 생존율은 60% 이하로 나타났다. 352 및 451 혼합비율 시료를 처리한 그룹은 농도가 증가할수록 생존율이 증가하여, 50㎍/㎖에서는 약 70%까지 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 과산화수소(H₂O₂)로 인한 산화적 스트레스에 대한 보호효과가 있음을 확인하였다.

도 24는 혼합비율 시료들의 제브라피쉬에서의 활성산소(reactive oxigen species, ROS) 소거활성을 확인한 것이다. 혼합비율 시료 및 H₂O₂를 처리하는 과정은 앞의 생존율 측정 실험과 동일하며, 3일 후 DCF-DA 시약으로 생성된 ROS를 염색하여 소거활성을 측정하였다.

제브라피쉬의 형광사진을 보면 아무것도 처리하지 않은 control 그룹에 비해 H₂O₂를 처리한 그룹이 더 밝은 형광을 띄고 있음을 확인할 수 있다. DCF-DA 시약은 ROS와 결합하여 녹색 빛의 형광을 발현해주는 시약이기 때문에 H₂O₂를 처리함으로써 제브라피쉬에서 ROS가 생성되었음을 확인 할 수 있다. H₂O₂를 처리함으로써 ROS의 양이 증가하였지만 451 혼합비율 시료 50㎍/㎖를 처리하였을 때 37% 가량 감소하는 것을 확인 하였다. 이로 인해 451 혼합비율 시료는 H₂O₂로 인하여 발생한 ROS에 대한 소거 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> 미역귀 추출물(UPEF), 감태 추출물(ECE), 글리코사미노글리칸(GAGs)의 혼합비율에 따른 352, 361, 451의 제브라피쉬 모델에서의 자외선 보호 효능

1) 혼합비율 시료들의 제브라피쉬 생존율 측정

도 25는 352, 361, 451 혼합비율 시료들의 제브라피쉬에서의 자외선(ultraviolet, UV) 보호 효능을 평가하기 위하여 자외선 B 50mJ/㎠을 조사하였을 때, 생존율과 NO 억제 활성을 측정한 것이다. 제브라피쉬 larva에 352, 361, 451 혼합비율 시료들을 25㎍/㎖에서 50㎍/㎖의 농도까지 처리한 후 1시간 뒤에 자외선 B 50mJ/㎠을 조사하였다. 그리고 37℃에서 3일간 배양한 후 숫자를 세어 생존율을 측정하였다.

Control 그룹의 생존율이 약 98% 정도로 나타났고 자외선 B를 조사한 그룹의 생존율은 85% 이하로 나타났다. 352, 361 및 451 혼합비율 시료들을 처리한 그룹들에서 50㎍/㎖ 농도일 때 약 95%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 자외선 B로 인한 스트레스에 대한 보호효과가 있음을 확인하였다.

2) 혼합비율 시료들의 제브라피쉬에서의 NO 소거활성

도 26은 혼합비율 시료 및 자외선 B 50mJ/㎠를 조사하고 3일 후 DAF-FM-DA 시약으로 생성된 NO를 염색하여 소거활성을 측정한 것이다.

제브라피쉬의 형광사진을 보면 아무것도 처리하지 않은 control 그룹에 비해 자외선 B 50mJ/㎠를 조사한 그룹이 더 밝은 형광을 띄고 있음을 확인 할 수 있다. DAF-FM-DA 시약은 NO와 결합하여 녹색 빛의 형광을 발현해주는 시약이기 때문에 자외선 B를 조사함으로써 제브라피쉬에서 NO가 생성되었음을 확인 할 수 있다. 자외선 B를 조사함으로써 NO의 양이 증가하였지만 451 혼합비율 시료 50㎍/㎖를 처리하였을 때 26% 가량 감소하는 것을 확인하여, 451 혼합비율 시료는 자외선 B로 인하여 발생한 NO에 대한 소거 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (12)

1. 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하며, 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸은 1:0.1~4:0.1~1의 중량비(w/v)로 혼합된 것인, 피부 미백, 주름 개선, 항산화, 자외선 차단 또는 피부 재생용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 미역귀 추출물은 미역귀의 셀루클라스트(Celluclast) 효소 추출물인 것인 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 미역귀 추출물은 후코이단을 포함하는 것인 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸은 멍게껍질에서 분리된 것인 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 감태 추출물은 폴리페놀과 디에콜을 포함하는 감태 에탄올의 추출물인 것인, 화장료 조성물.
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7. 제1항에 있어서, 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸은 4:5:1의 중량비(w/v)로 혼합된 것인, 화장료 조성물.
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9. 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하며, 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸은 1:0.1~4:0.1~1의 중량비(w/v)로 혼합된 것인, 피부 미백, 주름 개선, 항산화, 자외선 차단 또는 피부 재생용 의약외품 조성물.
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11. 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하며, 상기 미역귀 추출물, 감태 추출물 및 글리코사미노글리칸은 1:0.1~4:0.1~1의 중량비(w/v)로 혼합된 것인, 피부 재생용 피부외용제 조성물.
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