KR102289551B1

KR102289551B1 - 복합 히아루론산을 함유하는 화장료용 조성물

Info

Publication number: KR102289551B1
Application number: KR1020190086168A
Authority: KR
Inventors: 이재섭; 배준태; 김석종; 차영권; 조항의; 정주태; 소경석
Original assignee: 주식회사 제이투케이바이오; 주식회사 코스메카코리아
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2021-08-13
Also published as: US11110117B2; US20210015847A1; KR20210009526A; CN112237552A

Abstract

본 발명은 복합 히아루론산을 함유하는 화장료용 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 히아루로닉액시드, 소듐히아루로네이드, 하이드롤라이즈드히아루로닉액시드가 혼합되어 구성된 복합 히아루론산이 조성물 전체에 대하여 0.001 ~ 3 중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 하여, 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과가 우수한 화장료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 복합 히아루론산은 활성산소 소거효과 뿐만아니라, 사람섬유아세포에서 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진에 의한 피부 탄력 및 잔주름 개선효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 개선효과, 항염효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 가진다.

Description

복합 히아루론산을 함유하는 화장료용 조성물{A skin-care agent containing hyaluronic acid complex}

본 발명은 유효성분으로 복합 히아루론산을 함유하는 화장료용 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 히아루로닉애씨드, 소듐히아루로네이드 및 하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드를 유효성분으로 함유하는 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과가 우수한 화장료용 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological)와 광노화(phtoaging) 두가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 또한, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 collagen, hyaluronic acid, elastin, proteoglycan, fibronectin등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화 시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 활성산소종 뿐만 아니라 MMP라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 자외선에 의해 세포내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 MMP 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.

다음으로 피부질환이란 사람을 포함한 포유동물의 머리털과 손톱, 발톱을 포함하는 모든 피부에 나타나는 이상 소견을 의미하는 것으로, 아토피 알러지를 가진 사람에게서 나타나는 아토피 피부염(atopic dermatitis)이 대표적인 질환이다. 아직까지 아토피 피부염의 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 아토피 피부염 환자의 약 70%에서 아토피의 병력이 있었으며, 알레르기성 체질인 사람에서 호발하고, 특히 다른 알러지 질환인 알러지성 비염, 천식 등을 동반하여 유전적 요인이나 면역 질환의 하나로 이해하고 있다. 이 병의 특징으로 초기의 심한 가려움증에 의해 대부분이 피부를 긁고 이에 따른 2차 감염과 특히 환자의 정신적 안정 및 감정의 상태에 따라 더욱 악화될 수도 있다. 아토피 피부염은 상당히 많은 사람들이 앓고 있는데, 전 인구의 0.5~1%가, 어린이의 경우는 5~10%가 고통 받고 있다. 증상이 나타나는 시기는 대체로 생후 2~6개월 내이며, 특히 1세 미만의 영아에게서 가장 많이 나타나고, 85%가 만 다섯살 안에 나타난다. 아토피성 피부염은 주로 유아기에 자주 발생하지만, 최근에는 사춘기 이후의 환자가 증가하고 있고, 그 병력도 매우 길어지고 있다. 아토피성 피부염의 치료에는, 높은 약리효과를 기대할 수 있는 부신피질 호르몬 등의 약제가 사용되고 있다. 그러나, 이와 같은 부신피질 호르몬제의 부작용이 문제가 되고 있고, 환자는 치료기간 중에 부작용의 위험에 노출되어 있다. 더욱이, 부신피질 호르몬제의 사용 중지에 의하여 리바운드(약물의 사용정지 후에 일어나는 극적인 환부의 병세악화)가 생기는 것도 잘 알려져 있다. 이와 같은 부작용의 대책으로서, 부신피질 호르몬 등의 호르몬을 포함하지 않는 비스테로이드성 항염증제 또는 항히스타민제 등이 사용되고 있으나 완치가 어려운 상태이다. 따라서, 부작용이 없는 아토피 피부염의 경감 또는 치료제 개발이 매우 절실한 실정이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341호(특허문헌 1)에는 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora mukul)추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평9-672662 는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다. 대한민국 특허 제 0431076호(특허문헌 2)는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제 0511494호(특허문헌 3)는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국 특허출원 공개 제 2004-0065126호(특허문헌 4)는 천연의 영지버섯, 유근피, 감초, 백봉령, 백지마 및 백년초 등으로부터 얻은 한방 식물 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유와 예방에 효과를 갖는 한방 화장료 조성물을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허출원 공개 제 2004-0011584 호(특허문헌 5)는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.

또한 다음으로, 남성형 탈모증은 남성호르몬 의존적이어서 남성호르몬의 양에 직접적인 관계가 있으며, 이에 따라 최근 남성호르몬 활성억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 한편, 남성호르몬의 분비상승에 의해 피지선의 기능이 상승되면 생성된 과잉의 피지가 모낭벽의 과각화로 인하여 모낭 내에 정체되면서 생기는 면포가 여드름의 초기단계이다. 남성호르몬에 의한 탈모 및 여드름의 기전을 설명하면, 5알파-리덕타아제(5α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환 등의 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하며 남성 호르몬들 중 하나로서, 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 대사시키는데 관여하는 효소이며, 그 전환에는 NADPH를 필요로 한다. 또한, 테스토스테론(testosterone)은 남성 성충동, 골격근 증가, 남성외부생식기, 음낭성장, 정자형성 등에 관여하고, 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)은 여드름, 피지증가, 탈모 및 전립선비대증 등의 해당 조직에 관여 한다. 특히, 사춘기 이후에 남성 호르몬의 과량 분비는 여드름과 탈모를 유발하는데, 5알파-리덕타아제에 의하여 남성 호르몬의 활성형태인 디하이드로테스토스테론의 과량 생성을 막기 위해 5알파-리덕타아제 억제제를 사용하여 탈모방지 및 여드름 방지제를 개발하려는 연구들이 활발이 진행되고 있다.

이러한 피부의 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 이에, 본 발명자들은 이제까지 알려진 다양한 분자량 히아루론산을 이용하여 화장품에 적용하여 연구한 결과, 단일 분자량의 히아루론산에 비해 복합 히아루론산 조성물을 제조하여, 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 측정한 결과, 그 효과가 우수하여 화장료로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

히아루론산(hyaluronic acid)은 N-아세틸 글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어지는데, 세포외 기질에 존재하여 피부 내 수분유지, 세포 성장인자 및 영양분을 저장 및 확산에 관여하며, 섬유아세포와 각질형성세포에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다. 이러한 히아루론산은 피부의 수분 증발 현상을 막아주며 얇고 투명한 수분 보습막 역할하고, 외부 유해환경으로부터 피부 깊숙이 침투하는 것으로도 알려져 있다.

US 5,947,341 (1999.09.07) KR 10-0431076 (2004.04.29) Kr 10-0511494 (2005.08.24) KR 10-2004-0065126 (2004.07.21) KR 10-2004-0011584 (2004.02.05)

본 발명은 분자량 크기가 다른 히아루로닉애씨드(분자량;2,000 kDa), 소듐히아루로네이드(분자량;1,300 kDa) 및 하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(분자량;7 kDa)의 복합 히아루론산을 이용하여, 화장료용 조성물의 원료로서의 효능을 확인하고, 그 사용 방법을 개발하고, 이 원료를 사용함으로써 우수한 기능성을 갖는 화장료를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과, 항염효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 복합 히아루론산 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용 시 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화효과를 나타내는 복합 히아루론산 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용시 보습효과 및 아토피 피부 개선에 효과를 나타내는 복합 히아루론산 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장표에 적용시 우수한 모발손상방지효과, 탈모 방지효과, 육모효과 및 여드름 방지효과를 갖는 복합 히아루론산 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 복합 히아루론산 조성물을 이용하여 화장료를 제조하는 방법 및 그 화장료를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 복합 히아루론산을 함유하는 화장료용 조성물은 상기한 과제를 해결하기 위하여, 히아루로닉액시드, 소듐히아루로네이드, 하이드롤라이즈드히아루로닉액시드가 혼합되어 구성된 복합 히아루론산이 조성물 전체에 대하여 0.001 ~ 3 중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 한다.

상기한 구성에 있어서, 상기 화장료용 조성물은 노화 방지 효과를 구비한 것을 특징으로 한다.

또, 상기 화장료용 조성물은 자극 완화 기능을 구비한 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 화장료용 조성물은 아토피 피부 개선 기능을 구비한 것을 특징으로 한다.

삭제

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 복합 히아루론산은 활성산소 소거효과와 MMP 저해 효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 피부 잔주름 개선효과등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한, 복합 히아루론산은 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화 및 아토피 개선효과를 나타내었다.

또한, 복합 히아루론산은 우수한 모발손상 및 탈모방지 효과와 여드름방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성과 5알파-리덕타아제 억제 효과를 나타내었다.

따라서, 이러한 복합 히아루론산을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과, 보습, 모발손상 방지, 탈모 방지, 여드름방지, 아토피 개선효과, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 가짐을 알 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히아루로닉액시드, 소듐히아루로네이드, 하이드롤라이즈드히아루로닉액시드가 혼합되어 구성된 복합 히아루론산 조성물('이하 복합 히아루론산'이라 칭한다.)이 조성물 전체에 대하여 0.001 ~ 3 중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 복합 히아루론산은 분자량 크기가 다른 히아루로닉애씨드(분자량;2,000 kDa), 소듐히아루로네이드(분자량;1,300 kDa) 및 하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(분자량;7 kDa)가 정제수에 혼합 분산된 조성물을 칭한다.

복합 히아루론산의 조성은 히아루로닉애씨드 0.05~2.0중량%, 소듐히아루로네이드 0.05~2.0중량% 및 하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드 0.05~2.0중량%, 잔량의 정제수로 구성될 수 있다.

더하여, 화장료용 조성물에서 상기 복합 히아루론산의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 3.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 화장료용 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합 히아루론산을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료용 조성물을 제공한다.

삭제

복합 히아루론산은 캡슐제, 액상제, 연고제, 첩부제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 서방화제제 등의 약학 조성물로 제제화 할 수 있으며, 약리학적으로 허용되는 기제, 운반제, 부형제, 결합제(예: 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스), 분쇄제(예: 한천, 전분, 벨라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨), 윤활제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 수첨 식물유) 및 착색제 등을 포함한다. 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용한다.

상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.

이와 같이 제조되는 약학 조성물은 증상에 따라 일일 1회 내지 수회 피부에 적용할 수 있으며 증상의 호전정도에 따라 적용을 조절할 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 복합 히아루론산 제조

분자량 크기가 다른 히아루론산 파우더로, 히아루로닉애씨드(분자량;2,000 kDa) 0.2g(0.05중량%), 소듐히아루로네이드(분자량;1,300 kDa) 0.2g(0.05 중량%) 및 하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(분자량;7 kDa) 5g(1.25중량%)을 정제수 394.6g에 혼합시켜 복합 히아루론산을 제조하였다.

실험예 1: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 단일 분자량의 히아루론산과, 항산화제로 잘 알려진 BHT(butylated hydroxytoluene)를 비교샘플로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가하였다.

크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키는데, 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정하였다.

측정방법으로써, 바이엘병에 0.05M Na₂CO₃2.4ml, 3mM 크산틴 용액 0.1ml, 3mM EDTA 용액 0.1ml, BSA 용액 0.1ml, 0.72mM NBT 용액 0.1ml를 가하고, 여기에 각 시료용액 0.1ml를 첨가한 다음 25℃에서 10분간 방치하였다.

그런 다음 크산틴 옥시다제 용액 0.1ml를 가하여 빠르게 교반한 다음 25℃에서 20분간의 배양을 개시하며, 이어 6mM CuCl₂ 용액 0.1ml를 가하여 반응을 정지시킨 후, 560nm에서의 흡광도 St를 측정하였다.

공시험은 시료용액 대신 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정하고, 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 크산틴 옥시다제 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

<수학식 1>

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

시료명	세포내 항산화효과(%)
실시예 1, 0.1중량%	89%
히아루로닉애씨드(2,000 kDa), 0.1중량%	72%
소듐히아루로네이드(1,300 kDa), 0.1중량%	70%
하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(7 kDa), 0.1중량%	23%
BHT, 0.1중량%	87%

상기. 표 1에서 확인할 수 있듯이 단일 분자량의 히아루론산 보다 복합 히아루산이 우수한 항산화력을 갖고 있었으며, BHT와 유사한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다.

실험예 2: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 단일 분자량의 히아루론산과 BHT와 같은 항산화제를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하며, 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공 시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 각각의 시료를 0.1% 농도로 시료를 준비하였다. 상기 농도의 시료를 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

<수학식 2>

자유라디칼 소거활성(%)= 100-(B/A)X100

A: 시료를 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 시료를 처리한 실험군 웰의 흡광도

수학식 2에서 산출된 자유라디컬 소거활성은 아래 표 2에 나타냈다.

시료명	자유라디컬 소거활성(%)
실시예 1, 0.1중량%	85.2%
히아루로닉애씨드(2,000 kDa), 0.1중량%	75.4%
소듐히아루로네이드(1,300 kDa), 0.1중량%	78.6%
하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(7 kDa), 0.1중량%	34.7%
BHT, 0.1중량%	81%

상기, 표 2에서 확인할 수 있듯이 복합 히아루론산은 단일 분자량의 히아루론산과 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT 보다 자유라디컬 소거활성능이 더 우수한 것을 알 수 있었다.

실험예 3: 세포내 활성산소 소거효과

실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산의 자외선에 의해 세포내에서 생성되는 활성산소 생성 억제효과 즉, 활성산소 소거효과를 알아보기 위하여 비교샘플로 단일 분자량의 히아루론산과 EGCG로 하고, 형광물질을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양 받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 ×10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA)배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 1일간 배양한 후, 0.01% 농도로 시료를 처리하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후 HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이 후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트리더(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다. 이후 UVB(20mJ/cm²)를 조사하고 시료 처리 후 형광도를 형광플레이트 리더(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다.

표 3에서 확인할 수 있듯이 복합 히아루론산은 활성산소 소거효과에 비교 시료로 많이 이용되고 있는 EGCG와 비슷한 우수한 활성산소 소거 효과를 갖고 있음을 알 수 있었다.

시료명	활성산소 소거효과(%)
실시예 1, 0.01중량%	46
히아루로닉애씨드(2,000 kDa), 0.01중량%	42
소듐히아루로네이드(1,300 kDa), 0.01중량%	38
하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(7 kDa), 0.01중량%	27
EGCG 0.01중량%	45

실험예 4: in vitro MMP-1 활성저해 실험

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-Collagen, 효소(collagenase)는 Molecular probe사 (Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl₂, 2 mM sodium azide, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100 ㎕에 0.25 ㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ collagen 20 ㎕와 시료(0.02중량%) 40 ㎕을 첨가하고 0.5 unit로 희석한 collagenase 40 ㎕을 첨가한다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출파장 515 nm로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

결과는 표 4에 나타냈으며 복합 히아루론산을 0.02% 처리 시, 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성을 79% 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과 보다 우수하게 나타났다.

시료명	저해율(%)
실시예 1, 0.02중량%	79
히아루로닉애씨드(2,000 kDa), 0.02중량%	64
소듐히아루로네이드(1,300 kDa), 0.02중량%	58
하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(7 kDa), 0.02중량%	21
녹차추출물 0.02중량%	72

실험예 5: 자외선 조사 후 복합 히아루론산에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 복합 히아루론산은 37% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀과 유사한 억제율을 나타내었다.

시험군	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-
실시예 1, 0.02중량%	37
히아루로닉애씨드(2,000 kDa), 0.02중량%	30
소듐히아루로네이드(1,300 kDa), 0.02중량%	28.1
하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(7 kDa), 0.02중량%	15
레티놀	38

실험예 6: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산 첨가 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×10⁴cell/cm²농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 복합 히아루론산과 단일 분자량 히아루론산을 각각 0.02% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 6에 나타냈으며 복합 히아루론산을 0.02% 처리 시, 프로콜라겐의 생합성은 30% 촉진하였으며 이는 세포신호전달 물질은 TGF-β와 유사한 효과를 나타내었다.

시료명	프로콜라겐 생합성촉진효과(%)
실시예 1, 0.02중량%	30%
히아루로닉애씨드(2,000 kDa), 0.02중량%	14%
소듐히아루로네이드(1,300 kDa), 0.02중량%	11.1%
하이드롤라이즈드히아루로닉애씨드(7 kDa), 0.02중량%	-
TGF-β 0.001중량%	35%

실험예 7: 복합 히아루론산의 엘라스틴 생성 촉진 효과

복합 히아루론산의 엘라스틴 생성 촉진 효과를 알아보기 위하여, 사람으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 사람의 섬유 아세포에 상기 실시예 1의 복합 히아루론산을 처리하여 엘라스타제(elastase) 활성의 억제효과를 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 사람의 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70∼80 % 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후 복합 히아루론산을 1일간 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J.Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)]. 즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala) 3 NA를 이용하여, NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타제의 활성도를 측정하였다. 이때 복합 히아루론산을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 복합 히아루론산은 대조군에 비하여 엘라스타제의 활성을 뛰어나게 억제함을 알 수 있으며, 활성 억제율은 복합 히아루론산의 농도가 증가할수록 높아짐을 확인하였다. 이를 통하여 복합 히아루론산이 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.

시료명	물질 활성 억제율 (%)
실시예 1, 0.02중량%	26%
실시예 1, 0.01중량%	17%
실시예 1, 0.005중량%	7.8%
대조군	0%

실험예 8: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ul의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 복합 히아루론산을 처리한 후 24시간동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 3에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 4에 의하여 계산하였다.

<수학식 3>

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

<수학식 4>

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

계산 결과는 아래의 표 8에 나타냈다.

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
실시예 1	0.02	30.6
	0.01	19.5
	0.005	8.4

표 8에 나타낸 바와 같이ㅏ 실험결과 복합 히아루론산은 자외선에 의한 세포 독성을 0.02% 농도에서 30.6%의 세포독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

즉, 상기 실험을 통해 자외선에 의한 세포손상을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

실험예 9: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 복합 히아루론산을 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 복합 히아루론산의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 5에 의해 계산하였다.

<수학식 5>

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

상기 수학식 5에 따른 실험 결과는 아래 표 9에 나타냈다.

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
실시예 1	0.02	27
	0.01	15.2
	0.005	10.5

표 9에 나타난 바와 같이 복합 히아루론산은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.02% 농도에서 27% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

실험예 10: 자외선조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제 효과

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산의 프로스타글란딘 생합성 억제 효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고, 18시간동안 배양한 다음, 상기의 각질형성세포에 최종농도가 50uM이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E₂ synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 COX)의 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 복합 히아루론산을 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 적당량 취하여 16시간동안 생합성된 PGE₂(prostaglandin E₂)를 정량함으로서 복합 히아루론산의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다. PGE₂의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)를 이용하여 정량화하였으며 실험결과는 아래 표 10에 나타냈다.

시료명	PGE₂ 억제율(%)
(-) UV B	control
(+) UV B	-
(+) UV B + 실시예 1 0.02중량%	34%
(+) UV B + 실시예 1 0.01중량%	21%
(+) UV B + 실시예 1 0.005중량%	9.5%

상기 표 10에 나타난 바와 같이 복합 히아루론산은 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. 특히 생성되는 PGE₂는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 복합 히아루론산이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 알 수 있다.

실험예 11: 복합 히아루론산의 5알파-리덕타아제 활성 억제력 평가실험

5알파-리덕타아제 활성억제 실험에 사용된 5알파-리덕타아제는 포피 유래의 섬유아세포가 생성하는 효소를 사용하였다.

섬유아세포를 마이크로플레이트 홀(microplate hole)마다 1x10⁴개의 세포가 들어가도록 접종한 후 배양한다. 각 홀마다 ³H(트리튬)으로 방사선표지(radio labelling)된 테스토스테론을 0.1.mμ.Ci 첨가한 후에 배양하므로 섬유아세포가 이를 이용하는지 측정한다. 복합 히아루론산이 들어가지 않은 것을 대조군으로 삼는다. 24시간 배양 후 상등액을 얻고 에틸아세테이트(ethyl acetate)-사이크로헥산(cyclohexane) (1:1) 추출용매 1㎖로 스테로이드(steroids)를 얻는다. 이 얻어진 스테로이드를 박막크로마토그래피판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액(98/2 (v/v))로 전개시킨다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론에 해당하는 점의 방사활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 대조군(추출물을 첨가하지 않았을 때의 전환율)과 비교하여 하기 수학식 6에 의해 5알파-리덕타아제 저해능을 평가하였다.

<수학식 6>

저해능 평가방법

저해능(%)=[A-B]/[A] ×100

A=테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 미첨가시)

B=테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 첨가시)

상기 수학식 6에 의한 계산 결과는 아래 표 11에 나타냈다.

실시예 1 농도(%)	0.02	0.01	0.005
저해율(%)	32.5	14.7	9.1

표 11을 살펴보면, 복합 히아루론산은 5알파-리덕타아제 저해효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 12: Compound 48/80에 의한 아토피 피부염 유발 후 복합 히아루론산의 항염증 실험

BALB/c 마우스(5wks, male)의 등쪽 목부위 피부의 진피내로 마리당 30㎕의 compound 48/80 (Sigma, Co.; 1㎎/㎖ in saline)을 주사한 후 cage에 집어넣고 60분 동안 마우스가 목을 긁는 행동을 관찰하였다. 복합 히아루론산의 항염 치료 효능을 검정하기 위하여 compound 48/80을 주사하기 5일전부터 복합 히아루론산들을 250㎕/㎖의 농도로 마리 당 100㎕씩 mouse의 등쪽 목 부위에 도포하였다. 도포방법은 5일 동안 하루에 두 번씩 총10회에 걸쳐 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하여 전처리 한 다음 compound 48/80을 주사한 후 총 1시간동안 5분 간격으로 마우스가 뒷발로 목을 긁는 시간을 측정하여 소양증 정도를 측정하였다.

실험 결과는 표 12에 나타냈다.

	Number of scratching (in 5min)
	5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60
실시예 1	29	34	34	34	32	33	39	40	42	36	29	25
대조군	37	48	49	60	82	95	94	78	56	47	39	35

상기 표 12에 나타난 바와 같이 복합 히아루론산을 사용하는 경우 compound 48/80에 의한 아토피 피부염 (피부 소양증) 유발을 억제하는 효과를 나타내었다.

실험예 13: 수분 흡습성 실험

복합 히아루론산의 수분 흡습성을 실험하기 위하여, 인간으로부터 직접 채취하거나 또는 상업적으로 구입한 사람의 건조 표피세포에 상기 실시예 1의 복합 히아루론산과 증류수를 각각 포화 흡수시키고 흡수된 물의 양을 측정한 후, 48시간 건조후의 질량변화를 측정하였다. 각각의 측정된 질량의 변화로부터 피부세포 단위 질량 당 흡수된 물의 양을 비교하였다. 이러한 실험은 표피세포에 흡습되는 물의 양을 비교하기 위한 방법으로 실제 사람의 피부에 있어서도 그 보습효과를 예상할 수 있는 한가지 방법으로 사용되고 있다.

구체적으로, 사람의 표피세포를 건조시켜 단위질량 당 함유된 수분의 양을 일정하게 만든 후, 각각의 표피세포 시료의 무게와 함유된 물의 양을 카이저 방법(Kaiser method)을 사용하여 측정하였다. 물의 함량이 측정된 표피세포를 복합 히아루론산(A), 정제수(B)에 각각 24시간 담지하여 포화 흡수시켜준 뒤, 세포 내에 물이 포화흡수된 표피세포를 꺼내서 무게를 달고, 일부를 채취하여 카이저 수분측정기로 함유되어 있는 단위질량 당 수분의 양을 측정하였다. 이후 다시 48시간 감압건조시키고 무게를 달고난 후, 일부를 채취하여 카이저 방법에 의해 수분량을 측정하여 함유되어 있는 단위질량 당 수분의 양을 측정하였다.

실험 결과 표피세포에 대한 수분공급능력(수분 mg/표피세포 질량 g)은 표 13에 나타냈다.

	수분함량
	초기 건조상태	포화상태	건조 후
실시예 1 + 정제수	400	810	560
정제수	400	770	400

상기 표 13에 나타낸 바와 같이, 복합 히아루론산으로 포화 흡습시킨 표피세포가 정제수에 의하여 포화흡습된 표피세포의 재건조 과정에 있어 정제수보다 훨씬 많은 물을 함유하고 있음을 확인할 수 있었으며, 이로부터 복합 히아루론산의 우수한 피부 흡습성을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 복합 히아루론산이 우수한 보습 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 14: 복합 히아루론산과 사람 모발 단백질의 결합 효과

사람 모발 케라틴 단백질 50 ㎍에 복합 히아루론산을 각각 0.02, 0.01, 0.005중량%의 시험 농도로 첨가하고 상온에서 30 분 동안 반응시킨 후, 6 % 과산화수소와 0.5 % 암모니아의 1:1 혼합 용액으로 처리하여 30분 동안 반응시켰다. 반응액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동하고 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10 % 빙초산 및 40 % 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색한 후 10 % 빙초산 및 40 % 에탄올의 혼합용액에서 탈색시키고 케라틴 단백질 밴드를 확인하였다. ImageMaster software(Amersham Pharmacia Biotech.)를 사용하여 50 ㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 밴드를 100 %로 하고, 복합 히아루론산을 처리하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 결합 효과를 %로 하기의 표 14에 표시하였다.

실시예 1	대조군	0.02%	0.01%	0.005%
모발단백질 결합효과	0	72%	47%	31%

상기 표 14에서 보듯이, 복합 히아루론산 함량이 증가함에 따라 모발 단백질 케라틴과의 결합 능력도 증가하는 것을 알 수 있다.

실험예 15: 알칼리와 과산화수소 처리에 의한 케라틴 용출에 대한 복합 히아루론산의 보호 효과

3 g의 모발을 10 ㎖의 과산화수소(6%)와 암모니아(1.68%)의 1:1 혼합용액에 넣고 복합 히아루론산을 각각 0.02, 0.01, 0.005중량%의 시험 농도로 첨가한 후에 상온에서 30 분 동안 처리하였다. 반응액 0.5 ㎖를 Rapid-Con protein concentration kit(Elpis Biotech.)를 사용하여 농축시키고 농축액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동한 후 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색하고 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 탈색시켜 케라틴 단백질 밴드를 확인하였다. ImageMaster software(Amersham Pharmacia Biotech.)를 사용하여 50 ㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 밴드를 100%로 하고, 복합 히아루론산을 처리하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 단백질의 결합 효과를 %로 하기의 표 15에 표시하였다.

실시예 1	대조군	0.02%	0.01%	0.005%
모발 용출 케라틴 단백질	100%	78%	87%	97%

상기 표 15에서 보듯이, 복합 히아루론산의 함량이 증가함에 따라 모발로부터 용출되는 케라틴 단백질 함량이 감소하는 것을 알 수 있었다.

실험예 16: 알칼리와 과산화수소 처리에 의한 모발 인장 강도와 신도에 대한 복합 히아루론산의 효과

3 g의 모발을 10 ㎖의 과산화수소(6%)와 암모니아(1.68%)의 1:1 혼합 용액에 넣고 복합 히아루론산을 각각 0.02, 0.01, 0.005중량%의 시험 농도로 첨가하여 상온에서 30 분 동안 처리한 후, 물로 씻고 바람에 건조시켜 Autograph 시험기에서 인장 강도(gf)및 신도(%)를 측정하였다. 다음 표 16는 이와 같이 처리한 모발의 인장 강도 및 신도를 나타낸 것이다.

실시예 1	정제수	0.02%	0.01%	0.005%
인장 강도 (gf)	113	121	116	113
신도 (%)	45	49.1	47.7	44.5

상기 표 16에서 보듯이, 탈색제를 30 분간 처리한 경우 복합 히아루론산의 첨가량이 증가함에 따라서 모발의 강도 저하가 억제된 것을 볼 수 있다. 이에 따라, 탈색제 처리를 실시한 경우, 복합 히아루론산에 의한 모발 보호 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

실험예 17 : 실시예 2의 제조 및 피부 탄력 개선 효과와 주름 개선 효과 비교 실험

실시예 2는 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산을 함유한 화장료로 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 17에 나타낸 바와 같다. 우선 표 17에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 2, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

원료		실시예 2	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	실시예 1	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

<단위: 중량%>

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였으며, 실험결과는 하기 표 18에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

실험제품	피부탄력효과(△R7)	비고
실시예 2	0.36
비교예 1	0.12

n=20, p＜0.05

표 18에서 나타난 바와 같이 복합 히아루론산을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

더하여, 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오 미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다.

그 결과를 하기 표 19에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter)값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 2	-0.25	-0.22	-0.11	-0.07	-0.06
비교예 1	-0.12	-0.08	-0.05	-0.04	-0.02
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

상기 표 19에 나타낸 바와 같이 복합 히아루론산을 함유한 실시예 2의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인 할수 있었다.

실험예 18 : 실시예 3의 제조 및 아토피성 피부염 개선 효과 비교 실험

실시예 3은 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산을 함유한 화장료로 제조하여 사람을 대상으로 아토피성 피부염 개선효과를 비교예 2와 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 20에 나타낸 바와 같다. 우선 표 20에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 3, 비교예 2)을 제조한다.

원료		실시예 3	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	실시예 1	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

아토피 피부 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 임상실험을 실시하였다. 5-30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피성 피부염을 앓고 있는 환자 30명에 대하여 아토피성 피부염 개선효과를 조사하였다. 동일인에게 왼쪽 손에는 실시예 3의 크림을, 오른쪽 손에는 비교예 2의 크림을 매일 저녁 세정 후, 피부에 1일 1회 60일간 도포하고 아토피성 피부염 상태 개선 정도를 측정하였다. 측정은 설문조사에 의한 관능평가로 실시하였다. 그 결과는 하기 표 21에 나타내었다.

	매우 좋다	좋다	그저 그렇다
실시예 3	70% (21명)	30% (9명)	-
비교예 2	10% (3명)	20% (6명)	70% (21명)

상기 표 21에 나타난 바와 같이 복합 히아루론산을 첨가하여 제조한 실시예 3의 크림이 복합 히아루론산이 첨가되지 않은 비교 제형예의 화장료보다 우수한 아토피성 피부개선 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 19 : SLS에 의한 피부자극 완화 효과 실험

본 실험예에서는 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 3에서 제조된 제품을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.3mg 씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

시험 결과 SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 복합 히아루론산을 함유하는 제품을 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

이 평가의 결과는 복합 히아루론산이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유의한 효과가 있음을 나타내었다.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 4내지 6에서 제조하였다. 이들 복합 히아루론산을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 4: 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 5: 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 6: 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

실험예 20 : 실시예 7의 제조 및 모기 기피 효과 실험

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 복합 히아루론산 0.05g, 분홍억새 발효액 0.03g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합용액을 첨가한 후 교반하여 모기 기피 효과가 있는 화장수를 얻었다.

분홍억새는 핑크뮬리, 서양억새 등으로 불리는 볏과의 식물로 학명은 ‘Muhlenbergia Capillaris’다.

분홍억새는 미국 서부나 중부의 따뜻한 평야 지대가 원산지로 알려져 있으며, 국내에는 제조도, 경주 등에서 경관용으로 많이 심어지고 있다.

아직까지 분홍억새를 화장수 원료로 사용한 사례는 보고되어 있지 않은 상태이다.

분홍억새 발효액은 분홍억새 잎을 수득한 다음, 분홍억새 잎, 소금, 식초를 1 : 1 : 2

의 비율로 혼합한 다음 15일 동안 발효시키고, 고형물을 분리한 상등액만을 수득한 것을 사용하였다.

아울러, 상기 실시예 4와 실시예 7의 화장수를 이용하여 모기 기피 효과를 실험하였다.

실험에 자발적으로 참여한 건강한 성인남자들의 손가락과 팔꿈치 사이에 실시예 4와 실시예 7의 시료를 골고루 도포한 후 2분간 자연건조시켰다.

실험자들의 시료가 처리된 팔과 아무것도 바르지 않은 실험자의 팔을 100마리의 빨간집모기 암컷이 수용된 50×50×50㎤의 바이오어세이 케이지(Bioassay cage)에 그물망을 씌운 것에 동시에 넣어서 30분 간격으로 3분 동안 팔을 흡혈하는 모기의 수를 기록하였다. 그 결과는 아래의 표 22에 나타내었다.

구분	흡혈모기수
구분	30분 경과	60분 경과	90분 경과	120분 경과	150분 경과	180분 경과
실시예 4	8	8	7	9	10	11
실시예 7	0	0	0	1	2	3

상기 표 22에 나타난 바와 같이 실시예 7에 따른 화장수를 도포한 실험자들의 팔은 전반적으로 탁월한 기피효과를 나타냈다.

Claims

화장료용 조성물에 있어서,
히아루로닉액시드, 소듐히아루로네이드, 하이드롤라이즈드히아루로닉액시드, 정제수로만 구성된 복합 히아루론산이 조성물 전체에 대하여 0.005 ~ 3 중량% 함유되어 있으며,
상기 히아루로닉액시드는 0.05 ~2.0 중량%, 소듐히아루로네이드는 0.05 ~2.0 중량%, 하이드롤라이즈드히아루로닉액시드는 0.05 ~2.0 중량% 함유되고, 정제수는 잔량으로 이루어지며,
피부 노화 방지, 피부 자극 완화, 아토피 피부 개선 및 탈색 처리에 대해 모발 보호 효과를 구비한 것을 특징으로 하는,
복합 히아루론산을 함유하는 화장료용 조성물.
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