KR20220074403A - Atage-2006을 이용한 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 in vitro, 피부 세포 및 동물 모델에서 자외선에 의해 발생하는 피부 주름 및 피부 노화를 효과적으로 개선할 수 있으므로, 피부 주름 개선제 또는 피부노화 방지제 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

ATAGE-2006을 이용한 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화 개선용 조성물{Composition for improving skin wrinkle or skin aging by ultraviolet rays using ATAGE-2006}

본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화 개선 용도에 관한 것이다.

피부는 신체의 가장 바깥에 존재하는 기관으로, 외부 환경으로부터 우리 몸을 보호하는 역할을 수행한다. 그러나 피부는 다른 기관들에 비해 외부 자극에 많이 노출되어 있어 쉽게 공격받을 수 있고, 자외선 등에 직접적으로 노출되어 있어 피부 주름 및 노화가 발생하기 쉽다.

주름개선 및 노화 방지를 위한 종래 소재로는 주로 비타민C, α-토코페롤, 레티놀 및 그의 유도체 등이 화장품 및 의약품에 배합되어 이용되어 왔으나, 이들은 제형에 배합되었을 경우 변취 현상이 발생하거나 화학적 안정성이 좋지 못하다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 천연물 유래 물질을 이용한 피부 주름 및 피부 노화 개선용 화장료 조성물의 발굴이 요구된다.

한편, 홍조류를 구성하는 주요한 다당체는 아가로스이며, 아가로스는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(이하 'AHG'라 함)와 D-갈락토오스가 알파-1,3-결합과 베타-1,4-결합이 교차적으로 번갈아 가며 연결되어 있는 중합체이다. 이중, AHG의 피부 미백, 항충치 기능성, 대장암 예방 기능성 등이 일부 보고되어 있다.

그러나, 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화에, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 갖는 효과에 대해서는 알려진 바가 없다.

이에 본 발명의 발명자는 그런 문제점을 해결하기 위해서 오랫동안 연구하고 시행착오를 거치며 개발한 끝에 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)의 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화 개선 용도를 제공하는 것이다.

본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제들은 상기 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명자는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose; 이하, 'AHG')가 피부 세포 및 동물 모델 등에서 자외선에 의한 피부 주름 및 피부 노화를 효과적으로 개선할 수 있음을 실험적으로 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는, 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명에서, AHG는 당업계에 공지된 문헌을 참조하여 합성하거나 또는 상업적으로 용이하게 입수될 수 있다.

자외선은 피부에서 나타나는 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 유발하며, 이는 대부분 세포외기질(extracellular matrix) 단백질의 변화로 인해 발생하는 현상으로, 진피층에 존재하는 결합조직인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산 등의 파괴가 원인으로 지목된다. 특히 이 중에서도 MMP(matrix metalloproteinases)가 기질 단백질을 분해하는 대표적인 효소로 알려져 있다. MMP는 단 한 번의 자외선 조사에 의해서도 그 활성이 현저히 증가되어 콜라겐을 비롯한 여러 기질단백질을 분해함으로써 주름 형성을 가속화한다. 자외선에 의한 피부 노화가 진행된 피부에서는 깊고 굵은 주름 생성과 함께 피부가 거칠어지며 쳐지는 현상 등이 발생한다.

본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화를 효과적으로 개선하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 자외선은 UVA, UVB, UVC를 포함하며 예컨대 UVB일 수 있다. 상기 자외선의 세기는 0.1 내지 10,000 mJ/cm2일 수 있고, 구체적으로 1 내지 1,000 mJ/cm2, 예컨대 100 mJ/cm2일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 티로시나아제(Tyrosinase) 또는 엘라스타아제(Elastase) 효소 활성 억제 효능을 나타낸다.

일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 자외선에 의한 MMP(matrix metalloproteinases) 발현 증가를 회복하는 효능을 나타낸다. 구체적으로, 상기 MMP는 MMP-1 또는 MMP-2일 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 콜라겐(collagen) 발현 감소를 회복하는 효능을 나타낸다. 구체적으로, 상기 콜라겐은 Type I 프로콜라겐, COL-1 또는 COL-3일 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 ERK, JNK 및 p38로 구성된 군에서 선택되는 자외선에 의한 염증 인자의 억제 효능을 나타낸다. 구체적으로, 상기 염증인자는 자외선에 의해 인산화가 증가되며, 본 발명의 조성물은 상기 인산화의 정도를 자외선 조사 이전 수준으로 회복시킬 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 자외선에 의해 유도된 산화 스트레스에 대한 항산화 효능을 나타낸다. 구체적으로, 상기 산화 스트레스는 혈청 또는 조직 내 SOD 또는 GSH의 발현 증가일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 이를 자외선 조사 이전 수준으로 회복시킬 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(AHG)를 포함하는 본 발명의 조성물이 in vitro에서 티로시나아제 및 엘라스타아제 효소 활성을 저해하고(도 3), 자외선에 의한 피부 세포의 생존률 감소를 상당 수준 회복시키며(도 4), 인간 피부 세포에서 자외선에 의한 프로콜라겐 발현 감소, COL-1/3 발현 감소 및 MMP-1 발현 증가를 상당 수준 회복시키며(도 5), 동물 모델에서 자외선에 의한 피부 주름 생성, 표피 두께 증가 및 콜라겐 섬유 밀도 감소를 상당 수준 회복시키고(도 6), 동물 모델에서 자외선에 의한 혈청 및 피부 조직 내 프로콜라겐 감소, COL-1/3 감소 및 MMP-1/2 증가를 상당 수준 회복시키고(도 7), 자외선으로 인한 세포 내 염증 조절 인자인 ERK, JNK, p38의 인산화를 저해함으로써 피부노화에 관여하는 MAP 신호전달경로를 효과적으로 억제하고(도 8), 동물 모델에서 자외선에 의한 혈청 및 조직 내 SOD, GSH 감소를 회복시켜 산화 스트레스에 대한 항산화 효과가 우수함(도 9)을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화 개선제로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명에서 “개선”은 피부 주름 또는 피부 노화를 예방, 처치, 경감, 완화 또는 치료할 수 있는 효과를 의미한다.

본 발명의 조성물에서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(AHG)은 조성물 총 중량 대비 0.00001 내지 50 중량% 포함할 수 있다. 예컨대, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(AHG)는 0. 1 내지 5,000 μg/mL의 농도로, 구체적으로 1 내지 500 μg/mL 농도로 사용될 수 있으나, 이에 반드시 제한되지는 않는다.

일 실시양태에서, 본 발명의 조성물 내 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(AHG)는 마우스 기준으로 1 mg/kg 내지 5,000 mg/kg, 구체적으로 10 mg/kg 내지 1,000 mg/kg, 더욱 구체적으로 100 mg/kg 내지 500 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있으나 이에 반드시 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물 또는 화장료 조성물로 제조될 수 있다. 화장료 조성물로 제조될 경우, 본 발명의 조성물은 기능성 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 제조되는 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약학 조성물 또는 기능성 화장료 조성물로 제형화될 경우, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제, 멸균 주사 용액 또는 이들의 조합 형태로 제형될 수 있으며, 예컨대 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제로 제형화될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제형화될 경우, 예컨대, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로선, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저 또는 이들의 조합으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(AHG) 외에 1종 이상의 담체, 부형제, 희석제 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제 이외에 다른 보조제를 포함할 수 있다. 상기 보조제의 예로는 보존제, 항산화제, 안정화제, 용해제, 비타민, 안료, 향료 또는 이들의 조합을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 in vitro, 피부 세포 및 동물 모델에서 자외선에 의해 발생하는 피부 주름 및 피부 노화를 효과적으로 개선할 수 있으므로, 피부 주름 개선제 또는 피부노화 방지제 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

한편, 여기에서 명시적으로 언급되지 않은 효과라하더라도, 본 발명의 기술적 특징에 의해 기대되는 이하의 명세서에서 기재된 효과 및 그 잠정적인 효과는 본 발명의 명세서에 기재된 것과 같이 취급됨을 첨언한다.

도 1은 자외선에 의한 피부 손상 동물 모델 제작 방법을 나타낸다.
도 2는 B16F10 세포주에서 본 발명의 조성물 처리 후 세포 생존률 측정 결과를 나타낸다(C: 대조군, AHG: 본 발명의 조성물).
도 3은 본 발명의 조성물의 티로시나아제 및 엘라스타아제 활성 억제 효과를 나타낸다[AC : L-아스코르브산, F : 포스콜린(Forskolin), KA : 코직산(Kojic acid), UA : 우르솔산(Ursolic acid), AC10 또는 UA500 또는 포스콜린에 대해 ***p < 0.001].
도 4는 인간 진피 섬유아세포(dermal fibroblast) Hs68에서 본 발명의 조성물의 세포 독성 및 자외선에 의한 피부보호능 결과를 나타낸다(B: 블랭크, C: 대조군, NAC: N-아세틸-시스테인, B 그룹에 대해 ***p < 0.001; C 그룹에 대해 ##p < 0.01; C 그룹에 대해 ###p < 0.001).
도 5는 본 발명의 조성물의 자외선에 의한 세포 내 COLs 및 MMPs 합성능 분석 결과를 나타낸다(N: 정상, C: 대조군, NAC: N-아세틸-시스테인; N 그룹에 대해 ***p < 0.001; C 그룹에 대해 ##p < 0.01 및 ###p < 0.001).
도 6은 실험동물에서 본 발명의 조성물 처리 후 자외선에 의한 피부주름 개선 효능 결과를 나타낸다(N: 정상, RA: 레티노산).
도 7은 실험동물에서 본 발명의 조성물의 자외선에 의한 COLs 및 MMPs 합성능 분석 결과를 나타낸다(N: 정상, C: 대조군, RA: 레티노산; N 그룹에 대해 ***p < 0.001; C 그룹에 대해 #p < 0.05 및 ###p < 0.001).
도 8은 본 발명의 조성물의 자외선에 의한 염증 조절 관련 단백질 발현 억제 효능 결과를 나타낸다(B: 블랭크, C: 대조군, NAC: N-아세틸-시스테인, N: 정상, RA: 레티노산).
도 9는 실험동물에서 본 발명의 조성물의 자외선에 의한 항산화 효능 결과를 나타낸다(N: 정상, C: 대조군 RA: 레티노산; N 그룹에 대해 ***p < 0.001; C 그룹에 대해 #p < 0.05, ##p < 0.01 및 ###p < 0.001).
※ 첨부된 도면은 본 발명의 기술사상에 대한 이해를 위하여 참조로서 예시된 것임을 밝히며, 그것에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되지는 아니한다.

본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기능에 대하여 이 분야의 기술자에게 자명한 사항으로서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 상세한 설명을 생략한다.

이하의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않음은 물론이다.

<실험 재료 및 방법>

1. 본 발명의 조성물의 준비

본 실험에 사용된 AHG 시료는 ㈜헬스코치생명공학으로부터 수령하였으며(원료코드 ATAGE-2006), AHG 시료를 3차 증류수에 100 mg/mL로 조제한 후 농도별로 희석하여 실험에 사용하였다.

2. 티로시나아제 저해활성 측정

티로시나아제(Tyrosinase) 저해활성을 67 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.8), 10 mM L-DOPA(3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine, Sigma-Aldrich, USA) 및 시료의 혼합액에 125 unit 버섯 티로시나아제 5,370 unit/㎎ (Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 37 ℃에서 반응시켜 492㎚ 파장에서 측정하였다. 대조군으로 L-아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다. 티로시나아제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

3. 세포 배양

실험에 사용한 B16F10 세포주와 Hs68 인체 유래 피부 섬유아세포주는 American type cell collection (ATCC, USA)로부터 구입하였으며, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco, USA)에 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum, Gibco)과 1%의 페니실린(100 U/mL)/스트렙토마이신(100 μg/mL)을 첨가한 후 37 ℃5% CO2 조건하에서 배양, 사용하였다.

4. 세포 독성 평가

시료에 대한 세포 생존율은 MTT [3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA]를 사용하여 실험하였다. 세포를 96-웰 세포 배양용기에 분주하여 24시간 동안 안정화하였다. 시료를 농도별로 희석하여 24 시간 처리한 후, 5 mg/mL 농도의 MTT 시약을 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 37°C, 5% CO2 배양하였다. 배양 후 상등액을 제거하고 100 μL/웰의 DMSO(Dimethylsulfoxide, Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA)를 넣어 포르마잔(formazan)의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 590 nm에서 측정하였다.

5. 멜라닌 생성 억제능 측정

B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 다음 24시간 배양 후 PBS로 세척하고 페놀 레드가 없는(phenol red free) DMEM(Gibco)으로 배지를 교체한 후 농도별로 제조한 시료와 10 μM 포스콜린(Forskolin)을 세포에 처리하여 멜라닌이 합성되도록 37°C, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 3일 후 배양 상등액을 96-웰 플레이트에 옮겨 생성된 멜라닌 양을 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 용매를 사용한 블랭크(blank) 흡광도를 기준으로 멜라닌 생성 억제율을 산출하였고, 대조군으로는 멜라닌 생성 저해효과를 갖는 코직산(Kojic acid)을 사용하여 시료와 비교하였다.

6. 엘라스타아제 저해 활성의 측정

엘라스타아제(Elastase) 저해활성 측정은 기질로서 N-숙시닐-(Ala)3-p-니트로아닐리드(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide)를 사용하여 p-니트로아닐리드의 생성량을 측정하였다. 각 시험용액과 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.6), 엘라스타아제 효소를 넣은 후 N-숙시닐-(Ala)3-p-니트로아닐리드를 첨가하여 10 분간 반응시키고 마이크로 리더를 이용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 대조군으로는 우르솔산(Ursolic acid)을 사용하였다.

7. 세포 수준 자외선에 의한 피부 보호능 분석

Hs68에서 자외선에 의한 피부 보호능은 MTT 분석법을 이용하여 분석하였다. 세포를 1×104 세포/mL로 96 웰 세포 배양용기에 분주하여 24 시간 동안 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 배양하여 세포주기를 동일화하였다. 시료를 농도별로 24 시간 처리한 후, PBS로 두 번 세척한 후 소량의 PBS를 넣고 UV 크로스링커(cross-linker)(Analytik Jena AG, Jena, Germany)를 이용하여 UVB 100 mJ/cm2 조사해 주었다. 조사 직후 농도별 시료가 함유된 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 교환하여 24 시간 동안 배양시켰다. 대조군은 UVB 조사 없이 동일한 조건으로 실험을 수행하였다. 24시간 후 5 mg/mL 농도의 MTT 시약을 각 웰에 넣고 4 시간 동안 반응시켰다. 4 시간 후 상등액을 제거하고 100 μL/웰 DMSO를 넣어 포르마잔 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.

8. 마우스 사육

웅성 SKH-1 무모 마우스(5주령, 20 - 24g)는 OrientBio(Gyeonggi, Korea)로부터 구입하였다. 마우스는 케이지 당 3 마리씩 무작위로 나누고 12 시간 낮/밤 주기로 하여 온도는 24 ± 2 ℃습도는 55 ± 5% 조건에서 사육하였다. 마우스는 실험을 시작하기 전 일주일 동안 주위 환경에 적응되게 하였으며, 음식과 물은 자유롭게 섭취할 수 있었다.

9. UVB에 의한 항노화 동물모델

일주일의 적응 기간이 지난 후, 마우스를 각 군에 6 마리씩 6 군으로 분리하였다. 각각의 군은 표 1과 같으며, 시험 물질의 경구투여는 UV 조사 30 분 전에 수행하였다. 양성 대조군은 레티노산(retinoic acid, Sigma-Aldrich)을 투여하였다. 본 실험은 (재)전주농생명소재연구원 동물실험운영위원회의 승인(JAMI IACUC 2020004)을 받아 수행하였다.

그룹	시료 처리(p.o.)	UV방사
N	비히클(증류 수돗물)	-
UV	비히클	○
RA	0.01% Retinoic acid	○
AHG100	AHG 100 mg/kg	○
AHG250	AHG 250 mg/kg	○
AHG500	AHG 500 mg/kg	○

10. 자외선에 의한 피부 손상 동물 모델 제작

광노화된 동물 모델의 제작을 위해 UV 크로스링커(Waldmann Medizintechnik, Schwenningen, Germany)를 사용하였다. 마우스는 첫 주 30 mJ/cm2, 두 번째 주 60 mJ/cm2, 세 번째 주 90 mJ/cm2, 마지막 주는 120 mJ/cm2의 조사량으로 매일 1 회 UV에 노출되었으며, 대조군은 자외선에 노출되지 않았다(도 1).

11. 피부 주름 형성 측정

마지막 UV 조사 후 24 시간 후에 SILFLO (Silflo, J&S Davis Ltd, UK)를 사용하여 마우스의 등쪽 피부 주름의 복제 이미지를 제작하였고, 현미경 카메라를 사용하여 관찰하고 촬영하였다.

12. 자외선에 의한 MMP-1 효소 저해 및 프로-콜라겐 활성 효능 분석

Hs68세포의 자외선에 의한 피부 보호능을 분석하기 위하여 세포를 5.0 × 105 세포/mL로 6 웰 세포 배양용기에 분주하여 24 시간 동안 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 배양하여 세포주기를 동일화하였다. 각 시료를 농도별로 24 시간 처리한 후, PBS로 두 번 세척한 후 소량의 PBS를 넣고 UV 크로스링커(Analytik Jena)를 이용하여 UVB(100 mJ/cm2)를 조사하였다. 조사 직후 농도별 시료가 함유된 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 교환하여 6 시간 동안 배양시켰다. 대조군은 UVB 조사 없이 동일한 조건으로 실험을 수행하였다. 배양 후 세포배양 상등액을 이용하여 자외선에 의해 손상이 유도된 피부 섬유아세포에서 MMP-1(Matrix metalloproteinase) 효소 저해 효능 및 프로-콜라겐(pro-collagen) 활성 유도 효능을 Human MMP-1 및 Human Pro-Collagen Type I ELISA kit (Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 측정하였다. 혈액은 3,000 rpm에서 15 분간 원심분리 한 후, 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다. 피부 조직은 균질기를 사용하여 균질화 한 다음, 4 ℃에서 12,000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 마우스의 혈액 및 피부조직은 Mouse MMP-1 (CUSABIO, Wuhan, China)과 Mouse Pro-Collagen Type I (Abcam) ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 실험은 제조사의 지침에 준하였다.

13. 항산화 효소 활성 분석

SOD(Superoxide dismutase) 활성은 SOD assay kit(Biomax Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 상기와 같은 방법으로 취한 혈청 및 조직 균질액을 WST1 [2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt] working solution과 혼합하여 96-웰 플레이트에 분주했다. 그 후, enzyme working solution을 첨가하고 37 °C에서 20 분간 배양한 후, UV 분광 광도계 (Thermo Scientific, Germany)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

GSH(Glutathione) 함량은 GSH assay kit (Cayman, MI, USA)를 사용하여 결정하였다. 글루타티온 환원 효소(glutathione reductase)를 사용하여, 혈청 및 조직 균질 액에 트리-에탄올아민(tri-ethanolamine) 용액과 Assay Cocktail [MES 버퍼(11.25 mL), reconstituted cofactor mixture(0.45 mL), reconstituted enzyme mixture(2.1 mL), 물(2.3 mL), 및 reconstituted DTNB (0.45 mL)의 혼합물]을 혼합하고 실온에서 20 분간 배양한 후, UV 분광 광도계를 사용하여 412 nm에서 측정하였다.

14. 단백질 발현 분석

세포 및 마우스 피부조직을 얼음조(ice-cold) RIPA 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1 mM 소듐 오르쏘반데이트(sodium orthovandate), 120 mM 소듐 클로라이드(sodium chloride), 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride), 10 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL aprotonin)을 넣어 용해(lysis)시킨 후 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 동일한 양의 단백질 (20 μg/mL)을 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동 후 PVDF 멤브레인(Bio-Rad Lab., Hercules, CA, USA)에 트랜스퍼하였다. 5% 스킴 밀크(0.1% 트윈 20 함유 TBS, TBST) 용액에서 1시간 동안 비선택적 결합 사이트를 블로킹한 뒤 1차 항체[항-티로시나아제(SantaCruz Biotechnology, Inc. USA), TRP1(Abcam Cambridge UK), MITF, MAPK, MMPs, COLs(Cell Signaling, Beverly, MA)]로 밤새 인큐베이션하고, 2차 항체(홀스래디쉬 페록시다아제 링크된 항-래빗 IgG 또는 항-마우스 IgG, SantaCruz Biotechnology)로 상온에서 2시간 incubation 한 후 ECL 용액을 이용하여 단백질 발현량을 측정하였다(Amersham imager 600, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

15. 면역조직화학적 검사

UV 조사된 마우스의 등쪽 피부 조직을 4 % 파라포름알데히드에 24 시간 동안 고정시킨 다음 파라핀에 포함시켰다. 조직 절편 (4 μm)을 슬라이드 위에 올려 놓고 H&E(Hematoxylin and eosin), MT(Masson 's trichrome) 및 마우스 MMP-1 항체(Abcam)로 염색하였다. H&E 염색은 일반적인 조직 병리학적 변화와 표피의 두께를 평가하기 위해 사용하였고, MT 염색은 콜라겐 섬유의 변화 정도를 측정하기 위해 사용하였다. 염색된 조직 슬라이드는 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 촬영하였다.

<실시예 1> 세포 독성의 확인

세포독성 유무를 확인하기 위하여 B16F10 세포주와 Hs68 세포주에 시료를 농도별로 처리한 후 MTT 어세이에 의한 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, B16F10에서는 200 μg/mL까지 독성이 나타나지 않음을 확인하였으며(도 2), Hs68 세포주에서는 AHG 200 μg/mL까지 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 4A).

<실시예 2> 티로시나아제 및 엘라스타아제 활성에 미치는 영향

본 발명에 따른 조성물의 미백 효능을 분석하기 위해 티로시나아제 활성 억제능과 마우스 흑색종 세포(B16F10)에서 멜라닌 함량과 멜라닌 생성 유도에 관여하는 신호전달 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다.

티로시나아제 저해 활성 측정 결과, 본 발명에 따른 조성물 처리시 티로시나아제 활성을 5.66% 수준으로 억제하는 효과를 확인하였다(도 3A). B16F10세포에서 포스콜린(forskolin)에 의에 증가된 멜라닌은 본 발명에 따른 조성물 처리로 유의하게 감소되지는 않았으나, 멜라닌 생성에 관여하는 신호전달 단백질인 티로시나아제(tyrosinase), MITF, TRP-1의 발현은 억제되는 것을 확인하였다(도 3B, 3C). 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성에 관여하는 신호전달 단백질 발현을 억제하는 것으로 미루어 본 발명에 따른 조성물은 피부 미백에 효과가 있을 것으로 판단된다.

본 발명에 따른 조성물이 피부 탄력성에 관련된 효소인 엘라스타아제(elastase) 활성에 미치는 영향을 분석한 결과, 본 발명에 따른 조성물 처리에 의해 효소 활성이 10.96% 수준으로 억제됨을 확인하었다(도 3D). 이는 본 발명에 따른 조성물이 피부 탄력 저하 억제에 효과적임을 시사하는 결과이다.

<실시예 3> 자외선으로부터 피부 세포 보호능

피부 탄력 저하는 노화와 관련이 있으므로 상기의 결과를 바탕으로 Hs68 세포에서 자외선에 의한 피부 손상에 대한 보호능을 분석한 결과, 본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부 손상을 유의적으로 억제함을 확인하였다(도 4A). 또한, AHG의 유효한 농도에서 독성은 없는 것으로 확인되었다(도 4B).

<실시예 4> 자외선에 의한 피부 세포 내 MMPs 및 COLs 합성에 미치는 영향

자외선은 Type-I 프로콜라겐(procollagen)의 억제와 MMPs의 발현을 촉진시켜 주름 형성을 촉진하는 인자로 알려져 있다. 피부의 결합조직인 콜라겐의 분해는 탄력 저하와 피부주름의 처짐에 영향을 준다. 이중 MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하는 단백질 분해 효소로 이 효소의 작용을 억제하여 콜라겐을 보호하고 탄력을 유지하면 주름예방을 할 수 있다고 알려져 있다. 따라서, Hs68에서 UVB 조사에 의해 유도되는 Type-I 프로콜라겐의 억제와 MMPs의 증가에 대한 각 시료의 효과를 확인하였다. UVB 조사에 의해 억제된 Type-I 프로콜라겐 활성은 AHG 10 μg/mL 처리군에서 증가하였다(도 5A). 반면, UVB 조사에 의해 증가된 MMP-1 활성은 AHG 10 μg/mL 처리에 의해 감소하였다(도 5C). 단백질 전기 영동법으로 Hs68에서 UVB 조사에 의해 유도되는 COLs 및 MMPs의 단백질 발현도를 정량한 결과, UVB는 MMP-1의 단백질 함량을 증가시켰으며, AHG 10 μg/mL 처리군에서 양성대조군인 NAC (1μM, PC) 수준으로 감소하였고, COL-3는 UVB에 의해 감소된 단백질 함량이 AHG 10 μg/mL 처리에서 양성대조군보다 효과적임을 관찰하였다(도 5B, D).

<실시예 5> AHG의 자외선에 의한 피부주름 개선 효능

피부 주름 개선에 대한 AHG의 효능을 분석하기 위해 동물수준에서 추가적인 유효성 평가를 진행하였다. 무모쥐의 등쪽 피부에서 UVB를 조사하여 주름 형성에 AHG가 미치는 영향을 관찰하였다. 4 주간의 UVB 노출은 마우스 피부의 주름을 심하게 증가시켰으며, 양성대조군(RA)과 AHG500군에서 UVB 군 대비 주름 생성이 현저히 억제되는 것으로 관찰되었다(도 6A). UVB 조사는 표피가 과도하게 증식되며 피부가 두꺼워진다고 알려져 있다. 본 연구에서는 UVB 조사 후 피부의 두께와 콜라겐 생성을 확인하기 위해 피부조직을 H&E와 MT 염색하여 비교하였다. H&E 염색 결과 정상군(N)과 비교하여 UVB 군은 각질 형성 세포의 증식과 비대에 의해 표피의 두께가 현저하게 증가하였으나, AHG500을 투여한 결과 표피의 두께가 감소한 것을 확인하였다(도 6B). MT 염색은 콜라겐 섬유를 관찰하는 데 사용되었으며, UVB 군이 N 군에 비해 콜라겐 섬유의 밀도가 감소한 것이 관찰되었다. 이는 AHG500의 투여로 UVB 조사에 의해 유도된 콜라겐 섬유 함량을 역전시켜 콜라겐 섬유의 밀도를 회복시키는 것을 확인하였다(도 6C).

<실시예 6> 동물 모델에서 AHG의 자외선에 의한 피부 노화 신호전달 단백질에 미치는 영향

마우스의 UVB에 의한 피부 노화 모델에서 혈청 및 조직내 MMP-1 및 프로콜라겐의 합성능에 대한 AHG의 효능을 분석하였다. UVB 조사는 혈청 및 조직 균질액의 프로콜라겐 농도를 유의하게 감소시켰으며, 이것은 프로콜라겐의 투여에 의해 유의적으로 회복되었다(도 7A). 또한 UVB 조사는 혈청 및 조직 균질액의 MMP-1 활성을 유의하게 증가시켰고, AHG 처리는 이러한 영향을 현저히 감소시켰다(도 7C). 피부 조직내 COLs 및 MMPs의 단백질을 전기 영동법으로 정량한 결과, UVB는 COL-1 및 COL-3의 단백질 발현을 감소시켰으며, AHG 500 mg/kg 처리군에서 단백질 발현이 증가하는 것을 관찰하였다(도 7B). 또한 UVB에 의해 증가된 MMP-1및 MMP-2 단백질 발현이 AHG 100, 250, 500mg/kg 처리군에서 의해 감소된 것을 관찰하였다(도 7D). 이러한 결과로 AHG는 의해 MMP 단백질 발현 증가 억제를 통해 콜라겐 섬유의 분해를 보호하는 항노화 효과를 보이는 것으로 판단하였다.

<실시예 7> AHG의 자외선에 의한 염증 조절 신호전달 단백질 발현 억제 효능

MAPK 신호 전달의 경로는 면역 반응 조절, MMPs 발현, 염증 등을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 염증 반응은 세포 내에서 다양한 신호전달 분자들을 활성화시키며, 특히 MAPK는 인산화를 통하여 다양한 전사인자들을 활성화시키는 핵심 신호전달 분자로 알려져 있다. 세포 수준에서 자외선에 의한 염증 조절 관련 효능을 관찰한 결과, UVB를 단독 조사하였을 때 ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinases), 및 p38 단백질의 인산화를 유도하였으나 AHG 10 μg/mL 처리에 의해 억제된 것을 관찰하였다(도 8A). 또한 조직내 자외선에 의한 염증 조절 관련 효능을 관찰한 결과 UVB에 의해 ERK 및 p38 단백질의 인산화가 유도되었으며, AHG농도 의존적으로 억제된 것을 관찰하였다. 이와 같은 결과로 AHG가 MAPK 신호전달경로를 억제시켜 피부노화의 개선효과가 나타날 수 있다고 판단하였다(도 8B).

<실시예 8> AHG의 동물수준 자외선에 의한 항산화 효능 결과

산화 스트레스는 광노화와 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. UVB로 유도된 마우스의 혈청 및 조직 균질액에서 AHG의 항산화 효과를 관찰한 결과, UVB군에 비해 혈청은 AHG 100 mg/kg 이상의 농도에서 혈청내 SOD 활성을 유의하게 증가시켰다(도 9A). 또한, AHG의 처리는 조직내 GSH 함량을 유의하게 증가시켰다(도 9B). 이러한 결과는 AHG가 UVB 조사에 의해 유도된 산화 스트레스에서 항산화 효과를 나타내는 것으로 판단된다.

Antera 3D

CS를 이용한 눈가주름 변수 별 측정값을 분석한 결과 Overall size값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후, 적용 4주 후 각각 2.794%, 3.341%의 감소율을 나타냈다. Depth값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후, 적용 4주 후 각각 1.704%, 3.183%의 감소율을 나타냈다. Width값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후, 적용 4주 후 각각 0.553%, 1.193%의 감소율을 나타냈다. Maximum depth값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후, 적용 4주 후 각각 2.294%, 2.926%의 감소율을 나타냈다.

본 발명은 본 발명의 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 따라서, 상기의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (6)

1. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는, ATAGE-2006을 이용한 자외선에 의한 피부 주름 또는 피부 노화 개선용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   엘라스타아제(Elastase) 효소 활성 억제 효능을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   자외선에 의한 MMP(matrix metalloproteinases) 발현 증가 또는 콜라겐(collagen) 발현 감소 회복 효능을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   ERK, JNK 및 p38로 구성된 군에서 선택되는 자외선에 의한 염증 인자의 억제 효능을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   자외선에 의해 유도된 산화 스트레스에 대한 항산화 효능을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제, 멸균 주사 용액 또는 이들의 조합으로 제형화되는 조성물.
   
   
   
   

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