JP5346339B2 - しわ改善及び保湿剤組成物、および化粧品 - Google Patents

Description

本発明は、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を含有した皮膚保護及び改善剤に関し、より詳しくは、本発明は、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を含有することにより、皮膚保湿機能及び／またはしわ防止機能を有する組成物に関する。

皮膚は、物理的、化学的、またはバクテリア等の外部の攻撃から身体内の臓器及び組織を保護する役割をする。また、皮膚は、体温を維持し、体内の水分の蒸発を防ぐ。皮膚組織は、表皮と真皮に分けられるが、表皮は、皮膚の最外層であり、真皮は、皮膚を構造的に保持する深い層である。

表皮層は、数層の細胞層からなる。真皮と隣接する最下層は、細胞が再生産される場所であり、基底細胞といい、表皮の最外側の細胞層を角質層という。角質層は、生存期間が長く、持続的に新しい細胞に変わる。角質層は、人体の内部または外部から水分を供給される。角質層には天然の水分維持因子が生成されるため、角質層は身体の水分保護膜の機能を担い、また、一般に３０％の水分を含有する。したがって、角質層内の水分含有率が減少すると、皮膚が乾燥するようになる。保湿クリーム等は、このような皮膚乾燥を防ぎ、水分を維持するようにする。すなわち、水分維持は、健康な皮膚において極めて重要な要素であり、化粧品や皮膚保護剤の目的または開発において重要な因子である。

一般に、人間の皮膚が黒くなるのには、様々な原因があるが、主な要因は、紫外線によるメラニンの合成である。メラニン生成過程において、チロシナーゼという酵素が作用し、ドーパキノンを生成させるが、これから自発的な反応と酵素反応を経て、黒色色素であるメラニンが生成する。したがって、皮膚の美白のためには、メラニン生成過程中の一部の反応を阻害することにより、メラニンの生成を減少させる方法が、最も簡単でかつ一般的である。このため、従来より、ビタミンＣ、コウジ酸、アルブチン、ヒドロキノン等の桑白皮抽出物等のような各種の植物抽出物が用いられている。しかしながら、これらは、皮膚に対する刺激性等の副作用によって、その使用に限界があった。

皮膚の老化は、内的要因と外的要因が含まれた複雑な過程によって進行する。すなわち、皮膚の老化は、不可逆的な組織の退行による慢性的な損傷による内的老化過程と、紫外線による外的老化過程がある。外的老化過程において、紫外線は、皮膚の損傷をもたらす最も主要な環境的な要因である。皮膚が紫外線に暴露されると、細胞の浮腫等の皮膚変形を引き起こしてしまう。しかも、皮膚が慢性的に紫外線に暴露され続けると、いくつかの炎症因子が発生し、皮膚組織内のコラーゲン組織の破壊、ケラチン細胞の増殖、メラニン細胞の正常の機能を変化させるため、しわ、荒れ、乾燥症、皮膚の弛緩、また色素沈着等を引き起こす。すなわち、紫外線は、皮膚組織内に数種のインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）等の炎症を引き起こす細胞毒性物質を生成し、これらの炎症因子によって、コラーゲン組織破壊をもたらすマトリクスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）、メラニン細胞とケラチン細胞の異常増殖を促進する塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、またマイトジェンプロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ）等のような様々な細胞損傷をもたらす遺伝子の発現を促進する。したがって、これらの炎症因子を効果的に阻害することにより、紫外線による皮膚損傷から皮膚を保護することができる。

皮膚の老化に関与する代表的な酵素としては、エラスターゼがある。この酵素は、組織内でスプリング作用をするエラスチンを分解する酵素である。エラスターゼは、内因性老化または紫外線等の外部刺激により過剰生産される。エラスターゼの過剰生成は、エラスチンを分解させ過ぎ、コラーゲン間の結合が弱くなり、皮膚のしわが生成し、皮膚の弾力が減少する。特に、４０代以降は、エラスターゼの作用によって、皮膚の弾力が急に減少してしまう。これは、エラスターゼの作用が、加齢につれて、極めて活発になり、エラスチン繊維が一部消滅しまたは凝集する現象が現れ、コラーゲン繊維が減少するためである。生化学的な側面からみると、エラスターゼの活性が、加齢につれて、促進するものと認められる。したがって、このようなエラスターゼの活性を抑制することにより、皮膚のしわの生成を抑制することができる。

にきびは、主に思春期の若年者において、ホルモンの変化による皮脂腺内の炎症性皮膚疾患である。にきびの原因としては、アンドロゲンによって活性化した過度の皮脂生成と、皮脂腺の拡大、母皮脂腺内の表皮角質形成細胞の増殖、毛包角質細胞の不完全な脱落と、これによる母皮脂腺の詰まり、またアクネ菌(P.acnes)と呼ばれるバクテリアによる炎症がよく知られている。今まで知られているにきびの治療剤としては、様々な形態のレチノイン酸があるが、これは、皮膚の皮脂生成を抑制し、皮脂腺の拡大を防ぐ。また、Ｐ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制する抗生剤療法も、にきびの治療法として知られている。しかし、これらのレチノイン酸や抗生剤の場合、皮膚炎症を引き起こし、皮膚に刺激的であり、バクテリア耐性等の副作用があるため、その使用に制限があった。したがって、脂肪の生成を減らし、炎症を防ぎ、副作用のないにきびの予防及び治療物質の開発が非常に望まれている。

そこで、本発明の目的は、人体に毒性のない各種皮膚疾患の予防及び改善剤として用いられる組成物を提供することにある。具体的には、本発明の目的は、皮膚保湿機能及び／またはしわ防止機能を有する組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記組成物を含む、皮膚保護及び皮膚疾患改善機能に優れた化粧品を提供することにある。

本発明の一態様によると、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を有効成分として含み、しわ防止及び／または保湿機能の特性を有する皮膚疾患保護及び改善剤用組成物に関する。

本発明の他の態様によると、前記組成物を含む、皮膚保護または皮膚疾患改善機能に優れた化粧品を提供することである。

本発明のさらに他の態様によると、前記組成物を含む、皮膚保護または皮膚疾患剤を提供することである。

上述したように、本発明のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を有効成分として含有した組成物は、海藻類から精製され、毒性が全くなく、各種の皮膚疾患に対する予防及び治療において、優れた効果を示すので、皮膚保護剤及び改善剤、化粧品として有用に用いられる。

本発明の組成物による抗炎症、抗アレルギー効果を示した発疹部位の変化グラフである。 本発明の組成物による抗炎症、抗アレルギー効果を示した腫れた部位の変化グラフである。 本発明の組成物の紫外線照射による炎症遺伝子発現抑制効果を示したグラフである。 代謝活性系が適用されなかった場合における、様々なバクテリアに対する本発明の組成物による復帰変異コロニー数を示したグラフである。 代謝活性系が適用された場合における、様々なバクテリアに対する本発明の組成物による復帰変異コロニー数を示したグラフである。

以下、本発明について詳述する。

本発明物らは、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を含めた前記組成物を、各種皮膚疾患の予防及び治療に使用可能であることを見出し、本発明を完成した。

本発明の組成物に含まれるジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、食用可能な大型の褐藻類から初めて発見された物質である。本発明では、このようなジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体が、メラニン生成を抑制することにより、皮膚美白機能を有し、エラスターゼを阻害することにより、優れたしわ防止効果を有し、ヒスタミンの活性を抑制することにより、抗炎症、抗アレルギー機能を示し、保湿率を高く維持させ、皮脂生成を抑制することにより、にきび改善効果を示し、また、紫外線による皮膚炎症や活性酸素の発生、これによる皮膚の老化から皮膚を保護することにより、各種の皮膚疾患を予防し、改善することができることを確認した。また、本発明では、長期間の皮膚剤の使用による毒性がないことを実験的に確認した。

本発明に有用なジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体の代表的な物質として、下記化学式１乃至化学式１０の物質が挙げられる。

上記式において、各Ｒは、Ｈ、アルキル、アルケニル、フェニル、フェニルアルキル、アルカノイル、ヒドロキシフェニル、ジヒドロキシフェニル、または、アシルである。好ましくは、前記Ｒは、Ｈである。

このようなジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、本発明の組成物に少なくとも一つまたは二つ以上の組合せで含まれてもよい。例えば、前記ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、化学式２のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体及び化学式４のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体からなる群から選ばれる一つ以上のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を８〜９０重量％；及び化学式１のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式３のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式５のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式６のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式７のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式８のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式９のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、及び化学式１０のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体からなる群から選ばれる一つ以上のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を１０〜９２重量％で含んでよい。

また、前記ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、化学式１のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体０．１〜６重量％、化学式２のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体５〜６０重量％、化学式３のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体１〜３０重量％、化学式４のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体０．５〜２０重量％、化学式５のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体０．１〜１０重量％、化学式６のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体０．５〜１５重量％、化学式７のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体０．１〜５重量％、化学式８のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体０．１〜５重量％、化学式９の０．１〜１０重量％、及び化学式１０のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体０．１〜１２重量％を二つ以上混合して含んでもよい。

前記組成物の一日塗布量は、１〜１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。

前記ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、主に、褐藻類から抽出され、具体的には、Eisenia bicyclis、Eisenia arborea、Eisenia desmarestioides、Eisenia galapagensis、Eisenia masonii、Ecklonia kurome、 Ecklonia cava、Ecklonia stolonifera、Ecklonia maxima、 Ecklonia radiata、 Ecklonia bicyclis、Ecklonia biruncinate、Ecklonia buccinalis、Ecklonia caepaestipes、Ecklonia exasperta、Ecklonia fastigiata、Ecklonia brevipes、 Ecklonia arborea、Ecklonia latifolia、Ecklonia muratii、Ecklonia radicosa、Ecklonia richardiana、またはEcklonia wrightiiから抽出されてもよい。好ましくは、前記ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、Eisenia bicyclis、Ecklonia cava、Ecklonia kurome、またはEcklonia stoloniferaから抽出される。

このようなジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体の含量は、特に限定されるものではないが、本発明の組成物に０．００００１〜１００重量％で含まれてもよい。

本発明のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を含有する皮膚保護及び改善用化粧品には、基礎化粧品（化粧水、クリーム、エッセンス、洗顔フォーム、洗顔ウォーター、パック、ボディーオイル）、カラー化粧品（ファンデーション、リップスティック、マスカラ、化粧下地）、頭髪用化粧品（シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、ヘアジェル）等がある。

本発明の組成物はまた、医薬品として許容可能な全ての形態で製造されてもよい。

前記組成物を含む化粧品の場合、本発明の組成物は、０．００００１〜５０重量％含まれてもよい。

前記組成物を含む医薬品の場合、本発明の組成物は、０．００１〜１００重量％含まれてもよい。

以下、本発明の内容を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明の範疇はこれに限定されるものではない。

実施例１．海藻類からの抽出物の製造及び単一化合物の分離
先ず、カジメ（Ecklonia cava）とアラメ（Eisenia bicyclis）を蒸留水で洗浄し、異物を除去してから、陰地で乾燥した後、これを破砕した。前記カジメとアラメ５００ｇ（カジメ３５０ｇ、アラメ１５０ｇ）を、含量に対して２０倍量の１０％アルコール性溶媒を用いて、活性物質を溶出させるため、２時間還流抽出した。このような過程を２回繰り返して抽出した。その後、残渣を濾別し、ロータリーエバポレーターを用いて、溶媒抽出液を減圧濃縮した。濃縮液を２０倍量の蒸留水に懸濁し、同量の酢酸エチル溶媒を用いて、３回抽出し、酢酸エチル画分を減圧濃縮した。濃縮液を１５倍量のシリカゲルカラムにかけた後、酢酸エチル／アセトン（体積比９／１）の混合溶媒を用いて、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を抽出して濃縮し、粗抽出物を製造した。

上記製造した粗抽出物を０．２μｍの薄膜フィルターでろ過し、高速液体クロマトグラフィーにかけた。高速液体クロマトグラフィーでは、カラムは、ＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラムを、溶媒としては、蒸留水とメタノールを用いており、溶媒の供給は、１．０ｍｌ／分の流速で、メタノール１５％から７０％まで３０分間にかけて、直線勾配で、化学式１乃至化学式１０の単一化合物として分離した。

実施例２．組成物１乃至組成物１８の製造
上記分離した化学式１乃至化学式１０の単一化合物から組成物１乃至組成物１８を製造した。各組成物の化学的組成を下記表１に示した。

実施例３．メラニン生成抑制実験
本発明の組成物の美白効果を立証するために、前記組成物１乃至組成物１８のメラニン生成抑制活性を測定した。この際、対照群としては、ポリフェノール性物質として知られたカテキン、レスベラトロール、及びイソフラボン、美白効果を有すると知られたコウジ酸、アスコルビン酸、及び桑白皮抽出物を用いた。

マウス由来Ｂ‐１６メラノーマ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ６３２３）細胞株をブドウ糖４．５ｇ／ｌ、１０％血清、１％抗生剤が含有されたＤＭＥＭ培地に接種し、３７℃で２４時間培養した。これを、０．０２％ＥＤＴＡが含有された０．０５％トリプシンで処理し、細胞を分株して４８時間培養後、前記組成物１乃至組成物１８及び対照群を５０μｇ／ｍｌの濃度でＤＭＥＭ培地に希釈させ、培養されたメラノーマ細胞に処理し、３７℃で３日間培養した。培養後、培地を全て除去し、０．０２％ＥＤＴＡと０．０５％トリプシンを含有したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌで処理し、細胞を分離させた後、５分間遠心分離して、細胞のみを収集した。５％トリクロロアセタート（ＴＣＡ）で処理し、攪拌して遠心分離し、沈殿されたメラニンを１Ｎ ＮａＯＨで処理して溶解させた後、４７５ｎｍで吸光度を測定した。この際、生成したメラニンの濃度は、合成メラニン（ＳＩＧＭＡ ＣＯ． ＵＳＡ）の標準濃度曲線によって決定し、陰性対照群として、前記試料を含めていない溶媒のみで処理した細胞を用いた。各組成物及び対照群のメラニン生成抑制活性は、以下の式によって求められ、これを下記表２に示した。

「数学式」｛１−Ｍ／Ｍ_０｝×１００
Ｍ：前記組成物または対照群の生成したメラニン量
Ｍ_０：陰性対照群の生成したメラニン量

上記表２に示したように、実験群のメラニン生成は、約８３〜９４％と大きく減少（対照群の場合、３０〜６５％）することを確認し、活性がよく知られた対照群の抑制活性に比べて優れた効果を示すことを確認した。したがって、本発明のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を有効成分として含めた組成物は、メラニン生成を抑制するので、優れた美白効果を有することが分かる。

実施例４．エラスターゼ抑制反応によるしわ防止測定
上記した組成物のしわ防止活性を測定するために、前記組成物１乃至組成物１８のエラスターゼ（エラスチンタンパク質分解酵素）阻害効果を測定した。この際、対照群としては、ポリフェノール性物質として知られたカテキン、レスベラトロール、イソフラボン、エラスターゼ抑制活性を示すラクトカインを用いた。

１０ｎｍのエラスターゼに前記組成物１乃至組成物１８を、５０μｇ／ｍｌの濃度で処理し、２５℃で１０分間処理した後、４１０ｎｍで吸光度を測定した。陰性対照群として、前記試料を含めていない溶媒のみを処理した細胞を用いた。各組成物及び対照群のエラスターゼ阻害率は、以下の式のように計算し、これを下記表３に示した。

「数学式」｛１−Ｅ／Ｅ_０｝×１００
Ｅ：前記組成物または対照群の吸光度
Ｅ_０：陰性対照群の吸光度

上記表３に示したように、実験群のエラスターゼ阻害率は、約８２〜９３％と大きく減少（対照群３８〜５０％）することを確認し、活性がよく知られた対照群の抑制活性に比べて優れた効果を示すことを確認した。したがって、本発明のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を有効成分として含めた組成物は、エラスターゼを阻害することにより、優れたしわ防止効果を有することが分かる。

実施例５．抗炎症、抗アレルギー機能の測定：ヒスタミン生成抑制活性
前記組成物の抗炎症及び抗アレルギー活性を測定するために、アレルギーを含めた炎症反応と密接な関係を有するヒスタミン生成抑制活性を測定した。

前記組成物のヒスタミン生成抑制活性実験は、ラット好塩基球性白血病細胞（rat basophilic leukemia cell (RBL-2H3)）を用いて、カワサキの方法によって行った。細胞（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）とラットａｎｔｉ−ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）ＩｇＥを含めたＲＰＭＩ １６４０倍地を用いて、３７℃で１２０分間培養した後、セルをＨＰＥＰＳバッファで洗浄し、残ったＩｇＥを除去した。前記組成物１乃至組成物１８を５０μｇ／ｍｌの濃度で処理した後、３７℃で１０分間培養した。ヒスタミン発生のための抗原として、ＤＮＰ−ＢＳＡ（Dinitrophenol- conjugated Bovine serum albumin）を処理した後、１時間の間３７℃で反応させた。ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を加えて、反応を中止させた後、上澄み液を取り、２０μｌの過塩素酸で処理した後、遠心分離して、上澄み液中のヒスタミン濃度をＨＰＬＣを用いて測定した。前記組成物を処理しなかったセルの生成したヒスタミン生成濃度を陰性対照群として、各サンプルのヒスタミン生成阻害率（％）を、以下の式によって計算し、下記表４に示した。

「数学式」｛１−Ｈ／Ｈ_０｝×１００
Ｈ：前記組成物の添加時、生成したヒスタミンの量
Ｈ_０：陰性対照群の生成したヒスタミンの量

その結果、上記表４に示したように、前記組成物のヒスタミン生成は、陰性対照群に比べて大きく減少することを確認した。したがって、本発明のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を有効成分として含めた組成物は、ヒスタミンの生成を抑制することにより、抗炎症、抗アレルギー機能を有することが分かる。

実施例６．抗炎症、抗アレルギー機能の測定：ヒスタミンによる炎症抑制活性
前記組成物のヒスタミンによる炎症抑制活性を、臨床実験を通じて評価した。

その結果、図１及び図２に示すように、前記組成物のヒスタミンによる炎症改善効果に優れたことを確認した。

実施例７．皮膚保湿機能の測定
本発明の組成物の皮膚保湿機能を臨床実験を通じて評価した。

上記表７に示したように、前記組成物は、皮膚表面水分率を高め、皮膚乾燥を防止することにより、皮膚保湿機能に優れた効果があることを確認した。

実施例８．にきびに対する予防及び治療効果
前記組成物によるにきびに対する予防及び改善効果をハムスターモデルを用いた皮膚表面及び皮膚内のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量の生成減少及び皮脂腺細胞の増殖抑制を通じて測定した。

実施例８‐１．トリアシルグリセロールの生成減少効果
前記組成物のトリアシルグリセロールの生成減少効果を測定するために、組成物６と１４を試料として用い、対照群としてカテキンを用いた。５週齢雄ハムスターを約２週間の適応期間を経て、全て三つのグループ（陰性対照群、実験群、対照群）に分け、各グループ当たり１０匹とした。動物実験室は、２５±１℃、湿度５５％を維持しながら、１２時間周期で光を調節した。全実験期間を通じて、餌と水を自由摂取させた。実験開始後、ハムスターの耳介に１０％実験溶液、または対照群溶液２００μｌを毎日１回ずつ１４日間皮膚表面に塗布した。この際、実験または対象群溶液の製造時、溶媒としてはエタノールとグリセロールの混合物（９５：５，ｖ／ｖ）を用いた。陰性対照群の場合、溶媒のみを塗布した。ハムスターから耳介を採取し、皮膚表面に生成した皮脂をアセトンを用いて抽出した。皮脂抽出液から生成したトリアシルグリセロールの量を測定した。また、ハムスターの耳介の皮膚組織から皮脂細胞を超音波機器を用いて、溶液内で懸濁させた後、皮膚細胞内に生成したトリアシルグリセロールの量を測定した。この際、生成したトリアシルグリセロールの量は、自動薄層クロマトグラフィーによって、トリオレート標準溶液を用いて計算した。測定されたトリアシルグリセロールの量を対照群の濃度を１００％として、その相対的な量を下記表８に示した。

実施例８‐２．皮脂腺細胞増殖抑制実験
ハムスター皮脂細胞は、５週齢ハムスターの耳介の皮脂腺からサトウの方法で採取した。皮脂細胞（２．３５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅ）を２％ＦＢＳ、２％ヒト血清を含めたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて２４時間培養し、プレートに付着させた。これらに前記組成物６及び前記組成物１４を様々な濃度で３日に１回ずつ添加し、１２日間培養した。［^３Ｈ］ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（１ｋＢｑ／ｗｅｌｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をサンプルの最終処理の３日前に加えた。ＤＮＡと結合した［^３Ｈ］ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの量を、放射線測定器で測定した。前記組成物の無処理セルを対照群として、細胞増殖程度を計算し、下記表９に示した。

上記表９に示したように、前記組成物溶液を用いた場合、皮膚表面及び細胞内の皮脂生成量が、対照群に比べて大きく減少したことを確認した。また、表８に示したように、前記組成物溶液を用いた場合、皮脂細胞の増殖が抑制されたことを確認した。したがって、本発明のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を有効成分として含めた組成物は、皮脂の生成量を減少させ、皮脂細胞の増殖を抑制するので、にきびの予防及び治療に優れた機能を有することが分かる。

実施例９．紫外線による炎症関連遺伝子発現抑制効果
前記組成物の紫外線による炎症関連遺伝子発現抑制効果を、紫外線によって皮膚表皮に生成する炎症生成因子（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α）の量を測定することにより調べた。

人間表皮細胞株（ＮＨＥＫ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）をケラチノサイト‐ＳＦＭ培地（無血清培地）で、９５％湿度と５％二酸化炭素下で、３７℃を維持して培養した。細胞を３×１０^４濃度で、９６ウェルプレートに分株し、２４時間後、細胞がプレートの底部にうまく付着したかを確認した後、前記組成物６と前記組成物１６及び対照群である茶抽出物を５０μｇ／ｍｌの濃度とし、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を溶媒として処理した。この際、ＤＭＳＯの最終濃度は、０．１％（ｖ／ｖ）であった。２４時間培養後、紫外線Ｂを照射した（４０ｍＪ／ｃｍ^２）。紫外線照射の２４時間後、培養液の上済みから各炎症因子（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α）の濃度をＨｕｍａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｅｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を用いて測定した。また、ＩＬ−１の濃度は、酵素免疫測定法で測定した。その結果を図２に示した。陰性対照群は、紫外線を照射しなかったセルを示し、陽性対照群は、前記組成物または対照群のサンプルを処理せずに、紫外線のみを照射したセルを示す。

図３に示すように、前記組成物６及び１６を処理したセルの場合、陽性対照群に比べて、炎症因子の発現を大きく抑制したことが分かる。したがって、前記組成物は、紫外線による皮膚損傷から強力な保護活性を有することが分かる。

実施例１０．皮膚細胞に対する毒性評価実験
前記組成物の正常皮膚細胞に対する細胞毒性をＮＨＥＫ（Ｆ）細胞（normal human epidermal keratinocytes of neonatal foreskin cell）とＮＢ１ＲＧＢ細胞（normal human fibroblast cell line from skin）を用いて測定した。これらの細胞は、ヒトの正常表皮と真皮の主要構成細胞として、コラーゲンやエラスチンを産生し、細胞の弾力を維持する重要な細胞である。

ＮＨＥＫ（Ｆ）細胞とＮＢ１ＲＧＢ細胞をＲＰＭＩ １６４０倍地を用いて培養した後、前記組成物を様々な濃度で処理し、１時間培養した。ここに、ＰＭＳ／ＷＳＴ‐１（1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate/2-(4-indophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt）混合物を入れ、１時間培養し、水溶性物質であるFormosanを発生させた後、４１５ｎｍで吸光度を測定した。この際、前記組成物を含めていない食塩水で処理したセルを陰性対照群とし、また、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液で処理したセルを陽性対照群（１００％アポトーシス）とした。

細胞毒性（アポトーシス、％）は、以下の式で計算され、各組成物のＬＤ_５０（５０％致死量、アポトーシスを５０％に到るようにする試料の濃度、μＭ）を計算し、表１０にまとめた。

「数学式」アポトーシス（％）＝（Ａ_０−Ａ）／（Ａ_０−Ａ_ｓ）×１００
Ａ_０＝前記組成物を処理しなかったセルの吸光度
Ａ＝前記組成物を処理したセルの吸光度（陰性対照群）
Ａ_ｓ＝１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを処理したセルの吸光度（陽性対照群）

上記表１０に示したように、前記組成物は、皮膚細胞に対して毒性を殆ど示さないことが分かる。

実施例１１．安全性確認のための遺伝毒性実験（復帰突然変異誘発性）
ヒスチジン要求性サルモネラ菌とトリプトファン要求性大腸菌を用いて、前記組成物の復帰突然変異誘発性の有無を評価した。

試験物質調製液（陰性対照物、前記組成物１５、陽性対照物）１００μｌ及び代謝活性系非適用であるときは、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５００μｌを、代謝活性系適用であるときは、Ｓ９ ｍｉｘ ５００μｌを、既に乾式加熱滅菌された試験管（１３ｍｍ×１００ｍｍ）に入れ、菌懸濁液１００μｌを添加し、３７℃、振とう培養器で、２０分間旋回培養した後、４５℃に保持された軟寒天溶液２ｍｌを添加しよく混合した後、Ｖｏｇｅｌ‐Ｂｏｎｎｅｒ最小グルコース寒天培地上にまいた。容量設定試験は、代謝活性系の適用有無にかかわらず、全ての試験菌株において、最高容量を５０００μｇ／プレートと設定し、その以下公比２で、最高容量を含めた５段階試験物質群を設定した。また、陰性対照群及び陽性対照群を別途に設定した。培養後、各ペトリ皿に発生した復帰突然変異コロニー数は、コロニー計数器（ＰｒｏｔｏＣＯＬ、ＳＩＮＢＩＯＳＩＳ、ＵＫ）で自動計測し、実体顕微鏡でコロニー周辺のｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｌａｗｎを観察し、菌の生育有無を確認した。

容量設定試験の結果、代謝活性系の適用有無にかかわらず、使用した全ての試験菌株において、生育阻害及び試験物質の析出は観察されなかった。全ての試験菌株において、試験物質による突然変異コロニー数は、代謝活性系の適用有無にかかわらず、容量依存的に増加されず、陰性対照群と比べて２倍以上の増加を示さなかった（図４、図５）。したがって、前記組成物の復帰突然変異誘発性は、陰性と判定された（図４、図５参照）。

前記組成物を含有した化粧品の処方例は、以下の通りである。

Claims (7)

1. ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体を有効成分として含有して,
   前記ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、下記化学式１乃至１０の化合物であり、このようなジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、一つまたは二つ以上の組合せで含まれることを特徴とする、しわ改善及び保湿剤用組成物 。
   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   上記式において、各Ｒは、Ｈ、アルキル、アルケニル、フェニル、フェニルアルキル、アルカノイル、ヒドロキシフェニル、ジヒドロキシフェニル、または、アシルである。
2. Ｒは、Ｈであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、二つ以上の組合せで含まれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体は、
   化学式２のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体及び化学式４のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体からなる群から選ばれる一つ以上のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体８〜９０重量％と；
   化学式１のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式３のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式５のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式６のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式７のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式８のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、化学式９のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体、及び化学式１０のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体からなる群から選ばれる一つ以上のジベンゾ−ｐ−ダイオキシン誘導体１０〜９２重量％と、を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
5. 前記ジベンゾ‐ｐ‐ダイオキシン誘導体は、Eisenia bicyclis、Eisenia arborea、Eisenia desmarestioides、Eisenia galapagensis、Eisenia masonii、Ecklonia kurome、 Ecklonia cava、Ecklonia stolonifera、Ecklonia maxima、 Ecklonia radiata、 Ecklonia bicyclis、Ecklonia biruncinate、Ecklonia buccinalis、Ecklonia caepaestipes、Ecklonia exasperta、Ecklonia fastigiata、Ecklonia brevipes、 Ecklonia arborea、Ecklonia latifolia、Ecklonia muratii、Ecklonia radicosa、Ecklonia richardiana、またはEcklonia wrightiiから抽出されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物の一日塗布量は、１〜１００ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
7. 請求項１に記載の組成物を含むことを特徴とする、しわ改善及び保湿剤用化粧品。

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