KR101396275B1

KR101396275B1 - 피부 미백 효과가 있는 강진향 추출물

Info

Publication number: KR101396275B1
Application number: KR1020120000195A
Authority: KR
Inventors: 박성하; 김보윤; 김아현; 박병준; 강세훈; 신용국; 옥주안; 김성연; 오은희
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2012-01-02
Filing date: 2012-01-02
Publication date: 2014-05-16
Also published as: KR20130078992A

Abstract

본 발명은 피부 미백 효과가 있는 강진향(Dalbergia odorifera T.)추출물을 제공한다. 본 발명의 강진향 추출물은 티로시나아제 활성을 저해함으로써 멜라닌 합성을 억제하는 기작으로 미백효과를 나타내며, 천연물질로부터 추출해낸 추출물이므로 화장료 조성물로 포함할 경우 안전하게 피부에 적용할 수 있다.

Description

피부 미백 효과가 있는 강진향 추출물{The extract from Dalbergia odorifera T. having skin whitening activity}

본 발명은 피부 미백 활성 효과가 있는 강진향(Dalbergia odorifera T.)추출물에 관한 것이다.

생명공학 기술의 발달과 함께 인간의 평균수명이 길어지면서 건강하고 아름다운 삶에 대한 욕구가 꾸준하게 늘고 있다. 특히 삶의 질이 변화함으로 인해 사람들의 생활패턴이 서구화되고 외형적인 미(美)의 기준 또한 서구적인 것을 추구하는 방향으로 변화되고 있다. 서구적인 미(美)의 기준으로 대표적인 것은 뚜렷한 이목구비와 하얀 피부가 있는데, 특히 어두운 피부색을 가진 동양인들은 하얀 피부를 가꾸는데 많은 관심을 쏟고 있다. 이로 인하여 미백과 관련된 화장품 시장은 매우 큰 폭으로 매년 증가하고 있다.

미백과 관련하여 피부의 색조를 결정하는 것은 피부 자체의 색과 두께, 멜라닌(melanin)과립의 양과 분포, 카로틴 등의 색소량, 혈액 등으로 알려져 있지만 그 가운데에서도 멜라닌과립의 양적 차이가 특히 중요하다. 멜라닌은 동물의 피부나 눈 등의 조직에 존재하는 갈색 내지 흑색 색소를 총칭하는 것으로, 일정량 이상의 자외선을 흡수하는 방식으로 과량의 자외선이 피부에 침투하는 것을 차단하는 중요한 물질이다. 그러나 비정상적인 멜라닌 축적은 기미, 주근깨, 모반 및 노인성 반점과 같은 색소 침착과 관련된 질환을 유발시켜 피부를 어둡게 변화시킨다.

멜라닌은 피부의 멜라노사이트라는 세포내의 멜라노좀에서 형성되는데, 멜라닌세포 수의 변화, 멜라닌 소체의 생산이나 구조의 이상, 멜라닌 소체의 멜라닌화 이상, 각질세포의 이동 정도 및 멜라닌의 소실되는 정도 등 여러 가지 요인이 멜라닌의 형성을 결정한다. 그리고 이는 유전, 대사, 내분비, 영양, 염증, 감염, 종양, 물리적 및 화학적 요인들에 의하여 크게 좌우될 수 있는 부분이다.

멜라닌의 합성은 피부의 표피 기저층에 존재하는 멜라닌 세포에서 이루어지며 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 합성된다. 멜라닌 세포는 피의 염증, 내분비 이상, 신경성 요인, UV 등에 의해 활성화된다. 자외선으로 인하여 세포 표면에 존재하는 여러 가지 수용체인 melanocortin-1 receptor(MC1R), frizzled enthothelin receptor, steel factor/C-kit receptor들이 자극되면 세포 내로 신호가 전달되어 MITF가 발현되는데, MITF의 발현은 다시 티로시나제와 같은 멜라닌 관련 단백질의 발현으로 이어진다. 멜라닌은 이렇게 티로시나제 및 티로시나제 관련 단백질 TRP-1, TRP-2에 의하여 타이로신 하이드록시라제(tyrosine hydroxylase)와 도파 옥시다제(DOPA oxidase)등이 생합성 되는 과정을 통하여 형성된다.

멜라닌이 합성 되면 피부가 어둡게 보일 수 있기 때문에 많은 미백 화장품은 피부세포에서 멜라닌의 합성을 저해할 수 있는 물질을 포함하고 있다. 하지만 대부분의 화장료 조성물의 강한 독성, 낮은 안정성 및 피부-투과성, 불충분한 활성으로 인해 현존하는 미백제는 그 사용이 제한되고 있다. 합성 티로시나제 저해제의 부작용으로 인해, 관련 업계 종사자들은 천연물로부터 부작용이 적고 효과가 좋은 새로운 티로시나아제 저해제 개발에 많은 관심을 가지고 있다.

본 발명에서는 티로시나아제 활성을 저해하는 미백 화장료 조성물로써 부작용이 적은 천연물질인 강진향 추출물을 이용한다. 강진향(Dalbergia odorifera T.CHEN)은 식물분류학적으로 콩과(豆科) 식물에 속하는 강향단의 근부 심재이며, 낙엽 교본으로서 길이가 약 10 m까지 자라고 잎은 호생하는 식물로서, 한방에서는 강향, 자등향, 번강, 계골향 등의 이름으로 불리기도 하며, 진통(鎭痛), 지혈(止血), 통기, 행어 등의 목적으로 사용되어 왔던 한약재이다. 또한, 근부 심재가 적갈색 또는 자색으로서 단단하여 약재는 근부를 취하여 외피를 제거한 후 사용한다.

강진향 추출물을 이용한 관련 특허로는 KR 2001-0030064호가 존재한다. 상기 특허에서는 강진향 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물과 건강식품을 기재하고 있다. 상기 발명에 따르면 강진향 추출물에는 포르모노네틴(formononetin)등의 식물 에스트로겐(phytoestrogen)이 다량 포함되어 있어 노화 또는 폐경 등의 다양한 원인에 의해 유발되는 골다공증을 부작용이 없이 예방 및 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 건강식품으로도 응용될 수 있음을 밝히고 있다. 또 다른 관련특허로써, KR 2005-0014973에서는 신경세포의 손상을 예방하거나 개선하는 강진향 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 기술을 기재하고 있고, KR2010-0018719에서는 강진향 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물을 기재하고 있다.

이와 같이 강진향의 소염, 골다공증 치료, 면역반응과 관련된 항 알러지 및 항 노화 등에 대한 효과는 보고된 바 있으나 강진향 추출물의 미백기능에 관련된 기술은 아직 공백기술로 남아있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

종래에 미백화장품 조성물로 사용되어온 화학물질들은 피부 자극이나, 세포독성, 제품의 안정성 및 시간에 따른 미백효과 저하 등의 문제가 해결 되지 않았고, 미백 화장료 조성물로 점차 천연물질을 선호하는 움직임이 일고 있다.

이에 본 발명은 강진향 추출물이 천연 미백제로 효과가 있음을 밝히고 이를 포함하는 미백 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 강진향 추출물 멜라닌 합성을 억제하는 메커니즘으로 미백 효과를 나타내며, 천연물질로부터 추출해낸 추출물이므로 화장료 조성물로 포함할 경우 안전하게 피부에 적용할 수 있다.

본 발명은 피부 미백 효과가 있는 강진향 추출물을 제공한다.

본 발명자들은 기(氣)와 혈의 순환을 촉진하고 출혈을 멈추게 하며 진통(鎭痛)의 효능이 있는 것으로 알려진 강진향에서 미백기능을 찾아내기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 상술한 장점을 가지는 강진향 추출물을 완성하였으며, 강진향 추출물이 멜라닌 합성을 저해함으로써 미백 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 피부 미백 효과가 있는 강진향(Dalbergia odorifere T.) 추출물을 제공한다.

본 명세서에서의 용어 ‘강진향’은 콩과(豆科) 식물인 강향단(降香檀, Dalbergia odorifera T. Chen)의 줄기와 뿌리의 심재(心材)를 말린 것을 의미한다. 한방에서는 강향, 자등향, 번강, 계골향 등의 이름으로 불리기도 하며, 진통(鎭痛), 지혈(止血), 통기, 행어 등의 목적으로 사용되어 왔던 한약재이다. 본 발명에서 강진향은 매우 중요하다. 강진향 추출물은 종래부터 기와 혈의 순환을 촉진하고 출혈을 멎게 하며 통증을 없애는 약리적 효과가 있다고 잘 알려져 있다. 그런 약학적 기능으로 인하여 관상동맥경화증, 협심증 및 골다공증 예방 등의 치료용 약학 조성물로 사용되어 왔으나, 본 발명과 같이 강진향 추출물이 화장품 조성물로 사용되어 미백작용을 하는 경우는 없었다. 그렇기 때문에 미백 화장품 조성물로 천연재료인 강진향 추출물을 적용하는 것은 본 발명의 목적이자 가장 큰 의의로 작용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 강진향 추출물은 바람직하게 멜라닌 합성을 저해하여 미백 작용을 하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 티로시나아제의 활성을 억제하여 미백 작용을 하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 멜라닌 합성 경로에 관여하는 티로시나아제, Trp-1 및 Trp-2의 단백질 발현을 억제하여 미백 작용을 하는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 강진향 추출물의 미백 작용 기작(機作)은 매우 중요하다. 왜냐하면 색소 침착을 예방하는 미백화장품의 기본 메커니즘은 티로시나제의 활성억제, 티로시나제의 생성억제, 멜라닌 생성을 촉진하는 중간인자(mediator)의 억제, 생성된 멜라닌의 환원 및 광산화 억제, 멜라닌의 배설 촉진 및 자외선 침투 차단 등이 있는데, 강진향 추출물은 이중 가장 간단하면서 효과적인 메커니즘이라 할 수 있는 티로시나아제의 생성 및 활성억제 기작으로 미백 기능을 나타내는 것이기 때문이다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면 상기 추출용매는 바람직하게는 에탄올, 헥산, 정제수 및 부틸렌 글라이콜을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 에탄올, 헥산, 및 정제수를 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올인 것을 특징으로 할 수 있다. 추출용매에 따라 티로시나아제 억제 효과의 차이가 발생하기 때문에 본 발명에서 사용하는 추출용매의 종류는 중요할 수 있다. 부틸렌 글라이콜 보다는 정제수를 이용하는 것이 티로시나제 효과가 뛰어날 수 있고 또, 정제수 보다는 헥산을 이용하는 것이, 헥산 보다는 에탄올을 이용하는 것이 티로시나아제를 억제하는 효과가 보다 더 뛰어날 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면 상기 추출용매로 사용되는 에탄올의 순도는 바람직하게 70-99%일 수 있고, 보다 바람직하게는 72-98%일 수 있으며, 가장 바람직하게는 75-95%의 에탄올일 수 있다. 본 발명에서 에탄올의 순도는 중요할 수 있다. 70%이하의 에탄올로 강진향을 추출할 경우 티로시나아제 억제 효과가 미약하고, 순도를 높여서 95%에 가까워지게 할수록 미백제로 사용량이 높은 알부틴보다 티로시나아제 억제 효과가 강하게 나타날 수 있기 때문이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 강진향 추출물을 유효 성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면 상기 추출물의 농도는 바람직하게 20-75 ㎍/㎖일 수 있고, 보다 바람직하게는 23-50 ㎍/㎖ 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 25 ㎍/㎖일 수 있다. 본 발명에서 상기 추출물의 농도는 티로시나아제 억제 및 세포독성에 있어 영향을 미치기 때문에 중요할 수 있다. 추출물의 농도가 75 ㎍/㎖이상일 경우 티로시나아제 억제 효과는 뛰어나지만 세포독성을 나타내고, 추출물의 농도가 20 ㎍/㎖ 이하일 경우, 티로시나아제 억제 효과가 미약하다. 따라서 세포독성을 나타내지 않는 범위에서 티로시나아제 억제 효과가 가장 뛰어난 추출물의 농도는 25 ㎍/㎖ 정도가 가장 바람직할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 강진향 추출물의 양은 미백 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.00001-30 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001-10 중량%, 가장 바람직하게는 0.001-0.5 중량%인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 상기 강진향 추출물의 가장 바람직한 양이 0.001-0.5 중량%인 이유는 강진향 추출물 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 미백효과가 크지 않다는 문제점이 있고, 0.5 중량%를 초과하는 경우에는 제품의 안정성에 다소 문제가 있을 수 있기 때문이다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물은 기본적으로 피부에 도포되는 것이므로, 당업계의 화장료 조성물을 참조하여 제공될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 미백 화장료 조성물은 상술한 강진향 추출물 이외에 다른 성분들을 포함할 수 있다. 글리세린, 부틸렌 글라이콜, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 판테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트 및 알란토인으로 포함된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 보조성분을 추가적으로 포함하며, 보다 바람직하게는 글리세린, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 스쿠알란 및 소듐 시트레이트을 추가적으로 포함하고, 부틸렌 글라이콜, 시트릭산, 판테놀 및 알란토인으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분을 포함하며, 가장 바람직하게는 글리세린, 부틸렌 글라이콜, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 판테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트 및 알란토인 모두를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 강진향 추출물을 유효성분으로 함유하는 치료학적 조성물을 제공하며, 상기 치료학적 조성물은 미백 및 색소 침착 억제가 탁월한 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물이 치료학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 치료학적 조성물은 치료학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 치료학적 조성물에 포함되는 치료학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 치료학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 치료학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 치료학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 치료학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 치료학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1-100 ㎎/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 치료학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 치료학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 치료학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에서 본 발명 조성물의 세포독성 분석 결과 본 발명 조성물의 유효성분은 천연물질로서 인체에 무해한 농도 범위를 갖고 있음을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명의 유효성분은 독성 및 부작용이 나타나지 않도록 장기간 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 및 치료학적 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 강진향 추출물을 함유하는 미백 화장료 조성물을 제공한다;

(b) 본 발명의 강진향 추출물은 멜라닌 생성 기작에 중요한 효소인 티로시나아제의 활성을 억제하여 효과적으로 멜라닌 합성을 줄일 수 있다;

(c) 본 발명의 강진향 추출물은 티로시나아제 및 Trp-1, Trp-2의 단백질 발현을 억제하여 멜라닌 합성을 직접적으로 저해함으로써 확실한 미백 효과를 가져다 줄 수 있다;

(d) 강진향 추출물이 갖는 소염, 진통, 및 항 노화 등의 기능이 부가적으로 작용될 수 있다; 및

(e) 천연물질로써 안전상 문제가 없고 또한 세포독성을 나타내지 않는 화장료 및 치료학적 조성물로 사용이 가능하다.

도 1은 강진향 추출물의 멜라닌 합성 저해율을 보여주는 흡광도 측정 결과 그래프이다.
도 2는 강진향 추출물이 Tyrosinase, Trp-1, 및 Trp-2 단백질 발현을 저해하는 것을 나타내는 X-ray 필름 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 강진향 추출물제조

1-1. 추출물(1)

강진향(한약재시장, 온라인)과 95% EtOH을 1:20 비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 이 과정을 3회 반복하여 추출한 후, 380메쉬로 여과하고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터(PALL corporation, USA)로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

1-2. 추출물(2)

강진향과 70% EtOH을 1:20 비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 이 과정을 3회 반복하여 추출한 후, 380메쉬로 여과하고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

1-3. 추출물(3)

강진향과 hexane(대정, 한국)을 1:20 비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 이 과정을 3회 반복하여 추출한 후, 380메쉬로 여과하고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

1-4. 추출물(4)

강진향과 정제수를 1:20 비율로 넣고 100℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출 후, 380메쉬로 여과하고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다. 이 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 농축물을 얻었다.

1-5. 추출물(5)

강진향과 1,3-부틸렌글라이콜((주)수이케이)을 1:3 비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 추출한 후, 380메쉬로 여과하고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다.

처방예 1. 강진향 추출물을 함유한 화장품 제조

1-1. 유연화장수

상기 실시예 1-1의 추출물을 함유한 화장료 중 유연화장수의 처방예는 다음과 같다.

	성분	함량(중량%)
	실시예 (1-1)	0.0025
1	폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.5
2	글리신	3.0
3	디포타슘글리시리제이트	0.1
4	1,3-부틸렌 글리콜	3.0
5	소듐히아루로네이트	0.1
6	에탄올	5.0
7	항산화제	0.1
8	트리에탄올아민	0.1
9	EDTA	0.1
10	방부제	적량
11	정제수	잔량

소듐히아루로네이트(인코스(주))는 프로펠러믹서(3000 rpm)로 정제수에 분산하여 1% solution상태로 준비하였다. 소듐히아루로네이트를 제외한 원료 1-8(1:한미약품(주), 2:한불제약(주), 3:고려제약(주), 4:(주)수이케이, 6:고려제약(주), 7:(주)원풍약품상사, 8:경남제약(주))은 프로펠러믹서를 사용하여 수상 용해조에 500 rpm으로 균일화 시키고 75℃에서 가온하여 완전 용해 한 후, 실온으로 냉각하였다. 그런 다음, 별도의 용해조에 원료 9-11(9:한송, 10:한올바이오파마(주))을 완전 용해하여 상기 수상 용해조에 투입하고 교반 혼합하였다. 여기에 실시예 1-1을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 실시예 1-1을 함유한 유연화장수를 제조 하였다.

1-2. 영양화장수

실시예 1-1의 추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수의 처방예는 다음과 같다.

	성분	함량(중량%)
	실시예 (1-1)	0.0025
1	글리세린	7.0
2	소르비탄스테아레이트 슈크로오즈코코에이트	2.0
3	미네랄 오일	4.0
4	트리옥타노인	1.0
5	스테아릭에씨드	1.0
6	글리세릴 스테아레이트	0.5
7	소르비탄모노스테아레이트	1.0
8	디메치콘	0.5
9	항산화제	0.3
10	트리에탄올아민	0.1
11	카보머	0.2
12	EDTA	0.1
13	방부제	적량
14	정제수	잔량

프로펠러믹서를 이용하여 카보머((주)마성상사)를 4000 rpm으로 분산하여 2% solution상태로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1-6(1:서현테크켐, 2:대원제약(주), 3:(주)한국파마, 4:두일화학, 5:보령제약(주), 6:보령제약(주))을 투입하여 호모믹서(2000 rpm)로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7-14(7:고려제약, 8:에스에스팜, 9:(주)원풍약품상사, 10:경남제약(주), 12:한송, 13:한올바이오파마)을 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 그 다음 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000 rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1-1을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 실시예 1-1을 함유한 영양화장수를 제조 하였다.

1-3. 에센스

실시예 1-1의 추출물을 함유한 화장료 중 에센스의 처방예는 다음과 같다.

	성분	함량(중량%)
	실시예 (1-1)	0.0025
1	글리세린	5.0
2	1,3-부틸렌 글리콜	2.0
3	폴리에칠렌 글리콜	2.0
4	카보머	1.0
5	소듐히아루로네이트	0.1
6	글리신	3.0
7	폴리아크릴아마이드	2.0
8	히드록시에칠셀룰로이즈	0.2
9	에탄올	3.0
10	항산화제	0.3
11	트리에탄올아민	0.1
12	폴리옥시에칠렌경화피마자유	1.0
13	EDTA	0.1
14	방부제	적량
15	정제수	잔량

소듐히아루로네이트, 히드록시에칠셀룰로이즈(한미약품(주))는 각각 정제수에 프로펠러믹서(2000 rpm)로 분산하여 1% solution상태로 준비하였다. 또 카보머는 정제수에 프로펠러믹서(4000 rpm)로 분산하여 2% solution상태로 준비하였다. 한편, 수상 용해조에 원료 1-12(1:서현테크켐, 2:(주)수이케이, 3:고려제약(주), 4:(주)마성상사, 5:인코스(주), 6:한불제약(주), 7:보령제약(주), 8:한미약품(주), 9:고려제약(주), 10:(주)원풍약품상사, 11:경남제약(주), 12:한미약품(주))를 투입하여 호모믹서(2000 rpm)로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였고, 가온 된 수상을 다시 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13-15(13:하송, 14:한올바이오파마)를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 여기에 실시예 1-1을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 실시예 1-1을 함유한 에센스를 제조 하였다.

1-4. 영양크림

실시예 1-1의 추출물을 함유한 화장료 중 영양크림의 처방예는 다음과 같다.

	성분	함량(중량%)
	실시예 (1-1)	0.0025
1	1,3-부틸렌글리콜	3.0
2	글리세린	3.0
3	하이드로제네이티드 레시친	1.0
4	옥틸도데카놀	3.0
5	트리옥타노인	2.0
6	스테아릭에씨드	1.5
7	세토스테아릴알콜	2.0
8	폴리솔베이트60	1.5
9	소르비탄세스퀴올레이트	2.0
10	디메치콘	3.0
11	항산화제	0.3
12	산탄검	0.2
13	트리에탄올아민	0.1
14	EDTA	0.1
15	방부제	적량
16	정제수	잔량

수상용해조에 원료 1-8(1:(주)수이케이, 2:서현케크켐, 3:풍림무약(주), 4:코그니스코리아(주), 5:두일화학, 6:보령제약(주), 7:대봉엘에스(주), 8:경남제약(주))을 투입하여 호모믹서(2000 rpm)로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 또 유상 용해조에 원료 9-16(9:(주)원풍약품상사, 10:에스에스팜, 11:(주)원풍약품상사, 12:동화약품(주), 13:경남제약(주), 14:한송, 15: 한올바이오파마(주))을 투입하여 80℃까지 가온 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000 rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1-1을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 실시예 1-1을 함유한 영양크림을 제조 하였다.

실험예 1. Mushroom tyrosinase 를 이용한 멜라닌 생성 억제 효과 테스트

1-1. Mushroom tyrosinase 활성 억제

티로시나제 작용 결과 생성되는 도파크롬(DOPA chrome)을 비색법에 의해 측정하는 방법을 변형하여, 강진향 추출물의 티로시나제(Tyrosinase)활성 억제력을 측정하였다. 96-well plate 내의 0.1 M phosphate buffer(pH6.5)(Sigma, USA) 110 ㎕에 1.5 mM L-Tyrosine 용액(Sigma, USA) 40 ㎕ 및 추출물 (1)-(5)을 각각 10 ㎕ 넣은 후, mushroom tyrosinase(2000 unit/㎖)(Sigma, USA) 10 ㎕을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 도파크롬을 마이크로플레이트 계수기(Biorad, USA)를 이용하여 490 ㎚에서 측정하였다. 또한 시험결과의 비교를 위해 양성대조구로 알부틴(Arbutin)(Sigma, USA)을 사용하였다. 실험 결과는 표 5와 같았다.

	알부틴	추출물 (1)	추출물 (2)	추출물 (3)	추출물 (4)	추출물 (5)
시료 (㎍/㎖)	500	100
타이로시나제 억제 효과	43	69	56	32	28	14

각 추출물을 가지고 실험한 결과 상기 표 5에서와 같이 추출물(1)과 (2)가 높은 타이로시나제 억제 효과를 나타내어 농도별 실험을 진행하였다.

추출물 (1)
시료 (㎍/㎖)	알부틴 500	100	75	50	25	10
타이로시나제 억제 효과	42	71	69	54	33	16

추출물 (2)
시료 (㎍/㎖)	알부틴 500	100	75	50	25	10
타이로시나제 억제 효과	45	59	53	35	15	-7

상기 표 6-7에서와 같이 추출물 (1)과 (2)는 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 우수한 타이로시나제 억제효과를 나타냈으며, 그 효과는 대조구인 알부틴의 5배 이상으로 높은 효과를 나타내었다.

실험예 2. B16 melanoma 를 이용한 멜라닌 생성 억제 효과 테스트

상기 실험에 1에서 타이로시나제 억제 효과가 우수하게 나타난 추출물 (1)과 (2)에 대해서 하기 실험을 진행하였다.

2-1. B16 melanoma 에 대한 세포 독성 테스트

B16F1(mouse melanoma)(ATCC, USA)을 10% FBS-DMEM에 배양한 후 이를 취하여 세포농도를 5×104 cell/mL로 조정한 세포액을 조제한 후 이를 96-well plate에 200 ㎕씩 분주하고 이를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양시켰다. 24시간 배양한 후 배지를 제거하고, 농도별로 조제한 강진향 추출물 20 ㎕과 10% FBS-DMEM(Gibco, USA) 180 ㎕를 다시 첨가하여 동일 조건에서 3일간 배양시켰다. 이 때 10% FBS-DMEM만 사용한 실험구를 대조구로 사용하였다.

3일 동안 배양한 후, 배지 및 용액을 제거하고 50 ㎍/㎖의 neutral red(10% FBS-DMEM)를 200 ㎕씩 넣은 다음 37℃ incubator에서 2시간 반응시켰다. 반응을 끝내고 Neutral red 용액을 제거한 뒤, 1% CaCl2 및 1% Formaldehyde(inD.W)용액을 100 ㎕씩 넣고 1분간 교반시켰다. 마지막으로 용액을 제거한 다음 1% Acetic acid 및 50% EtOH(in D.W)을 100 ㎕씩 넣고 15분간 교반시킨 후, microplate reader(Biorad, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다

추출물 (1)
시료 (㎍/㎖)	대조구	50	25	10	5	1	0.1
세포 증식률(%)	100.00	34.41	101.17	105.18	100.44	98.53	100.61

추출물 (2)
시료 (㎍/㎖)	대조구	50	25	10	5	1	0.1
세포 증식률(%)	100.00	46.43	114.39	106.44	97.03	103.47	96.43

세포독성 테스트 결과, 표 8 및 표 9에서와 같이 추출물 (1)과 (2)는 25 ㎍㎖ 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다.

2-2. B16 melanoma 에 대한 멜라닌 생합성 억제 실험

강진향 추출물이 B16F1 멜라노마(melanoma)내에서 멜라민(melanin)의 생합성을 억제하는 효과가 어느 정도인지 측정하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. 우선 B16F1(melanoma)을 10% FBS-DMEM에 배양하고 이를 취하여 세포농도를 5.0×104 cell/㎖로 조정한 세포액을 조제하였다. 이를 6-well plate에 2 ㎖씩 분주한 다음 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다. 24시간 배양 후 배지를 제거하고, 최종농도 0.2 uM α-MSH(Sigma, USA)로 조제한 배지 1.8 ㎖와 농도별 시료 200 ㎕을 혼합한 뒤 다시 동일 조건에서 72시간 배양시켰다. 이 때 Blank의 경우, α-MSH을 첨가하지 않은 배지만을 넣었으며, 양성 대조구는 동일 농도의 알부틴을 사용하였다.

72시간 배양한 후, 각 플레이트 용액의 멜라닌 생성량을 측정하기 위하여 1×PBS(-)(Sigma, USA)로 2회 세척하고 Trypsine-EDTA(Sigma, USA)용액을 200 ㎕씩 넣은 뒤 세포를 분리하였다. 이를 microtube(Axygen, USA)에 획득한 다음 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 분리된 pellet을 다시 1×PBS(-)로 2회 세척하고 70℃에서 1시간 동안 건조시켰다. 여기에 10% DMSO(dimethyl sufoxide)(in 1 M NaOH) 400 ㎕을 넣어 녹인 다음 이를 200 ㎕씩 취하여 96-well plate에 분주한 후, 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실험 결과 강진향 추출물이 멜라닌 생합성 저해 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었다. 특히, 25 ㎍㎖ 농도에서는 대조구인 알부틴 500 ㎍㎖ 보다 높은 멜라닌 생합성 저해효과를 보임을 확인하였다.

실험예 3. Western blotting 를 이용한 멜라닌 합성 관련 효소 단백질 발현 억제 효과 테스트

강진향 추출물의 멜라민(melanin) 생합성 억제 효과가 멜라닌 생합성을 관여하는 Tyrosinase, Trp-1, 및 Trp-2와 같은 단백질의 발현을 억제하는 것인지 확인하기 위해 western blotting실험을 진행하였다. B16F1(melanoma)을 10% FBS-DMEM에 배양한 후, 이를 취하여 세포농도를 5.0×104 cell/㎖로 조정한 세포액을 조제하였다. 이를 6-well plate에 2 ㎖씩 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다. 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 최종농도 0.2 uM α-MSH로 조제한 배지 1.8 ㎖과 농도 별 시료 200 ㎕을 혼합한 뒤 다시 동일 조건에서 24시간 배양시켰다. Blank의 경우 α-MSH을 첨가하지 않은 배지만을 넣었으며, 양성 대조구는 500㎍㎖ 농도의 알부틴을 사용하였다.

24시간 배양한 후, 세포를 회수하고 PRO-PREPTM Protein Extract Solution(Intron, Korea)으로 처리하여 세포를 용해한 다음 원심분리 하였다. 상층액을 취한 다음 8% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동하고, PVDF 멤브레인(GE healthacre, USA)으로 단백질을 이전시켰다. 이를 5% 탈지유(skim milk)가 포함된 Tris용액으로 1시간 blocking 시킨 후 Tyrosinase, Trp-1, 및 Trp-2 항체와 각각 반응시켰다. Horseradish peroxidase(HRP)(Millipore, USA)가 결합된 항체를 가하고 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate kit(Millipore, USA)를 이용하여 1-3분 동안 반응시킨 후 X-ray film으로 현상하였다.

상기 실험 결과 강진향 추추물은 25 ㎍㎖ 농도에서 Tyrosinase, Trp-1, Trp-2 발현을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 강진향 추출물의 미백 효과는 멜라닌 생성 단계 관여 효소들의 발현이 억제되어 나타나는 것임을 알 수 있었다.

실험예 4. 피부 미백 효과 테스트

상기 인-비트로 실험에서 나타난 미백 효과가 실제적으로 사람의 피부 미백에 도움을 주는 지 확인하기 위하여 실시예 1-1이 함유된 크림(처방예 1-4)에 대하여 인체 적용시험을 실시하였다. 로보스킨 분석기(Roboskin analyser) (Inforward, Japan)를 이용한 피부 미백 시험은 피시험자의 얼굴 부위에 제품을 적용하면서 주기적으로 색소 침착 및 피부 밝기의 개선 효과를 평가하였다.

실험은 피시험자 10명(대조구 5명, 시험구 5명)으로 진행되었으며 모두 여성으로 연령은 평균 34세로 구성되었다. 사용 전, 사용 후 1주, 2주, 4주, 6주의 총 5회 측정을 실시하여 평균값을 구하였으며 모든 실험은 20-24℃, 습도 45-55%인 항온항습실에서 진행되었다. 또한 측정은 세안 후 항온항습실에서 최소 1시간 이상 적응 시킨 다음 실시하였다.

실시예 1-1의 추출물을 함유한 크림(처방예 1-4)의 피부 미백효과 시험

	사용전		1주		2주		4주		6주
	대조구	시험구	대조구	시험구	대조구	시험구	대조구	시험구	대조구	시험구
색소 침착(소)	9.3	9.0	9.2	8.5	9.0	7.6	8.7	6.2	8.3	4.3
색소 침착(대)	32.0	31.5	31.8	30.7	31.1	29.8	29.6	27.5	28.8	23.9
밝기	65.5	66.0	66.0	68.0	66.2	71.8	67.8	75.4	69.7	77.9

처방예 1-4에 대한 피부 미백 효과 측정 결과, 표 10과 같이 2주차부터 색소침착(대, 소)이 감소 되는 경향을 나타내었으며 피부 밝기 또한 밝아지는 것을 알 수 있었다. 상기 실험의 결과로 인하여 강진향 추출물이 화장품 조성물로써 이용될 경우 피부 미백에 도움을 주는 다는 사실을 확인할 수 있었다.

Claims

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추출용매는 에탄올, 헥산, 정제수 및 부틸렌글라이콜을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상이고 추출물의 농도는 20-75 ㎍/㎖인 강진향 (Dalbergia odorifere T.) 추출물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 추출용매는 70-95vol%의 에탄올이고 상기 추출물의 농도는 23-50 ㎍/㎖ 이며 상기 강진향 추출물의 양은 미백 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001-30 중량%인 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 미백 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 추출물은 글리세린, 부틸렌 글라이콜, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 판테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트 및 알란토인으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 보조성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 추출물.
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