JP6375087B2 - 化粧料 - Google Patents
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また、本発明は、シソ科シソ属の植物であるシソの抽出物を有効成分として含有するメラノサイト増殖抑制剤である。
また、本発明は、シソ科シソ属の植物であるシソの抽出物を有効成分とするNF−κB活性化抑制剤及び/又はメラノサイト増殖抑制剤を含有する美白化粧料である。
なお、本明細書において化粧料なる文言は、所謂化粧料のほかに医薬部外品までも含む広義で用いる。
本発明で用いる抽出素材は、シソ科(Lamiaceae)シソ属(Perilla)のシソであって、一般的に、学名として、Perilla frutescensvar. Crispa、又はPerilla
frutescensvar. Brittonで表記されるものを含み、例えば、アオジソ、チリメンジソ、アカジソ、マダラジソ、カタメンジソ、チリメンアオジソ又はこれらの変種もしくは亜種、或いは交配種が挙げられるが、本発明はこれに限るものではない。
乾燥したシソの葉40gに精製水400gを加えて、冷蔵(2〜10℃)で一晩(18時間)抽出した。これをろ過して、褐色の抽出物(固形分2.2%)330gを得た。
乾燥したシソの全草40gに精製水400gを加えて、冷蔵(2〜10℃)で一晩(18時間)抽出した。これをろ過して、褐色の抽出物(固形分2.0%)300gを得た。
乾燥したシソの花(花穂)20gに精製水400gを加えて、冷蔵(2〜10℃)で一晩(18時間)抽出した。これをろ過して、濃褐色の抽出物(固形分0.8%)340gを得た。
乾燥したシソの茎20gに精製水400gを加えて、冷蔵(2〜10℃)で一晩(18時間)抽出する。これをろ過して、褐色の抽出物(固形分0.9%)320gを得た。
乾燥したシソの実(穂じそ)20gに精製水400gを加えて、冷蔵(2〜10℃)で一晩(18時間)抽出した。これをろ過して、濃褐色の抽出物(固形分0.6%)310gを得た。
[A成分] 部
オリーブ油 1.0
ポリオキシエチレン(5.5)セチルアルコール 5.0
ブチルパラベン 0.1
[B成分]
製造例1の抽出物 5.0
エタノール 5.0
グリセリン 5.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
[C成分]
香料 適量
A成分及びB成分をそれぞれ80℃以上に加温後、A成分にB成分を加えて攪拌し、さらにヒスコトロン(5000rpm)で2分間ホモジナイズを行った。これを50℃まで冷却した後、C成分を加えて攪拌混合し、さらに30℃以下まで冷却して化粧水を得た。
処方例1のB成分に含まれる製造例1の抽出物に代えて、製造例2の抽出物5.0部を用いるほかは、処方例1と同様にして化粧水を得た。
処方例1のB成分に含まれる製造例1の抽出物に代えて、製造例3の抽出物5.0部を用いるほかは、処方例1と同様にして化粧水を得た。
処方例1のB成分に含まれる製造例1の抽出物に代えて、製造例4の抽出物5.0部を用いるほかは、処方例1と同様にして化粧水を得た。
処方例1のB成分に含まれる製造例1の抽出物に代えて、製造例5の抽出物5.0部を用いるほかは、処方例1と同様にして化粧水を得た。
[A成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2.0
大豆レシチン 1.5
[B成分]
製造例1の抽出物 3.0
L−アスコルビン酸−2−グルコシド 2.0
水酸化カリウム 0.5
グリセリン 3.0
1,3−ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
精製水 全量が100部となる量
[C成分]
香料 適量
上記のA成分とB成分をそれぞれ80℃以上に加熱した後、攪拌混合した。これを50℃まで冷却した後、C成分を加えてさらに攪拌混合して乳液を得た。
処方例6のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてトラネキサム酸2.0部を用いるほかは処方例6と同様にして乳液を得た。
処方例6のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてアルブチン3.0部を用いるほかは処方例6と同様にして乳液を得た。
処方例6のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えて米糠抽出物加水分解物5.0部を用いるほかは処方例6と同様にして乳液を得た。
処方例6のB成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてソウハクヒ抽出物5.0部を用いるほかは処方例6と同様にして乳液を得た。
[A成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2.0
大豆レシチン 1.5
[B成分]
製造例1の抽出物 5.0
L−アスコルビン酸−2−グルコシド 2.0
水酸化カリウム 0.5
アルブチン 3.0
グリセリン 3.0
1,3−ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
製造例2の抽出物 10.0
エタノール 10.0
グリセリン 3.0
1、3−ブチレングリコール 2.0
メチルパラベン 0.2
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.3
カルボキシビニルポリマー 0.1
香料 適量
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
上記の成分を混合してローションを得た。
処方例12の成分中製造例2の抽出物に代えて製造例3の抽出物10.0部を用いるほかは処方例12と同様にしてローションを得た。
[成分] 部
エタノール 2.0
グリセリン 5.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
メチルパラベン 0.1
ヒアルロン酸 0.1
製造例4の抽出物 5.0
クエン酸 0.3
クエン酸ナトリウム 0.6
精製水 全量が100部となる量
精製水にヒアルロン酸を溶解させた後、残りの原料を順次加えて攪拌溶解させ、透明のエッセンスを得た。
処方例14の成分中製造例4の抽出物に代えて製造例5の抽出物5.0を用いるほかは処方例15と同様にしてエッセンスを得た。
[A成分] 部
ステアリン酸 2.4
モノステアリン酸プロピレングリコール 2.0
セトステアリルアルコール 0.2
液状ラノリン 2.0
流動パラフィン 3.0
ミリスチン酸イソプロピル 8.5
プロピルパラベン 0.05
[B成分]
製造例1の抽出物 5.0
カルボキシメチルセルロースナトリウム 0.2
ベントナイト 0.5
プロピレングリコール 4.0
トリエタノールアミン 1.1
メチルパラベン 0.1
精製水 全量が100部となる量
[C成分]
酸化チタン 8.0
タルク 4.0
着色顔料 適量
上記のA成分とB成分をそれぞれ加温した後混合攪拌した。これを再加温し、上記のC成分を添加して型に流し込み、室温になるまで攪拌してリキッドファンデーションを得た。
[A成分] 部
N−ラウロイルメチルアラニンナトリウム 25.0
ヤシ油脂肪酸カリウム液(40%) 26.0
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 3.0
メチルパラベン 0.1
[B成分]
製造例2の抽出物 5.0
1,3−ブチレングリコール 2.0
精製水 全量が100部となる量
A成分及びB成分をそれぞれ80℃に加温して均一に溶解した後、A成分にB成分を加え、攪拌を続けて室温まで冷却してボディシャンプーを得た。
[試験方法]
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞(NB1RGB)を0.5容量%NCS含有イーグルMEM(日水製薬社製)にて1×105個/mLに調製し、96穴マイクロプレートに100μLずつ播種して、5%CO2、飽和水蒸気下、37℃で培養した。24時間後、製造例1の抽出物を含む培養液(培養液全量に対する製造例1の抽出物の溶液としての終濃度が2%)を添加しさらに培養した。また、対照として製造例1の抽出物に代えてPBS(−)を含んだ培養液(培養液全量に対するPBS(−)の溶液としての終濃度が2%)を添加した試験区を2つ設定した。48時間後、培養上清を除去して、上記と同様の終濃度の製造例1の抽出物を含んだ新しい培養液を添加し、さらに、NF−κBを活性化するサイトカインとして知られているTNF−α溶液(4ng/mL)を同等量添加した。対照の2試験区には培養上清を除去した後に、上記と同様の終濃度のPBS(−)を含んだ培養液を追添加し、一方にはその上から4ng/mL TNF−α溶液を同等量添加し、他方にはPBS(−)を同等量添加した。そして5%CO2、飽和水蒸気下、37℃で2時間培養した。細胞の培養終了後、Cellomics(登録商標) NF−κB Activation HCS Reagent
Kits(Thermo Scientific社製)を用いて培養細胞内のNF−κBに対して抗体による蛍光免疫染色を行った。そして、蛍光フィルター(U−MWIB2)を用いて蛍光観察を行い、繊維芽細胞内のNF−κBの活性化、すなわち、核への移動の有無を観察した。
正常ケラチノサイトNHEKをHumedia
KG2培地(クラボウ社製)を入れた24ウェルプレートに6×104個/穴播種し、翌日上清をPBS(−)に交換して紫外線照射を行った(50mJ/cm2)。紫外線照射後、上清をHumedia
KB2培地(クラボウ社製)に交換し、培養を継続した。培養1日後の培養上清(以下「紫外線照射上清」という)を分取した。また、比較として紫外線照射を行わない区を設定し、その他の操作は紫外線照射区と同様に行った区の培養上清(以下「紫外線未照射上清」という)も分取した。一方、正常メラノサイトNHEMを、DermaLife培地(クラボウ社社製)を入れた96穴マイクロプレートに5×103個/穴播種し、37℃,5.0%CO2の条件下に1日間プレ培養した後、製造例1〜3の抽出物(試料溶液)をそれぞれ培地に添加した。このときの試料溶液の濃度は、それぞれの抽出物の溶液として終濃度が培地全量に対して2.5%、5.0%となるように調整した。当該培地に、さらに上記ケラチノサイトの紫外線照射上清または紫外線未照射上清も添加した。3日間培養後上清を捨て、PBS(−)で1回洗浄後、PBS(−)で100倍希釈したhoechst33342試薬を100μL/穴添加し、37℃で1時間インキュベートし、DNAを蛍光染色した。その後、蛍光強度(励起:355nm、放射:460nm:蛍光マイクロプレートリーダー[フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製])を測定し、DNA量を求めた。試料溶液の代わりにPBS(−)を添加した試験区に対してもケラチノサイトの紫外線照射上清を添加した区(陽性対照区)と紫外線未照射上清を添加する区(コントロール区)を設定し、同様の操作を行った。試験結果は、PBS(−)とケラチノサイトの紫外線未照射上清を添加した区をコントロールとし、ここに得られた蛍光強度(DNA量)に対する各試料添加区の蛍光強度の相対値を求め、メラノサイト増殖率(%)とした。
[表1]
本試験においては、本発明の抽出物による、メラノサイトの活性化因子である肝細胞増殖因子(HGF)の受容体(Met)遺伝子「c−Met」の発現抑制効果について、以下の通り試験を行った。
[試験方法]
正常ヒト表皮メラニン細胞を増殖添加剤含有DermaLife(登録商標)[クラボウ社製]にて6×105個/mLに調製し、φ6cmのシャーレに1mLを播種して、5%CO2、飽和水蒸気下、37℃で培養した。24時間培養後、さらに、製造例1〜3の抽出物を含んだ培養液(培養液全量に対して溶液として終濃度が5%となるように製造例1〜3の抽出物を添加したもの)と、cAMP溶液を添加して培養した。なお、cAMP溶液はこれを添加する培養液においてその終濃度が100μMとなるように添加した。ここで、cAMPは、細胞内で様々な受容体が活性化したときに増加する細胞内シグナル伝達物質の一つであり、本試験系ではヒト表皮メラニン細胞を活性化する因子として添加した。以上の試験区に対して、比較対照として、製造例1〜3の抽出物に代えて、PBS(−)溶液のみを含んだ培養液(培養液全量に対するPBS(−)の終濃度を5%に調整したもの)を添加した試験区(コントロール区)と、製造例1〜3の抽出物及びcAMPに代えて、PBS(−)溶液及びcAMPを含んだ培養液(培養液全量に対するPBS(−)の終濃度は5%であり、cAMPの終濃度は100μMである)を添加した試験区(陽性対照区)を設定した。24時間培養後、それぞれの試験区の細胞をTrizol試薬(Invitrogen社製)1mLで回収した。回収した細胞に対してクロロホルム(和光純薬工業社製)200μL添加して撹拌混合し遠心分離機(TOMY社製/MX-160)で15,000rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離した後、水層のみを400μL分取した。回収した水層にイソプロパノール(和光純薬工業社製)500μLを添加して撹拌混合し、15,000rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離してtotalRNAの沈殿物を得た。totalRNAに75%エタノールを1mL添加して撹拌して洗浄し、15,000rpm、4℃条件下で15分間遠心分離して沈殿を回収した。回収したtotal RNAを所定のキット(PrimeScript RT reagent Kit
with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(タカラバイオ社製))を用いて逆転写反応し、cDNAを合成した。合成したcDNAをサンプルとして、Thermal Cycler Dice(登録商標)Real Time System
Single(タカラバイオ社製)、及びSYBR(登録商標)Premix Ex TaqTM
II(Perfect Real Time)[タカラバイオ社製]を用いて、c−Met遺伝子の発現と、内部標準物質G3PDH遺伝子の発現の検出を行った。ここで、G3PDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)は、ハウスキーピング遺伝子(多くの組織や細胞中に共通して一定量発現する遺伝子であって、常に発現され,細胞の維持,増殖に不可欠な遺伝子である)の一つであり、発現量が常に一定とされていることから、PCRの実験では内部標準として用いられるものである。試験結果は、G3PDH遺伝子の発現量を一定とした場合の、それぞれの試験区でのc−Met遺伝子の発現量を比較した。本試験系においては、コントロール区のc−Met遺伝子の発現量を100としたときの他の試験区でのc−Met遺伝子の発現量の相対値を求めた。
Claims (3)
- シソ科(Lamiaceae)シソ属(Perilla)の植物であるシソの水抽出物を有効成分として含有するNF−κB活性化抑制剤。
- シソ科(Lamiaceae)シソ属(Perilla)の植物であるシソの水抽出物を有効成分として含有するメラノサイト増殖抑制剤。
- シソ科(Lamiaceae)シソ属(Perilla)の植物であるシソの水抽出物を有効成分とするNF−κB活性化抑制剤及び/又はメラノサイト増殖抑制剤を含有する美白化粧料。
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