ES2959130T3 - Extracto de torta de semillas de Moringa peregrina, su procedimiento de obtención y su uso en composiciones cosméticas o nutricosméticas - Google Patents

Extracto de torta de semillas de Moringa peregrina, su procedimiento de obtención y su uso en composiciones cosméticas o nutricosméticas Download PDF

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Abstract

La invención se refiere a un extracto de torta de semillas de Moringa peregrina, que comprende predominantemente un hidrolizado de péptidos, y a un método para obtener el extracto. La invención también se refiere a composiciones cosméticas o nutricosméticas que comprenden dicho extracto y al uso de dichas composiciones para mejorar el aspecto de la piel, mucosas o apéndices cutáneos, prevenir y/o combatir la sequedad de la piel y mucosas, prevenir y/o combatir los signos cutáneos de la edad y/o fotoenvejecimiento, y favorecer el blanqueamiento y adelgazamiento de la piel. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Extracto de torta de semillas de Moringa peregrina, su procedimiento de obtención y su uso en composiciones cosméticas o nutricosméticas
Área técnica
La invención se refiere al campo de los cosméticos y nutricosméticos y más particularmente al de los ingredientes activos utilizados en la formulación de composiciones para el cuidado de la piel. La invención se refiere a un extracto de torta de semillas deMoringa peregrinaque comprende principalmente un hidrolizado peptídico. La invención también se refiere al procedimiento de obtención del extracto particular de torta de semillas deMoringa peregrina, a lascomposiciones cosméticas o nutricosméticas que comprenden dichos extractos y, por último, al uso cosmético o nutricosmético de dichas composiciones para el cuidado de la piel, el cuero cabelludo y las faneras.
Antecedentes tecnológicos
Las Moringáceas son una familia monogenérica (un solo género,la MoringaAdans), que forma parte de la flora sahariano-sindia y comprende entre doce y catorce especies según los autores, distribuidas desde África oriental hasta Asia. El género se divide clásicamente en 3 secciones que, sin embargo, los análisis filogenéticos no confirman como monofiléticas. Estos últimos clados bastante destacados, se centraron en determinadas características morfológicas: paquicaules (“bottle tres”), árboles tuberosos (“tuberous trees”) y ni paquicaules ni tuberosos (en inglés “slender tres”). La especieMoringa peregrina(Forssk.) Fiori, pertenece al tercer grupo. Los escasos estudios genéticos sobre el género o la familia confirman la realidad de la especie en relación con las demás especies del género, sobre todo en relación con la Moringa india,Moringa oleiferaLam. (véanse en particular los artículos: OLSON, M. E. 2002, Combining Data from DNA Sequences and Morphology for a Phylogeny of Moringaceae (Brassicales), Systematic Botany 27(1): 55-73; HASSANEIN, A. M. A. a Nd AL-SOQEE, A. A., 2018, Morphological and genetic diversity of Moringa oleifera and Moringa peregrina genotypes, Horticulture, Environment and Biotechnology 59(2): 251-261). Un trabajo reciente sobreMoringaperegrina muestreada en diferentes localidades de Arabia Saudí concluyó, utilizando marcadores ITS, que la especie es genéticamente estable (ALAKLABI, A., 2015, Genetic diversity of Moringa peregrina species in Saudi Arabia with ITS sequences, Saudi Journal of Biological Sciences 22. (en inglés): 186-190) pero con un alto nivel de variación genética dentro de las poblaciones.
La especieMoringa peregrinase encuentra en entornos rocosos de Yemen, Omán, Arabia Saudí, África Oriental, Sudán, Etiopía, Eritrea, Somalia y Yibuti. Su presencia en Irán parece limitarse a las provincias del sudeste, pero debe confirmarse (PROTA14 = MUNYANZIZA E. ET YONGABI K. A., Aceites vegetales/Oléagineux,Moringa peregrina(Forssk.) Fiori, http://database.prota.org/protahtml/moringa peregrina_en.htm, consultado el 23/10/2019). En Levante y Egipto, la especie sólo representa actualmente un puñado de estaciones dispersas y relictas (a excepción de algunos rodales altitudinales), principalmente en las zonas sudanesas.LaMoringa peregrinatambién se considera rara y en peligro en Sudán y Yemen. En comparación con otras especies de su clado,la Moringa peregrinaocupa los hábitats más áridos e inhóspitos. Al parecer, es más resistente a la sequía quela Moringa oleifera, que se planta comercialmente a gran escala en zonas tropicales y subtropicales. Estudios recientes han demostrado que el tamaño y la tosquedad de las semillas influyen favorablemente en el tiempo de germinación y en la tasa y velocidad de crecimiento de los individuos jóvenes (GOMAA N. H. ET PICO F. X., 2011, Seed germination, seedling traits, and seed bank of the tree Moringa peregrina (Moringaceae) in a hyper-arid environment, American Journal of Botany 98(6): 1024-1030), lo que indica un ajuste en la asignación de recursos basado en la calidad de las semillas más que en su número, que permite ala Moringa peregrinareproducirse eficazmente en entornos abióticos extremos (hiperáridos). Las semillas deMoringa peregrinatienen una mesotesta central más gruesa, en términos de capa celular, que las deMoringa oleifera.
Existen algunas menciones históricas que tienden a indicar que el aceite deMoringa peregrinaera objeto de un comercio activo en los primeros tiempos del Islam en la región de Al-Ula (NASEEF, A. A. S.,1995,Al-'Uía, A study of Cultural and Social Heritage).En la actualidad, el aceite producido a partir de laMoringa peregrinase destina principalmente al autoconsumo o a los mercados locales. En Arabia Saudí, las hojas se utilizaban tradicionalmente de forma interna como decocción para tratar la diabetes, las enfermedades del colon, las enfermedades oculares y la anemia (ABDEL-KADER, M. S., HAZAZI A. M. A., ELMAKKI O. A. AND ALQASOUMI S. I., 2018, A survey on the traditional plants used in Al Kobah village, Saudi Pharmaceutical Journal 26(6): 817-821) y como diurético, rubefaciente y astringente (AQEEL A. A. M., TARIQ M., MOSSA J. S., AL-YAHYA M. A. ET AL-SAID M. S., 1984, " Plants used in Arabia Folk medicine ", Report submitted to Saudi Arabian National Cenre for Science and Technology, Riyadh, Saudi Arabia). En Omán, el aceite, extraído por las mujeres a finales del verano, se utiliza para las migrañas, la fiebre, las quemaduras, las laceraciones y fracturas, el estreñimiento y los dolores de estómago, los dolores musculares y el cabello seco (GHAZANFAR S. A., 1994, Handbook of Arabian Medicinal Plants, 1a edn, CRC Press, Boca Ratón, Ann Harbor, s.u.; GHAZANFAR S.A., 1998, Plantas de importancia económica, cap.
15en GHAZANFAR, S.A. Y FISHER, M. (eds.) Vegetación de la Península Arábiga. Geobotany 25, p. 241-264, Kluwer Academic Publishers, cuadro 11.1, p. 247 y 11.7 p. 251). También se utilizaba en composiciones perfumadas (GHAZANFAR S. A., 1998, p. 259) y en Omán y Yemen como loción facial (GHAZANFAR S. A. AND RECHINGER B., 1996, Two multi-purpose seed oils form Oman. Plantas para la alimentación y la medicina. Ponencia presentada en la reunión conjunta de la Society for Economic Botany y la International Society for Ethnopharmacology, 1-7 de julio de 1996, London).
Los extractos de semillas deMoringa oleíferason conocidos en el campo de la cosmética. Por ejemplo, sabemos por el documento FR296879 un extracto de semillas enteras (con tegumentos) deMoringa oleíferaque contiene, por 100 g de extracto seco, de 5 a 50% de aceite (incluidos triglicéridos, ácidos grasos y lípidos polares) y de 0,01 a 5% de polifenoles, y su utilización en composiciones cosméticas para combatir el envejecimiento cutáneo. En este documento, la semilla entera deMoringa oleiferaseextrae utilizando un disolvente moderadamente polar.
También se conoce por el documento FR2776519 que los extractos de proteínas de semillas deMoringa oleifera,conocidos por sus efectos clarificantes sobre las aguas turbias, tienen un efecto suavizante, acondicionador fisiológico, hidratante, reestructurante y reparador sobre la piel y las mucosas, así como un efecto anticontaminación. En este documento, los ingredientes activos son proteínas con pesos moleculares de entre 6.500 y 8.800 Da, obtenidas por extracción acuosa de la torta oleaginosade Moringa oleiferacon hidróxido de sodio 4N durante una hora a pH 7,5.
También se conoce por el documento FR2825267 que los extractos de semillas deMoringa,enteros o triturados, descascarillados o sin descascarillar, o de los que se ha producido un triturado o extractos proteicos deslipidados o no deslipidados, tienen beneficios en los campos de la desodorización y eliminación de olores desagradables, la limpieza, la higiene íntima, la higiene bucal y el cuidado dental, así como propiedades cosméticas suavizantes, hidratantes y calmantes, higiene íntima, higiene bucal y cuidado dental, así como propiedades cosméticas suavizantes, hidratantes, calmantes y antifatiga en la piel. En este documento, se demuestra que los extractos de proteínas enteras tienen una mayor actividad cuando la semilla no está desaceitada.
El documento FR3076460 se refiere a la utilización de un extracto proteico de semilla deMoringa oleiferano germinada y desaceitada para el tratamiento de pieles y/o mucosas sensibles, sensibilizadas, reactivas, frágiles y/o debilitadas y/o en el tratamiento y/o prevención de eritemas, en particular la dermatitis del pañal en lactantes. En este documento, el procedimiento de extracción permite obtener una fracción mayoritaria de proteínas con pesos moleculares en torno a 8.800 Da.
Por último, por el documento KR20130088224 se conoce el uso de un extracto de semilla deMoringa oleiferaentera germinada en cosméticos, en particular obtenido por extracción utilizando un fluido supercrítico. Este procedimiento permite aislar carotenoides apolares y aminoácidos, que se describen como activos para uso cosmético blanqueador.
Todos los documentos mencionados se refieren a la utilización de la especieMoringa oleifera; ninguno describe la utilización en el ámbito cosmético de extractos procedentes de la especieMoringa peregrina.
Más específicamente para la especieMoringa peregrina,se sabe que ciertos compuestos fenólicos y flavonoides obtenidos de las hojas o de la semilla entera de Moringaperegrinapresentan actividad antioxidante (AL-DABBAS M., 2017, Actividad antioxidante de diferentes extractos de la parte aérea de Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, de Jordania, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 30(6): 2151-2157). Estos compuestos se extraen de las hojas o de las semillas enteras utilizando disolventes como el metanol, el acetato de etilo o el hexano. Parece que las hojas contienen los compuestos más activos. También conocemos el documento de ABU TARBOUSHet al.XP055753092, 2005 que describe la extracción de un hidrolizado de semillas deMoringa peregrinadescascarilladas producido por hidrólisis enzimática durante un periodo de 10 horas. El objetivo de esta extracción es obtener un producto con una gran capacidad de absorción de aceite y agua. Por último, el documento de NASHEFet al,XP0010830, 1977, ofrece una descripción general de las consecuencias de la hidrólisis alcalina, principalmente en proteínas puras, que puede provocar cambios en las propiedades físicas y químicas de las proteínas, así como en su valor nutritivo. Las condiciones de hidrólisis utilizadas con hidróxido de sodio 0,1 M son a una temperatura de 50°C durante 24 horas. El documento cita daños renales en ratas alimentadas con proteínas tratadas con álcalis en estas condiciones.
Así, en función de las especies utilizadas del géneroMoringa,se observa que según la parte de las plantas (hoja, semilla), la parte de las semillas (enteras o no, descascarilladas o no) y el procedimiento de extracción utilizado, en particular la elección del disolvente, las moléculas extraídas resultan ser diferentes. La composición del extracto determina su actividad biológica y, por tanto, su eficacia cosmética.
En vista de lo anterior, un problema que la invención pretende resolver es desarrollar nuevos productos basados en un extracto de la especieMoringa peregrinadel géneroMoringay de la familia Moringaceae que puedan utilizarse en cosmética y sean fáciles de usar.
En consecuencia, el solicitante ha identificado un nuevo extracto obtenido de la torta de semillas de la especieMoringa peregrina,que mejora el aspecto de la piel, las mucosas y las faneras y, en particular, para prevenir y/o combatir la sequedad de la piel y las mucosas, prevenir y/o combatir los signos cutáneos del envejecimiento y/o fotoenvejecimiento, promover el blanqueamiento de la piel y prevenir las manchas de la edad, así como para promover el adelgazamiento y prevenir o aliviar el enrojecimiento de la piel. El extracto según la invención comprende principalmente un hidrolizado peptídico de torta de semillas deMoringa peregrina.El extracto obtenido específicamente a partir de la torta de semillas no descascarilladas deMoringa peregrina esnuevo en el campo de los cosméticos en dos aspectos en comparación con los extractos de la técnica anterior, en primer lugar por la especie específica de origen utilizada y en segundo lugar por su perfil molecular particular.
Por acuerdo intergubernamental de 10 de abril de 2018 entre el Gobierno de la República Francesa y el Reino de Arabia Saudí, el demandante, Agence Frangaise Pour Le Développement d'AlUIa (AFALULA), y la Royal Commission for AIUIA (RCU) tienen un proyecto común para desarrollar una agricultura responsable y la economía local, en particular a través de la producción local de productos naturales derivados de plantas autóctonas, y proteger la biodiversidad y los derechos de la región de AlUla del Reino de Arabia Saudí. El Reino de Arabia Saudí es miembro del Protocolo de Nagoya desde el 8 de octubre de 2020. En el momento de redactar esta patente, se está estudiando la normativa de aplicación en virtud de la cual el Protocolo de Nagoya se incorporará a los aspectos pertinentes de la legislación local. Por lo tanto, en esta fase, el Reino de Arabia Saudí no tiene requisitos específicos con respecto a esta solicitud de patente y al Protocolo de Nagoya. Así pues, el día en que se presenta la solicitud de patente, no se exige un certificado de conformidad relativo al acceso a los recursos genéticos.
Sumario
El primer objeto de la invención es un extracto de la torta de semillas de Moringaperegrinaque comprende principalmente un hidrolizado peptídico que comprende derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular está comprendido entre 100 Da y 6.000 Da, preferentemente entre 1.500 Da y 5.000 Da, aún más preferentemente entre 3.000 y 4.500 Da, y en que se obtiene a partir de semillas maduras y no descascarilladas del fruto deMoringa peregrinapor proteólisis química a un pH superior a 13 durante un período aproximado de 2 horas a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C.
Gracias a su característica, el extracto según la invención es único en el géneroMoringay en la familia Moringaceae. Se demostrará que el extracto de la especieMoringa peregrinatiene un hidrolizado peptídico específico que es diferente de los conocidos de otras especies del género, en particular de laespecie Moringa oleifera,que el solicitante ha podido identificar.
El segundo objeto de la invención es un procedimiento de obtención de un extracto de torta de semillas deMoringa peregrinasegún la invención, caracterizado porque comprende las siguientes etapas según las cuales:
a) las semillas no descascarilladas recolectadas cuando están maduras del fruto de laMoringa peregrinase recogen y se secan hasta alcanzar un contenido de humedad interna inferior al 8%,
b) las semillas secas se prensan para separar el aceite del resto de la semilla con el fin de obtener una torta que contenga menos de un 6% en peso de aceite residual,
c) se tritura la torta obtenida en la etapa b),
d) la torta triturada obtenida en la etapa c) se dispersa en una fase acuosa,
e) la dispersión acuosa obtenida en la etapa d) se somete a proteólisis química durante un período aproximado de 2 horas, a un pH superior a 13 y a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C,
f) se neutraliza la proteólisis para estabilizar el hidrolizado peptídico obtenido,
g) el hidrolizado peptídico se recupera mediante separación sólido/líquido,
h) el hidrolizado peptídico se purifica por ultrafiltración y, a continuación, opcionalmente,
i) el hidrolizado peptídico obtenido en la etapa h) se liofiliza.
El tercer objeto de la invención es una composición cosmética o nutricosmética que comprende, como agente activo, una cantidad eficaz de un extracto de torta de semillas deMoringa peregrinasegún la invención y un excipiente fisiológicamente aceptable.
Por último, el cuarto objeto de la invención es el uso cosmético o nutricosmético de una composición según la invención para mejorar el aspecto de la piel, las mucosas o las faneras, prevenir y/o combatir la sequedad de la piel y las mucosas, prevenir y/o combatir los signos cutáneos de envejecimiento y/o fotoenvejecimiento, favorecer el blanqueamiento de la piel y favorecer el adelgazamiento.
Breve descripción de las figuras
La invención se entenderá mejor, y otros propósitos, detalles, características y ventajas de la misma se aclararán en el curso de la siguiente descripción de varias realizaciones particulares de la invención, dadas únicamente a modo de ilustración y no de limitación, con referencia a los dibujos adjuntos.
La [fig.1] muestra los resultados comparativos del efecto hidratante de distintos productos sobre la superficie de la piel.
Descripción de las realizaciones
En esta descripción, a menos que se especifique lo contrario, se entiende que cuando se da un intervalo, éste incluye los límites superior e inferior de dicho intervalo.
En la presente invención, las siguientes abreviaturas significan:
• MTT: bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (el ensayo MTT es un procedimiento rápido para contar células vivas)
• SDS: Dodecil sulfato sódico
• PBS: Solución salina tampón fosfato
• ELISA: Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
• PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
• ANOVA: Análisis de varianza
• MSH: Hormona estimulante de melanocitos
En la presente invención:
• "principalmente un hidrolizado peptídico" en una cantidad superior al 10%, preferentemente superior al 20%, aún más preferentemente superior al 30% y hasta aproximadamente el 40% (peso/peso) de la materia seca en péptidos, oligopéptidos, glucopéptidos y aminoácidos o sus derivados nitrilados volátiles, aún más preferentemente el 50% del peso de la materia seca.
• por "cantidad efectiva" se entiende la cantidad de moléculas activas necesaria para obtener el resultado deseado, es decir, para mejorar el aspecto de la piel.
• "proteólisis" se refiere a la segmentación de las proteínas en péptidos, oligopéptidos y sus fragmentos básicos (aminoácidos) mediante hidrólisis química o enzimática.
• "aplicación tópica": el acto de aplicar o extender el principio activo según la invención, o una composición que lo contenga, sobre la superficie de la piel, una membrana mucosa o las faneras.
• "fisiológicamente aceptable" que es adecuado para uso tópico, en contacto con la piel humana, o para su uso por otras vías de administración, como por vía oral o inyectado en la piel, sin riesgo de toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad o respuesta alérgica.
• "torta": la parte de la semilla que ha sido desaceitada tras el prensado. Es el residuo sólido de la extracción del aceite de las semillas. Es un subproducto de la trituración en el procedimiento de fabricación del aceite. Generalmente representa entre el 50 y el 75% del peso de las semillas.
• el término "semillas no descascarilladas" se refiere al hecho de que la cáscara (pericarpio) y el tegumento de las semillas recolectadas se mantienen alrededor de los granos.
• "cuando la fruta está madura" significa que el fruto está maduro, preferiblemente cuando la vaina empieza la dehiscencia y tiene un color entre beige oscuro y marrón, y cuando un giro de 180° del cuarto inferior de la vaina empieza a abrir las valvas.
• "alrededor de”, un margen de más o menos entre el 10% y el 20% con respecto a la información facilitada.
o "grupo de moléculas activas", también "principio activo", significa el hidrolizado peptídico extraído mediante el procedimiento de la invención a partir de la torta de semillas deMoringa peregrina.Este hidrolizado es responsable de las actividades biológicas descritas en esta invención.
o "agente activo" es una cantidad suficiente de un extracto según la invención para obtener las actividades biológicas descritas. Dependiendo de si el extracto es líquido o seco, concentrado o no, las cantidades de agente activo pueden variar en proporciones de 0,002 a 40% en peso en relación con el peso total de la composición.
o "signos de envejecimiento cutáneo": cualquier cambio en el aspecto externo de la piel y faneras debido al envejecimiento como, por ejemplo, arrugas y líneas finas, piel flácida, piel flácida, adelgazamiento de la piel, falta de elasticidad y/o tono de la piel, piel apagada, sin brillo o manchas de pigmentación en la piel, decoloración del cabello o manchas en las uñas, pero también cualquier cambio interno de la piel que no se traduzca sistemáticamente en una alteración del aspecto externo como, por ejemplo, cualquier degradación interna de la piel tras la exposición a la radiación ultravioleta (UV).
El primer objeto de la invención se refiere a un extracto de la torta de semillas de Moringaperegrinaque comprende principalmente un hidrolizado peptídico que comprende derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular está comprendido entre 100 Da y 6.000 Da, preferentemente entre 1.500 Da y 5.000 Da, aún más preferentemente entre 3.000 y 4.500 Da, y en que se obtiene a partir de semillas maduras y no descascarilladas del fruto deMoringa peregrinapor proteólisis química a un pH superior a 13 durante un período aproximado de 2 horas a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C.
El hidrolizado peptídico, que comprende péptidos, oligopéptidos, glucopéptidos y aminoácidos, como en el perfil definido a continuación, nunca ha sido demostrado en un extracto de semillas del géneroMoringa peregrina.La especieMoringa peregrinacrece en climas muy áridos. Su capacidad para adaptarse a la sequía y reproducirse en condiciones extremófilas le ha permitido adquirir características únicas, que el Solicitante ha podido identificar mediante un procedimiento de extracción específico de la torta de semillas deMoringa peregrina.
En el contexto de la presente invención, la parte vegetal elegida es la torta de semillas deMoringa peregrina.Se sabe que las semillas deMoringa peregrinase utilizan para extraer su aceite, útil para el autoconsumo o en diversos tratamientos medicinales tradicionales. La torta obtenida tras el desaceitado de la semilla es un residuo que actualmente se utiliza sobre todo para la alimentación animal.
Según una realización preferente, el extracto según la invención se obtiene a partir de la torta de semillas deMoringa peregrinasin descascarillar.
Según una realización, el hidrolizado peptídico del extracto según la invención comprende derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glicopéptidos cuyo peso molecular está comprendido entre 100 Da y 6.000 Da, y más particularmente entre 1.500 Da y 5.000 Da, y aún más particularmente entre 3.000 Da y 4.500 Da.
Según otra realización, el extracto también comprende entre 0,3% a 3% de compuestos volátiles, de los cuales el 50% de estos compuestos, es decir, entre el 0,15% y el 1,5% del extracto según la invención, consiste en compuestos ligeros de nitrilo, principalmente isobutironitrilo y metilbutanonitrilo; entre el 5 y el 10% de estos compuestos, es decir, entre el 0,015 y el 0,3% del extracto según la invención, son derivados de isotiocianato, principalmente isotiocianato de isopropilo e isotiocianato de isobutilo; entre el 1 y el 5% de estos compuestos, es decir, entre el 0,003 y el 0,15% del extracto según la invención, son aceites esenciales, principalmente eucaliptol, mentol y benzaldehído.
El segundo objeto de la invención es un procedimiento para producir un extracto de torta de semillas deMoringa peregrinasegún la invención, que comprende las etapas siguientes:
a) se recogen las semillas sin descascarillar y recolectadas cuando están maduras del fruto de laMoringa peregrinay se secan hasta alcanzar un contenido de humedad interna inferior al 8%,
b) se prensan las semillas secas para separar el aceite del resto de la semilla con el fin de obtener una torta que contenga menos de un 6% en peso de aceite residual,
c) se tritura la torta obtenida en la etapa b),
d) la torta triturada obtenida en la etapa c) se dispersa en una fase acuosa,
e) la dispersión acuosa obtenida en la etapa d) se somete a proteólisis química durante un período aproximado de 2 horas, a un pH superior a 13 y a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C,
f) se neutraliza la proteólisis para estabilizar el hidrolizado peptídico obtenido,
g) el hidrolizado peptídico se recupera mediante separación sólido/líquido,
h) el hidrolizado peptídico se purifica por ultrafiltración y, a continuación, opcionalmente,
i) el hidrolizado peptídico obtenido en la etapa h) se liofiliza.
Las semillas no descascarilladas, es decir, que conservan la cáscara (pericarpio), se recolectan cuando el fruto está maduro y, preferentemente, cuando la vaina se encuentra en las primeras fases de dehiscencia.
Las semillas se secan para obtener un contenido de humedad interna inferior al 8% y preferentemente en torno al 6%; el secado se efectúa preferentemente en un bastidor ventilado y alejado de los rayos del sol, preferentemente bajo una sombra al aire libre.
A continuación, las semillas secas se trituran antes del prensado en frío, que separa mecánicamente el aceite del resto de la semilla comprimida, es decir, la torta.
A continuación, la torta se tritura mecánicamente utilizando cualquier tipo de trituradoras mecánicas, como martillos, mayales, cuchillos, sistemas de aplastamiento/ trituración, bolas o bolas de mortero, así como cualquier tipo de criomolienda.
La dispersión en la fase acuosa según la etapa d) y la proteólisis según la etapa e) se realizan ventajosamente siempre con agitación, lo que permite la dispersión y homogeneización del sólido en el líquido, mejorando así la superficie de intercambio global y, en consecuencia, la proteólisis.
Se obtiene un hidrolizado peptídico líquido con una densidad superior a 1 y preferentemente en torno a 1,1, que comprende un contenido en materia seca comprendido entre el 10 y el 15%, preferentemente en torno al 12,5%, que comprende entre el 1 y el 6% de compuestos nitrogenados, en particular derivados nitrílicos volátiles en una proporción del 0,5 al 1,5%, preferentemente en torno al 0,8%, y 20 mg/litro de polifenoles (0,0002%).
Según una realización preferente del procedimiento según la invención, la separación sólido/líquido de la etapa g) se lleva a cabo mediante diversos procedimientos como centrifugación, aireación y filtración.
Según otra realización preferente del procedimiento según la invención, la ultrafiltración en la etapa h) se efectúa con un corte entre 100 Da y 6.000 Da y más particularmente entre 1.500 Da y 5.000 Da, y aún más particularmente entre 3.000 Da y 4.500 Da.
En una realización según la invención, el procedimiento de obtención de un extracto de torta de semillas se obtiene a partir de la torta de semillas no descascarilladas por proteólisis, con agitación, en una proporción de como máximo el 25% en peso de materia sólida con relación al peso total utilizado en el disolvente acuoso, a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C durante un período de aproximadamente 2 horas.
En una realización del procedimiento de obtención del extracto líquido deMoringa peregrinaobtenido, el hidrolizado peptídico se purifica por destilación, microfiltración, ultrafiltración y/o nanofiltración para concentrar el extracto en compuestos de interés con respecto a los derivados nitrílicos volátiles también extraídos, Estas etapas de purificación permiten concentrar el conjunto de compuestos de interés a expensas de otros compuestos extraídos como se ha mencionado.
En otra realización del procedimiento de extracción según la invención, el extracto líquido obtenido se seca para obtener un extracto seco de la torta de semillas deMoringa peregrinaque contiene una cantidad de péptidos, oligopéptidos, glucopéptidos y aminoácidos o sus derivados nitrilos volátiles superior al 10%, preferentemente superior al 20%, aún más preferentemente superior al 30% y hasta aproximadamente el 40% (masa/masa) de la materia seca, preferentemente aún el 50% del peso de la materia seca.
Según una realización de la invención, el extracto líquido de torta de semillas deMoringa peregrinaobtenido se seca preferentemente, por ejemplo por atomización, liofilización o zeodración, para obtener un extracto sólido de semillas deMoringa peregrina,evaporándose el agua. El secado puede realizarse en presencia de un aditivo de soporte de secado como la maltodextrina, la ciclodextrina o la inulina, o en presencia de un soporte inorgánico como el filosilicato, el silicato de magnesio o el carbonato y sus sales.
La invención también se refiere al extracto de la torta de semillas deMoringa peregrinaobtenible por el procedimiento de extracción según la invención.
El tercer objeto de la invención es una composición cosmética o nutricosmética que comprende, como agente activo, una cantidad eficaz de un extracto de la torta de semillas deMoringa peregrinasegún la invención, y un excipiente fisiológicamente aceptable.
La composición según la invención puede formularse en forma de diversos preparados adecuados para la administración tópica o la administración oral.
Según una primera variante, las diversas preparaciones son adecuadas para la administración tópica e incluyen cremas, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, leches, ungüentos, lociones, aceites, bálsamos, soluciones acuosas o acuosas-alcohólicas o glicólicas, sueros, polvos, parches, aerosoles o cualquier otro producto de aplicación externa como, por ejemplo, dispositivos médicos o productos cosmetológicos-textiles.
Según una segunda variante, las distintas preparaciones son adecuadas para la administración oral; el extracto vegetal que comprende el hidrolizado peptídico puede utilizarse en una composición alimentaria o en un complemento alimenticio. El suplemento dietético puede adoptar la forma de cápsulas o cápsulas blandas de gelatina o vegetales a los efectos de la presente invención. Dicho complemento alimenticio puede entonces contener del 0,01 al 100% en peso del extracto vegetal.
En el contexto de un uso alimentario, nutricional o cosmético (cosmetoalimentario o nutricosmético), la composición se formulará ventajosamente en forma de un preparado adecuado para la administración oral. Puede no contener ningún excipiente y consistir enteramente en el extracto vegetal que contiene el hidrolizado peptídico en forma desecada.
Según una realización preferente, las composiciones según la invención están destinadas más particularmente a la administración tópica. Por lo tanto, estas composiciones deben contener un medio cosméticamente aceptable, es decir, compatible con la piel y las faneras, y abarcar todas las formas cosméticas. Estas composiciones pueden presentarse en forma de cremas, emulsiones de aceite en agua o agua en aceite o emulsiones múltiples, sueros, soluciones, suspensiones, geles, leches, lociones, barras o polvos, adecuados para su aplicación sobre la piel, los labios y/o las faneras. Estas composiciones incluyen los excipientes necesarios para su formulación, como disolventes, emolientes, espesantes, diluyentes, tensioactivos, antioxidantes, agentes bioactivos, colorantes, conservantes y fragancias. Pueden utilizarse como producto de cuidado de la piel y/o maquillaje.
La composición según la invención puede consistir en particular en una composición para el cuidado del cabello, y en particular un champú, un acondicionador, una loción de tratamiento, una crema o gel de peinado, una loción reestructurante del cabello, una mascarilla, etc. La composición cosmética según la invención puede utilizarse en particular en tratamientos que implican una aplicación que puede o no ir seguida de un aclarado, o en forma de champú. La composición según la invención puede utilizarse ventajosamente en el cuidado anticaspa. También puede adoptar la forma de un tinte o máscara que se aplica con un cepillo o peine, sobre todo en las pestañas, las cejas o el pelo.
Las composiciones según la invención comprenden también cualquier aditivo comúnmente utilizado en el campo de aplicación previsto, así como los adyuvantes necesarios para su formulación, tales como disolventes, espesantes, diluyentes, antioxidantes, colorantes, filtros solares, autobronceadores, pigmentos, cargas, conservantes, perfumes, absorbentes de olores, principios activos cosméticos o farmacéuticos, aceites esenciales, vitaminas, aromas, fragancias, etc., así como los adyuvantes necesarios para su formulación, filtros solares, autobronceadores, pigmentos, cargas, conservantes, perfumes, absorbentes de olores, principios activos cosméticos o farmacéuticos, aceites esenciales, vitaminas, ácidos grasos esenciales, tensioactivos, polímeros filmógenos, etc.
El Dictionary & Handbook INCI ("International Nomenclature of Cosmetic Ingrédients" (13a ed.), en su versión en inglés. 2010) publicado por The Personal Care Products Council Inc, Washington, D.C) describe una amplia variedad, sin limitación, de ingredientes cosméticos y farmacéuticos comúnmente utilizados en la industria del cuidado de la piel, que son adecuados para su uso como ingredientes adicionales en composiciones según la presente invención.
En todos los casos, el experto en la materia se asegurará de que estos adyuvantes y sus proporciones se elijan de manera que no perjudiquen las propiedades ventajosas buscadas de la composición según la invención.
Según una realización ventajosa de la invención, la cantidad o el contenido de extracto vegetal en la composición cosmética según la invención es de 0,002 a 20% en peso, y en particular de 0,01 a 10% en peso con relación al peso total de la composición.
Según otra realización ventajosa de la invención, la cantidad o el contenido de extracto vegetal en la composición nutricosmética según la invención es de 0,01 a 100% en peso con relación al peso total de la composición. Más preferentemente, la cantidad de extracto vegetal es de 0,02 a 40% en peso, y en particular de 0,2 a 20% en peso en relación con el peso total de la composición.
El cuarto objeto de la invención es la utilización cosmética o nutricosmética de una composición según la invención para mejorar el aspecto de la piel, de las mucosas o de las faneras, prevenir y/o combatir la sequedad de la piel y de las mucosas, prevenir y/o combatir los signos cutáneos de envejecimiento y/o fotoenvejecimiento, favorecer el blanqueamiento de la piel y favorecer el adelgazamiento.
Aunque la invención se ha descrito en relación con varias realizaciones particulares, es evidente que no se limita en modo alguno a las mismas y que incluye todos los equivalentes técnicos de los medios descritos, así como combinaciones de los mismos si entran dentro del ámbito de la invención.
El uso del verbo "contener", "comprender" o "incluir" y sus formas conjugadas no excluye la presencia de elementos o etapas distintos de los establecidos en una reivindicación.
empos
Ejemplo 1: Preparación de un extracto vegetal según la invención a partir de la torta de Moringa peregrinaSemillas deMoringa peregrina(Forssk.) semillas de Fiori obtenidas cuando el fruto está maduro se secaron hasta alcanzar un contenido de humedad interna inferior al 8%, preferiblemente en torno al 6%, y después se prensaron utilizando una prensa mecánica de tornillo para separar el aceite del resto de la semilla y obtener aceite de peregrina virgen (denominación INCI "aceite de semilla de Moringa peregrina") y una torta. A continuación, la torta se aísla en forma de filamentos precortados en trozos de 1 a 2 cm, a partir de los cuales se realiza la extracción. A continuación se indica la composición de las materias primas utilizadas en el procedimiento.
[Tabla 1]
Protocolo:
a) Se prepara una solución concentrada 1 molar de un agente alcalino fuerte como, en particular, hidróxido sódico, hidróxido potásico o hidróxido cálcico, o de una mezcla acuosa que concentre 1 molar de agentes alcalinos fuertes, pero preferentemente hidróxido sódico; esta solución alcalina fuerte tiene un pH superior a 13, b) Se pesa en una proporción [1: 10] (masa/masa) de torta deperegrinaprecortada en trozos de aproximadamente 1 cm en la solución alcalina,
c) se tritura la torta obtenida en la etapa b),
d) La torta triturada obtenida en la etapa c) se dispersa en la fase acuosa,
e) la dispersión acuosa obtenida en la etapa d) se somete a proteólisis química durante un periodo aproximado de 2 horas a una temperatura de 20°C,
f) la proteólisis se neutraliza para estabilizar el hidrolizado peptídico obtenido con un ácido débil para tamponar la solución en un intervalo de pH de 4,5-5,5,
g) el hidrolizado peptídico se recupera mediante separación sólido/líquido,
h) el hidrolizado peptídico se purifica por ultrafiltración.
Se obtiene un filtrado amarillo translúcido que contiene aproximadamente un 12,48% de materia seca. El extracto líquido obtenido se denominará en lo sucesivo"hidrolizado peptídico deperegrinasegún la invención" o "hidrolizado peptídico deperegrina". A continuación, este extracto líquido se utiliza para los ensayos de eficacia.
Este hidrolizado peptídico deperegrinasegún la invención tiene una gravedad específica superior a 1 y preferentemente alrededor de 1,1, que comprende un contenido de materia seca de entre 10 y 15%, preferentemente alrededor de 12,5%, que comprende entre 1 y 6% de compuestos que contienen nitrógeno, principalmente péptidos y glucopéptidos, y también derivados nitrílicos volátiles en una proporción de 0,5 a 1,5%, preferentemente alrededor de 0,8%, y 20 mg/litro de polifenoles (0,0002%). A continuación se indica la composición de compuestos volátiles en el hidrolizado deperegrinasegún la invención.
[Tabla 2]
El hidrolizado peptídico de Peregrina contiene isotiocianato de isopropilo e isotiocianato de isobutilo en niveles relativamente altos, lo que confirma publicaciones anteriores sobre la especie (KJAER et al. 1979, Isothiocyanates in Myrosinase-treated seed extracts of Moringa peregrina, Phytochemistry, 18, p. 1485-1487; AFSHARYPUOR et al, 2010, Volatile Constituents of the Seed Kernel and Leaf of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, Agricolt. Cultivada en Chabahar (Irán), Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6(2): 141-144; De Hs HAHRI S. et al., 2012, Determination of volatile glucosinate degradation products in seed coat, stem and in vitro cultures of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, ScienceOpen, Investigación en ciencias farmacéuticas 7(1): 51-56). Los isotiocianatos son compuestos producidos por diversas plantas pertenecientes al orden Brassicales, en particular en las familias Brassicaceae, Capparaceae, Caricaceae y Moringaceae, como sistema de defensa contra el ataque de patógenos. En el géneroMoringa,se han identificado en particular en M.oleíferayM. stenopetala(Baker f.) Cufold. (ABD RANI N.Z., KHARAINA, H. y KuMOLOSAS), E., 2018, Moringa genus: A review of Phytochemistry and Pharmacology, Fronteras de la Farmacología, vol. II. 9art. 108). Los isotiocianatos se producen por la hidrólisis de los glucosinolatos por la enzima mirosinasa cuando se dañan los tejidos vegetales. Se ha descrito que los isotiocianatos tienen diversos efectos biológicos, como la actividad antifúngica (TRONCOSO-ROJAS, R.Y TIZNADO-HERNANDEZ, M. E., 2007, Natural compounds to control fungal diseases in fruits & vegetables, en TRONCOSO-ROJAS, R., TIZNADO-HERNANDEZ, M. E., GONZALEZ-LEON, A. (éd) Recent advances in alternative postharvest technologies to control fungal diseases in fruits & vegetables. Editorial. Transworld Research Network, Kerala, India, pp 127 156; TRONCOSO-ROJAS, R. et al. 2005, Analysis of the isothiocyanates present in cabbage leaves extract and their potential application to control Alternaria rot in bell peppers, Food Research International 38:701-708), efectos antimicrobianos, anticancerígenos y antiinflamatorios (PARK, E.J. et al., 2011, Inhibition of lipopolysaccharide induced cyclooxygenase-2 expression and inducible nitric oxide synthase by 4-[(2-O-acetyl-a-L-rhamnosyloxy)benzyl]isothiocyanate from M. oleifera, Nutrition and Cancer 63(6): 971-982; RAJAN, T S. et al., 2016, Anticancer activity of glucomoringin isothiocyanate in human malignant astrocytoma cells, Fitoterapa 110:1-7; Padla E. P et al. 2012, Antimicrobial isothiocyanates from the seeds of Moringa oleifera Lam, Zeitschrift für Naturforschung C, 67, 557-564; WATERMAN, C. et al., 2014, Stable, water extractable isothiocyanates from Moringa oleifera leaves attenuate inflammation in vitro. Fitoquímica 103: 114-122). El furfural está presente en una concentración muy estándar, que se encuentra en este tipo de semillas y en muchos frutos secos. El disulfuro de carbono, el isobutironitrilo, el isobutirato de metilo, el butanenitrilo de metilo y el hexanenitrilo son compuestos volátiles derivados de los aminoácidos. Son marcadores de la degradación de las proteínas. Estos compuestos de degradación representan alrededor del 50% de los compuestos volátiles del extracto de torta hidrolizada deperegrina. Este resultado indica que el extracto se compone principalmente de proteínas o péptidos. Sólo se detectaron trazas muy pequeñas de grasas o azúcares libres en el extracto hidrolizado deMoringa peregrina, y los aceites esenciales representaron el 4% de los compuestos volátiles, con el mentol en torno al 1%, el eucaliptol al 1% y el benzaldehído en torno al 2%. En materia seca, el tampón citrato (que es un compuesto osídico) representa alrededor del 50% del resto e incluye compuestos glicosilados (osídicos) resultantes de la degradación por proteólisis de proteínas, oligopéptidos y aminoácidos. Por último, cabe destacar la presencia de unos 20 mg/litro de polifenoles (0,0002%) procedentes de las semillas deperegrina.El ácido benzoico no debe incluirse en la caracterización, ya que es un agente estabilizador que se añade al extracto. Este filtrado líquido constituye el extracto según la invención y se utiliza puro en los ensayos siguientes.
La materia seca del extracto descrito anteriormente se obtiene por un procedimiento gravimétrico basado en la masa antes y después de la evaporación presente en el extracto líquido. Esta masa seca se compone principalmente de proteínas y glicoproteínas parcialmente degradadas e hidrosolubles con un peso molecular de entre 100 y 6.000 Da, conocidas como oligopéptidos o glicoolipéptidos o hidrolizado peptídico según la invención, derivadas de la hidrólisis de la torta oleaginosa deMoringa peregrina.El extracto seco también incluye un tampón de citrato sódico que estabiliza estos oligopéptidos y glucopéptidos en un estado hidrolizado estático. Por último, este extracto se estabiliza microbiológicamente con un conservante hidrosoluble como el benzoato sódico.
Ejemplo 2: Efecto del hidrolizado peptídico de peregrina según la invención como antioxidante
El objetivo de este estudio fue evaluar la modulación de la actividad antioxidante por el hidrolizado peptídicoperegrinaen un modelo colorimétricoin vitrolibre de células utilizando el radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) y el antioxidante de referencia, el ácido ascórbico. El procedimiento utilizado se conoce como inhibición. Se basa en la degradación del radical oxidante DPPH, de color violeta y que absorbe a 540 nm, por un antioxidante de referencia, el ácido ascórbico. Esta reacción sirve de control positivo y conduce a la formación del compuesto DPPH, que es incoloro o incluso amarillo pálido. El hidrolizado peptídico de deperegrinasegún la invención y el producto de referencia "ácido ascórbico" se ponen en contacto con la solución de DPPH durante 30 minutos a 40°C. A continuación, se evalúa la actividad antioxidante midiendo la absorbancia a 540 nm. La modulación de esta actividad se expresa en porcentaje de estimulación de la actividad antioxidante por el principio activo ensayado, con referencia a la actividad antioxidante máxima obtenida en presencia de ácido ascórbico(T+). Protocolo: Se incuba una solución de DPPH durante 30 minutos a 40°C, en ausencia (control), en presencia del hidrolizado peptídico deperegrinasegún la invención^) y a concentraciones decrecientes de la muestra a ensayar. Al final del período de incubación, la actividad antioxidante en presencia del producto de referencia y en presencia o ausencia del hidrolizado peptídico de deperegrinase reveló mediante tinción después de 30 minutos a 40°C. También se evaluó midiendo la absorbancia del medio de reacción a 540 nm. Para cada concentración ensayada, la modulación de la actividad antioxidante por el producto ensayado se calcula según la fórmula siguiente.
[Ec. 1] Porcentaje de modulación de la actividad antioxidante = 100 x [(DO540 Control - DO540 Producto a ensayar)/ DO<s>4<d>Producto de referencia].
Si el resultado es negativo, el producto de ensayo se considerará oxidante; si el resultado es positivo, el porcentaje se expresará como estimulación de la actividad antirradicales libres. A continuación se presentan los resultados obtenidos de la inhibición del DPPH por el hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención.
[Tabla 3]
Conclusión: El hidrolizado peptídico dePeregrinasegún la invención es capaz de proteger contra los radicales libres, y tiene propiedades antioxidantes significativas a partir de una concentración del 1%.
Ejemplo 3: Efecto del extracto deperegrinasegún la invención como inhibidor de metaloproteasas
El objetivo de este estudio es evaluar la modulación de la actividad anti-metalloproteasa por el hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención en un modeloin vitrolibre de células utilizando una colagenasa de tipo I y una hialuronidasa, un complejo sustrato y un cromóforo, Ninhidrina. Una solución tamponada de colagenasa de tipo I e hialuronidasa reacciona con un complejo de sustrato específico y lo transforma para formar un compuesto capaz de activar un cromóforo mediante incubación a 80°C durante 15 minutos. La actividad de la colagenasa y la hialuronidasa puede evaluarse midiendo la absorbancia a 565 nm. La muestra se pone en contacto con la solución de colagenasa e hialuronidasa junto con el complejo de sustrato enzimático a 37°C durante 5 minutos. El sustrato transformado por las enzimas es capaz de activar el cromóforo mediante incubación a 80°C durante 15 minutos. A continuación, se evalúa la actividad de la colagenasa y la hialuronidasa en presencia/ausencia de la muestra midiendo la absorbancia a 565 nm. La modulación de esta actividad se expresa como porcentaje de inhibición o activación de la actividad de la colagenasa y la hialuronidasa en ausencia de principio activo, es decir, sólo en presencia del sustrato enzimático.
Protocolo: Una solución de las enzimas Colagenasa tipo I e Hialuronidasa se incuba en su sustrato, durante 5 minutos, en ausencia o presencia del extracto deperegrinasegún la invención ensayada. A continuación, las soluciones se pusieron en contacto con el cromógeno Ninhidrina, antes de incubarlas durante 15 minutos a 80°C. Al final del período de incubación, se evaluó la actividad de las enzimas colagenasa e hialuronidasa con y sin el producto de ensayo o de referencia midiendo la absorbancia de los medios de reacción a 565 nm. Para cada concentración ensayada, la modulación de la actividad enzimática de la colagenasa y la hialuronidasa por el producto de ensayo se calcula según la fórmula siguiente.
[Ec. 2] Porcentaje de modulación de la actividad de la enzima Colagenasa/ Hialuronidasa = 100 x [(DO producto de ensayo o de referencia - DO Colagenasa/Hialuronidasa solo)/DO Colagenasa/Hialuronidasa solo],
Si el resultado es negativo, el porcentaje se expresa como inhibición enzimática; si el resultado es positivo, el porcentaje se expresa como activación enzimática. A continuación se muestran los resultados de la inhibición de metaloproteasas.
[Tabla 4]
Conclusión: El hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención genera una fuerte inhibición de las Metaloproteasas (Colagenasa / Hialuronidasa). Es capaz de inhibir completamente estas metaloproteasas a partir de una concentración del 0,5%, y tiene el potencial de proteger la matriz extracelular de la piel con gran eficacia. Esta inhibición también tiene un efecto antienvejecimiento.
A continuación se presentan ensayos comparativos con el extracto obtenido según la patente FR2946879 de Pierre Fabre cuyos resultados, utilizando el mismo ensayo simplemente con colagenasa, son los siguientes:
[Tabla 5]
Conclusión: el extracto según la patente de Pierre Fabre muestra una ligera acción inhibidora sobre la actividad de la colagenasa en dependencia inversa de la dosis con un pico de inhibición del 42% todas las concentraciones combinadas en comparación con un pico de inhibición del 100% para el hidrolizado peptídico según la invención. La actividad antienvejecimiento sobre este parámetro parece ser diferente y nueva en comparación con los efectos observados con el extracto según la patente de Pierre Fabre.
Ejemplo 4: Efecto del hidrolizado peptídico de peregrina según la invención para inhibir las enzimas Histona Deacetilasas (HDACs) y Sirtuina I
El objetivo de este estudio es demostrar la actividad inhibidora del hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención sobre las enzimas HDACs y Sirtuina I. Una solución tamponada de HDACs & Sirtuin I reacciona con un sustrato durante 20 minutos a 37°C y lo transforma para formar un compuesto que se colorea en presencia de un revelador tras incubación a 37°C durante 10 minutos. La actividad máxima de desacetilación de las Sirtuinas puede así evaluarse midiendo la absorbancia a 405 nm. El extracto deperegrinasegún la invención o el producto de referencia "Inhibidor de tricostatina A (STA) 1|<j>M" se ponen en contacto con la solución de Sirtuina al mismo tiempo que el sustrato enzimático durante 20 minutos a 37°C. El sustrato transformado por la enzima se colorea añadiendo un revelador. A continuación, se evaluó la actividad desacetiladora de las HDAC y la Sirtuina I en presencia del agente activo midiendo la absorbancia a 405 nm. La modulación de esta actividad se expresa como porcentaje de inhibición o activación de la actividad máxima de las HDACs & Sirtuin I en ausencia de principio activo, es decir, sólo en presencia del sustrato para las enzimas HDACs & Sirtuin I.
Protocolo: Se incuba una solución de enzimas sirtuinas en su sustrato durante 20 minutos en ausencia (control) o presencia del producto de referencia, o concentraciones crecientes de los productos de ensayo. El hidrolizado peptídico deperegrinasegún la invención se ensaya a las siguientes concentraciones: 2%; 1%; 0,1% (VN). Al final del período de incubación, la actividad de las enzimas sirtuinas con y sin el producto de ensayo o de referencia se reveló mediante tinción con una solución reveladora (10 min a 37°C) y se evaluó midiendo la absorbancia de los medios de reacción a 405 nm. Para cada concentración ensayada, la modulación de la actividad desacetilante de las enzimas Histona Desacetilasa y Sirtuina I por el producto de ensayo se calcula según la fórmula siguiente.
[Ec. 3] Porcentaje de modulación de la actividad de las enzimas Sirtuinas = 100 x [(DOíosproducto de ensayo o de referencia) - (DCUos HDACs&Sirtuinas I soias)]/D04os
Sirtuinas solas.
Si el resultado es negativo, el porcentaje se expresa como inhibición de la reacción enzimática; si el resultado es positivo, el porcentaje se expresa como activación de la reacción enzimática. A continuación se muestran los resultados de la inhibición de las enzimas histonas desacetilasas (HDAC).
[Tabla 6]
Conclusión: Un hidrolizado peptídico dePeregrinaal 2% según la invención muestra una inhibición significativa de las HDAC; esta inhibición significa la capacidad de promover la autoprotección de las células de la piel contra la deriva genética, particularmente ligada al procedimiento de envejecimiento. Así pues, el extracto parece ser útil contra uno de los trastornos genéticos más frecuentes en la superficie de la piel, la fibrosis, que se manifiesta con la aparición de un "grano" de carne (protuberancia fibrótica). Ventajosamente, el extracto puede interferir con los fenómenos de fibrosis en la superficie de la piel, previniendo así el envejecimiento cutáneo.
Ejemplo 5: Efecto tensor del hidrolizado peptídico de peregrina según la invención.
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto tensor del hidrolizado peptídico activo peregrina en un modeloin vitrolibre de células de discos de colágeno liofilizados. Se utilizaron discos de colágeno liofilizados de 8 mm de diámetro. La contracción de estos discos en respuesta a los distintos tratamientos se midió mediante análisis de imágenes. Cuanto menor sea la superficie de los discos de colágeno, mayor será el efecto tensor de los principios activos. El producto de referencia utilizado en este estudio fue la seroalbúmina bovina 100 mg/ml.
Protocolo: Se empaparon discos de colágeno de 8 mm de diámetro con 40 μl de agua ultrapura (control), el producto de referencia o concentraciones crecientes del hidrolizado peptídico deperegrinasegún la invención: 0.05; 0,1 y 0,5% (v/v). El hidrolizado peptídico deperegrinase solubilizó directamente en agua ultrapura. Se tomaron imágenes digitales de cada disco utilizando un escáner, antes y 30 minutos después de la imbibición. La superficie de los discos de colágeno se midió en las imágenes utilizando un software de análisis de imágenes. A continuación se muestran los resultados del efecto tensor.
[Tabla 7]
Conclusión: El hidrolizado peptídico de peregrina según la invención muestra un efecto tensor muy significativo a baja concentración (menos del 1%). Estos resultados demuestran un efecto "lifting" y, por tanto, un efecto antienvejecimiento a corto plazo.
Los ejemplos 2 a 5 demuestran que el hidrolizado peptídico deperegrinasegún la invención tiene el perfil de un buen activo antienvejecimiento, a corto o largo plazo.
Ejemplo 6: Efecto del hidrolizado peptídico de peregrina según la invención en la inhibición de la acción de la endotelina-1
En los últimos años se ha informado de que la endotelina promueve un aumento de la concentración de calcio intracelular en los melanocitos epidérmicos (células de melanina) para facilitar el crecimiento celular a través del sistema de transducción de señales intracelulares. Esta acción mejora la actividad de la tirosinasa, enzima que determina la velocidad de síntesis de la melanina (KADONO, S. et al., 2001, The Role of the Epidermal Endothelin Cascade in the Hyperpigmentation Mechanism of Lentigo Senilis, Journal of Investigative Dermatology, 116(4): 571 577). También se ha informado (KAWAHARA N. et al., 2005, About the Component of Snow Tea, Collection of Pharmaceutical, Society of Japan annual convention Subject matter, abstract 30-0823, p. 159) que la endotelina es un factor activador de los melanocitos producido por los queratinocitos epidérmicos, así como un factor importante en la pigmentación inducida por la luz ultravioleta o la mancha oscura senil (Pang, Y., Geng, J., Oin, Y. et al. La endotelina-1 aumenta la síntesis de melanina en un cultivo establecido de melanocitos de piel de oveja. Biología celular y del desarrollo in vitro - Animal 52, 749-756 (2016) o HACHIYA, AKIRA et al. Caracterización Bioquímica de la Enzima Convertidora de Endotelina-1a en Células Cultivadas Derivadas de la Piel y su Postulado Papel en la Estimulación de la Melanogénesis en la Epidermis Humana. Journal of Biological Chemistry, Volumen 277, Número 7, 5395 - 540). Estas acciones biológicas de la endotelina sugieren que los ingredientes activos capaces de inhibir la acción de la endotelina pueden ser útiles para reducir o prevenir la producción de melanina o la pigmentación.
La endotelina es el vasoconstrictor más potente conocido en el cuerpo humano. Por otra parte, también se sabe que la reducción de la endotelina tiene un efecto vasodilatador (HIRATA, Y et al., 1988, Cellular mechanism of action by a novel vasoconstrictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 154(3): 868-875; SHALINKUMAR P et al., 2008, H2S Mediates the Vasodilator Effect of Endothelin-1 in the Cerebral Circulation. Revista Americana de Fisiología. Fisiología Cardiocirculatoria, 315, p. 1759 1764).
El objetivo es ensayar la endotelina de tipo 1 en células endoteliales microvasculares humanas tras la exposición durante 24 horas al hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención.
Protocolo: Las células endoteliales microvasculares humanas fueron suministradas por PELOBiotech y cultivadas en placas de 96 pocillos según los procedimientos de producción del proveedor. Se dejó que los extractos actuaran a diferentes concentraciones sobre las células endoteliales al 80% de confluencia durante 24 horas y, a continuación, se cuantificó la endotelina-1 utilizando el kit ELISA PicoKine (EDN1) en los sobrenadantes celulares. Se realiza previamente un ensayo de viabilidad para definir las dosis no tóxicas que se utilizarán para el ensayo de endotelina-1. El control negativo se realiza utilizando células en medio de cultivo sin tratamiento. El control positivo en el ensayo de viabilidad es 0,5% SDS. Todas las condiciones se prepararon en medios de cultivo y las células se incubaron a 36,5°C / 5% CO2 durante 24 horas.
a) Aplicación de soluciones de ensayo en las células endoteliales:
Los productos a ensayar se ponen en contacto con las células endoteliales en subconfluencia en placas de 96 pocillos. Para cada concentración, el ensayo se realiza en 3 pocillos. Las placas se incubaron durante 24 horas ± 1 hora a 36,5°C / 5% CO2.
b) Ensayo de viabilidad:
La viabilidad celular se evaluó mediante el procedimiento MTT en las células tras la incubación con los productos. Tras 24 horas de incubación, se recuperan los sobrenadantes y se almacenan a -20°C para las dosificaciones. A continuación, los pocillos se enjuagaron 1 vez con 200j lde PBS. Añadir 50jLde solución de MTT 0,5 mg/ml a cada pocillo e incubar durante 3 horas a 36,5°C / 5% CO2. Añadir 100 μl de isopropanol a cada pocillo. Tras la homogeneización, se lee la absorbancia a 550 nm. Para cada condición, la relación entre la densidad óptica media de las células y la densidad óptica media de los controles negativos determinará el índice de viabilidad.
c) Dosificación de la endotelina-1:
La dosificación se realiza con el kit ELISA. A continuación se muestran los resultados de la inhibición de la acción de la endotelina.
[Tabla 8]
Conclusión: El ensayo de viabilidad realizada al final del tratamiento no mostró ningún efecto tóxico para las concentraciones probadas.
La endotelina-1 se dosifica en los sobrenadantes celulares a concentraciones no tóxicas. La cantidad de endotelina-1 en cada condición se determinó utilizando el kit ELISA.
Para las células de control negativo, los valores son del orden de 134,94 μg/ml. Para las células tratadas con diferentes concentraciones de extractos, los valores oscilaron entre 87,85 μg/ml (con un 2% del extracto según la invención) y 118,15 μg/ml (con un 0,1% del extracto según la invención), mostrando una inhibición muy significativa a partir del 0,1% del extracto según la invención con aproximadamente un 12,44% de inhibición de la producción de endotelina de tipo 1 y hasta un 34,90% de inhibición con un 2% del extracto según la invención.
Los resultados sobre la endotelina y su inhibición específica dependiente de la dosis demuestran que el hidrolizado peptídico según la invención es un potente aclarador de la piel.
Ejemplo 7: Efecto del hidrolizado peptídico de peregrina según la invención para liberar ácidos grasos libres.
La lipólisis en los adipocitos, o la hidrólisis del triacilglicerol (TAG) para liberar ácidos grasos y glicerol para su uso por otros órganos, es una función única del tejido adiposo blanco. La lipólisis en los adipocitos se produce en la superficie de las gotas lipídicas citosólicas, que recientemente han atraído una gran atención como orgánulos dinámicos integrantes del metabolismo lipídico. La reciente identificación de AdPLA como la principal fosfolipasa adiposa A(2) ha llevado al descubrimiento de una regulación autocrina/paracrina dominante de la lipólisis por PGE (2). Los mecanismos mencionados son actores clave en la lipólisis y su regulación. Descubrimientos recientes vinculan la lipólisis a alteraciones o mutaciones genéticas y predicen la activación de la lipólisis en los adipocitos como una posible diana terapéutica (AHMADJAN M. et al, 2010, Lipolysis in Adipocytes, The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 42(5): 555-559).
El objetivo del estudio es evaluar la capacidad del hidrolizado peptídico según la invención para aumentar la liberación de glicerol en cultivo celular humano (adipocitos). El contenido de glicerol está correlacionado con la lipólisis. El aumento del contenido de glicerol implica un efecto lipolítico. El efecto cosmético adelgazante se combina con el efecto lipolítico.
Protocolo: Los adipocitos humanos se cultivan en placas de 24 y 12 pocillos según procedimientos internos. Las muestras a concentraciones definidas se dejan actuar sobre adipocitos confluentes durante 24 horas. Para evaluar la citotoxicidad y seleccionar las concentraciones para el ensayo de "efecto lipolítico" se realiza un ensayo preliminar de viabilidad m Tt a las 24 horas. Este "efecto lipolítico" se evalúa midiendo la dosis de glicerol en los sobrenadantes tras 24 horas de exposición a las muestras.
El control negativo se realiza utilizando células en medio de cultivo sin tratamiento. El control positivo para el ensayo de viabilidad es 0,5% SDS. El control positivo para el ensayo del efecto lipolítico es cafeína al 0,05%. Todas las condiciones se prepararon en medios de cultivo y las células se incubaron a 36,5°C / 5% CO2 durante 24 ± 1 horas.
• Aplicación de soluciones de ensayo a los adipocitos:
o Los productos de ensayo se pusieron en contacto con adipocitos confluentes en placas de 24 pocillos (ensayo de citotoxicidad) y de 12 pocillos (ensayo de efecto lipolítico).
o Para cada concentración, el ensayo se realiza en 3 pocillos.
o Las placas se incubaron durante 24 ± 1 horas a 36,5°C / 5% CO2.
• Ensayo de viabilidad:
o La viabilidad celular se evaluó mediante el procedimiento MTT en células tras 24 horas de incubación con los productos.
o Tras 24 horas de incubación, los pocillos se enjuagaron 1 vez con 200|<j>L de PBS.
o Añadir 300 j l de solución de MTT 0,5 mg/ml a cada pocillo e incubar durante 3 horas a 36,5°C / 5% CO2.
o Se añadieron 800 j l de isopropanol a cada pocillo.
o Tras la homogeneización, se lee la absorbancia a 550 nm.
o Para cada condición, la relación entre la densidad óptica media de las células y la densidad óptica media de los controles negativos determinará el índice de viabilidad.
o Se utiliza un valor umbral de viabilidad del 70% comparado con el valor del control negativo para clasificar las sustancias ensayadas como citotóxicas o no citotóxicas.
• Ensayo del "efecto lipolítico":
o El efecto lipolítico se evaluó midiendo la dosis de glicerol en los medios de cultivo tras 24 ± 1 horas de incubación con los productos.
o Los medios de cultivo se mezclan con reactivo de glicerol libre según el protocolo del proveedor. o La solución de glicerol se utiliza para hacer la gama estándar en concentraciones de 0 a 6250 jM. o La lectura de la DO se realiza a 550 nm. A continuación se presentan los resultados de la liberación de ácidos grasos libres.
[Tabla 9]
Conclusión: Se ha demostrado que el hidrolizado peptídico según la invención promueve la liberación de glicerol de los adipocitos humanos, induciendo así un efecto adelgazante.
Ejemplo 8: Efecto del extracto de peregrina según la invención para estimular la proteína ZAG
La alfa-2-glicoproteína de zinc (ZAG) es una glicoproteína plasmática que toma su nombre de su movilidad electroforética y de su capacidad de ser precipitada por sales de Zn. La ZAG pertenece a la superfamilia de genes de las inmunoglobulinas y tiene una estructura tridimensional muy homóloga a las moléculas MHC de clase I y II. La ZAG se detectó inmunohistoquímicamente en células epiteliales secretoras normales de mama, próstata e hígado, en glándulas salivales, bronquiales, gastrointestinales y sudoríparas y en epitelios estratificados normales, incluida la epidermis. El ARNm de zAg permanece uniformemente distribuido en diferentes tipos celulares [Za7]. Como resultado de su producción por el epitelio secretor, la ZAG está presente en la mayoría de las secreciones corporales, constituyendo el 2,5% de las proteínas de la saliva y el 30% de los fluidos seminales.
Las funciones estándar de ZAG no están claras. Sin embargo, la ZAG se ha aislado de la orina de pacientes humanos con cáncer y caquexia y puede funcionar como factor movilizador de lípidos. La ZAG purificada extraída del suero humano o de ratón, o extraída de la orina humana de pacientes con cáncer, induce la lipólisis, lo que provoca la liberación de glicerol. También aumenta la utilización de lípidos en los adipocitos humanos y de ratón (HIRAI K. et al., 1998, Biological Evaluation of a Lipid-Mobilizing Factor Isolated from the Urine of Cancer Patients, Cancer Research, 58(11): 2359-2365). La ZAG activa la actividad de la adenilato ciclasa dependiente del guanosín trifosfato (GTP) en las membranas de los adipocitos, aumentando los niveles celulares de adenosín monofosfato cíclico (AMPc). Esto puede conducir potencialmente a la activación de múltiples vías celulares.
Para investigar más a fondo las propiedades biológicas de la ZAG, se crearon transfectantes estables de ZAG humana recombinante (rh) en la línea celular de melanoma murino B16F10. Se determinó el efecto de la transfección de ZAG sobre la producción de melaninain vitroein vivo.Por último, se determinó el efecto de la ZAG sobre la expresión y la actividad de la tirosinasa. En conjunto, estos estudios demuestran que la ZAG inhibe la producción de melanina en melanocitos normales y malignos. Los mecanismos incluyen efectos posttranscripcionales sobre la proteína tirosinasa, con la posibilidad de otros efectos indirectos. Estos estudios identificaron una función biológica de la ZAG desconocida hasta entonces e hicieron posible un procedimiento de modulación de la producción de melanina, previniendo y/o reduciendo así la pigmentación de la piel y el cabello debida al aumento de la producción de melanina (HALE L., Procedimiento de modulación de la producción de melanina, Patente de Estados Unidos n° US7.803.750 B2, 2010) y (GHADA F. M. et al, 2015, Highlights in Pathogenesis of Vitiligo, World Journal of Clinical Cases 3(3): 221-230).
El objetivo de este estudio es evaluar la capacidad del hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención para aumentar la liberación de ZAG en cultivo celular humano (queratinocitos). El contenido en ZAG se correlaciona con un efecto blanqueador, un efecto adelgazante, un efecto antifibrótico y un efecto calmante.
Protocolo: Los queratinocitos humanos normales se aíslan del prepucio y se cultivan en placas de 24 y 96 pocillos según procedimientos propios.
Esto implica dejar que las muestras actúen a concentraciones definidas en queratinocitos al 80% de confluencia durante 48 horas, y luego cuantificar las ZAG usando el kit ELISA en los sobrenadantes celulares.
Se realiza un ensayo preliminar de viabilidad para definir las dosis no tóxicas que se utilizarán al dosificar ZAG. El control negativo se realiza utilizando células en medio de cultivo sin tratamiento.
El control positivo para el ensayo de viabilidad es 0,5% SDS.
Todas las condiciones se preparan en medios de cultivo y las células se incuban a 36,5°C / 5% CO2 durante 24 horas para el ensayo de viabilidad y 48 horas para la dosificación de ZAG.
• Aplicación de soluciones de ensayo a los queratinocitos:
o Los productos a ensayar se ponen en contacto con queratinocitos en subconfluencia en placas de 24 y 96 pocillos.
o Para cada concentración, el ensayo se realiza en 3 pocillos.
o Las placas se incubaron durante 24 horas y 48 horas a 36,5°C / 5% CO2.
• Ensayo de viabilidad:
o La viabilidad celular se evaluó mediante el procedimiento MTT en las células tras la incubación con los productos.
o Tras 24 y 48 horas de incubación, los pocillos se enjuagaron 1 vez con 200 μl de PBS. o Añadir 50 μl de solución de MTT 0,5 mg/ml a cada pocillo e incubar durante 3 horas a 36,5°C / 5% CO2.
o Añadir 100 μl de isopropanol a cada pocillo.
o Tras la homogeneización, se lee la absorbancia a 550 nm.
o Para cada condición, la relación entre la densidad óptica media de las células y la densidad óptica media de los controles negativos determinará el índice de viabilidad.
• Dosificación de las proteínas ZAG:
o Tras 48 horas de incubación, se recogieron todos los sobrenadantes y se almacenaron a -20°C para las dosis.
o pruébala dosificación se realiza mediante un kit ELISA. A continuación se presentan los resultados de la dosificación de ZAG.
[Tabla 10]
Conclusión: El hidrolizado peptídico dePeregrinapuede aumentar significativamente la producción de ZAG, con buena dependencia de la dosis y baja toxicidad en células humanas. Tiene un efecto blanqueador, un efecto adelgazante, un efecto antifibrótico y un efecto calmante basado en su capacidad para aumentar significativamente la ZAG.
Ejemplo 9: Efecto del hidrolizado peptídico de peregrina según la invención para inhibir la producción de melanina
La pigmentación de la piel es un procedimiento complejo que, tanto en la epidermis como en los folículos pilosos, comienza con la síntesis de melanina en los melanosomas del interior de los melanocitos, seguida de la transferencia de los melanosomas a los queratinocitos circundantes, que a su vez transportan el pigmento y acaban degradándolo. En los seres humanos, toda la población de melanocitos se localiza en los folículos pilosos y en la capa basal de la epidermis. Sea cual sea su localización en la piel, los melanocitos tienen un origen embriológico común, la cresta neural, de la que derivan en forma de melanoblastos (células no pigmentadas). Existen dos tipos de melanina en las células epidérmicas: la eumelanina, un pigmento marrón-negro, y la feomelanina, un pigmento amarillo-rojo. En los melanocitos coexisten los eumelanosomas y los feomelanosomas. La tirosinasa es la enzima clave que regula las primeras etapas en la síntesis de la feomelanina y la eumelanina: la conversión de la L-tirosina en L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y la oxidación de este compuesto en dopaquinona. A partir de la dopaquinona, las vías de síntesis difieren para la eumelanina y la feomelanina. La principal función de la melanina es proteger la piel de los efectos nocivos de los rayos UV, previniendo así el desarrollo del cáncer de piel (BRENNER M. et al., 2008, The Protective Role of Melanin Against UV damage in human skin, Photochemistry and Photobiology 84(3): 539-549).
El objetivo es reunir todos los datos utilizados, así como los resultados obtenidos, para llevar a cabo el ensayo de modulación de la melanina en melanocitos humanos tras la exposición durante 5 días al extracto deperegrinasegún la invención.
Protocolo: Los melanocitos humanos se cultivan en placas de 96 y 24 pocillos.
El extracto deperegrinasegún la invención se deja actuar sobre melanocitos confluentes durante 5 días a concentraciones de 5%, 2%, 1% y 0,1%. Para evaluar la citotoxicidad y seleccionar las concentraciones para el ensayo de modulación de la melanina se utiliza un ensayo previo de viabilidad MTT a las 24 horas. Esta modulación se evalúa midiendo la dosis melanina en los lisados celulares tras 5 días de exposición a los extractos. El control negativo se realiza utilizando células en medio de cultivo sin tratamiento. El control positivo para el ensayo de viabilidad es 0,5% SDS. Para el ensayo de modulación de la melanina, se utilizan medios con y sina-MSHcomocontroles negativos.
Todas las condiciones se preparan en medios de cultivo y las células se incuban a 36,5°C / 5% CO2durante 24 horas para el ensayo de citotoxicidad y 5 días para la dosificación de melanina.
a) Aplicación de soluciones de ensayo a los melanocitos: Las concentraciones a ensayar se ponen en contacto con melanocitos confluentes en placas de 96 pocillos (ensayo de citotoxicidad) y de 24 pocillos (dosificación de melanina). Para cada concentración, el ensayo se realiza en 3 pocillos. Las placas se incubaron durante 24 ± 1 horas y 5 días a 36,5°C / 5% CO2.
b) Ensayo de viabilidad: La viabilidad celular se evaluó mediante el procedimiento MTT en células tras 24 horas de incubación con los productos. Tras 24 horas de incubación, los pocillos se lavaron una vez con 200 μl de PBS. Se añadieron 50 μl de solución de MTT 0,5 mg/ml a cada pocillo y se incubaron durante 3 horas a 36,5°C / 5% CO2. Se añadieron 150 μl de isopropanol a cada pocillo. Tras la homogeneización, se lee la absorbancia a 550 nm. Para cada condición, la relación entre la densidad óptica media de las células y la densidad óptica media de los controles negativos determinará el índice de viabilidad.
Se utiliza un valor umbral de viabilidad del 70% en relación con el valor del control negativo para clasificar las sustancias ensayadas como citotóxicas o no citotóxicas. Se da una clasificación "no citotóxica" a los resultadosin vitropara una viabilidad > 70% y una clasificación "citotóxica" para una viabilidad ≤ 70%.
La concentración al 5% del extracto según la invención fue citotóxica al 5% en las condiciones de ensayo. Por lo tanto, para el ensayo de modulación de la melanina se utilizan concentraciones del 2%, 1% y 0,1%. La cantidad de melanina presente en las células se mide tras la lisis celular. A continuación se muestran los resultados de la inhibición de la producción de melanina.
[Tabla 11]
Conclusión: El hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención inhibe la producción de melaninain cellulo,lo que le confiere un efecto despigmentante y una propiedad blanqueadora de la piel.
Ejemplo 10: Efecto del hidrolizado peptídico de peregrina según la invención sobre la modulación de la dosificación de DKK1 y DKK3
La implicación de las interacciones entre melanocitos y fibroblastos en la regulación de la melanogénesis es bien conocida y ha sido ampliamente estudiada. Aunque estas interacciones aún no se conocen del todo, son responsables de la "blancura" de las zonas palmoplantares y actualmente se utilizan en cosmética para el desarrollo de productos despigmentantes Yamaguchi y colegas (YAMAGUCHI Y. et al., 2004, Mesenchymal-Epithelial Interactions in the Skin: El aumento de la expresión de Dickkopf por los fibroblastos palmoplantares inhibe el crecimiento y la diferenciación de los melanocitos, Journal of Cell Biology 165(2): 275-285) han demostrado que un mensajero soluble producido por los fibroblastos de las regiones palmoplantares es capaz de modificar el programa de diferenciación de los melanocitos de estas regiones, lo que conduce a una reducción de la producción de melanina. Este mensajero fue identificado por el equipo como una proteína llamada Dikkopf-1 (DKK-1).
Las vías de señalización utilizadas por DKK-1 para producir estos resultados están ahora bien identificadas. Gracias a su acción antagonista sobre el receptor Wnt, el DKK-1 es capaz de "desviar" las vías de señalización intracelular activadas por la p-catenina, responsables en general de la regulación de los genes implicados en la melanogénesis. Yamaguchi y sus colegas también han demostrado que la DKK-3, una molécula cercana a la DKK-1 pero sin efecto sobre el receptor Wnt, podría desempeñar un papel regulador sobre el efecto de la DKK-1. De hecho, cuanto mayor es la cantidad de DKK-3 en las proximidades de este receptor Wnt, más débiles son las interacciones entre el DKK-1 y este receptor. El aumento de DKK3 reduce los efectos inhibidores de DKK-1 sobre la melanogénesis. Los trabajos de Yamaguchi y colaboradores (véasemás arriba)sugieren que la identificación de agentes que influyan en la relación DKK1 / DKK3 en cultivos de fibroblastos dérmicos humanos normales de origen no palmoplantar permitiría controlar la producción de melanina a partir de melanocitos humanos normales no palmoplantares
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del compuesto"hidrolizado peptídico dePeregrina" sobre la síntesis y liberación de DKK-1 en un modelo compuesto por fibroblastos humanos normales en cultivo monocapa.
Protocolo: Las células de fibroblastos humanos se obtienen de un donante de 68 años. Para realizar los experimentos, los fibroblastos se cultivan en monocapas hasta alcanzar la confluencia. La dexametasona a 100 nm se utilizó como inductor de referencia de la síntesis y liberación de DKK-1.
Los discos de piel se incubaron durante 48 horas en ausencia (control) o presencia del producto de referencia o del producto de ensayo: "Hidrolizado peptídico dePeregrina": 0,01; 0,1 y 0,5% (v/v).
Al final de la incubación, se retiraron los medios de incubación para medir la liberación de DKK-1.
El compuesto de ensayo"hidrolizado peptídico dePeregrina" se diluyó directamente en el medio de incubación para alcanzar las diferentes concentraciones descritas anteriormente.
Al final del periodo de incubación de 48 horas, se cuantificó la DKK-1 liberada en el medio de incubación utilizando un kit ELISA sensible y específico.
Al final del periodo de incubación, las proteínas contenidas en los lisados celulares se cuantificaron mediante un procedimiento espectrocolorimétrico (procedimiento de Bradford).
Los resultados se expresan como ng DKK-1 por mg de proteína (media ± D.S.).
El nivel de significación entre el "control" y el "producto de referencia" se evaluó mediante un ensayo t de Student (*: p <0,05).
El nivel de significación entre el "control" y el "producto de ensayo" se evaluó mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA unidireccional) seguido de un ensayo de Holm-Sidak (*: p <0,05).
En nuestras condiciones experimentales, el producto de referencia "Dexametasona", probado a 100 nm, aumentó significativamente el DKK-1 liberado en un 181,8% (p<0,01) en comparación con el "Control". A continuación se presentan los resultados sobre la modulación de la dosificación de DKK1.
[Tabla 12]
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de los compuestos denominados"hidrolizado peptídicoPeregrina" sobre la síntesis y liberación de DKK-3 en un modelo compuesto por fibroblastos humanos normales en cultivo monocapa.
Se obtuvieron células fibroblásticas humanas de un donante de 68 años.
Para realizar los experimentos, se cultivaron fibroblastos en monocapas hasta alcanzar la confluencia.
Se obtuvieron células fibroblásticas humanas de un donante de 68 años.
Para realizar los experimentos, se cultivaron fibroblastos en monocapas hasta alcanzar la confluencia.
Al final del periodo de incubación de 48 horas, se cuantificó la DKK-3 liberada en el medio de incubación utilizando un kit ELISA sensible y específico.
Al final del periodo de incubación, las proteínas contenidas en los lisados celulares se cuantificaron mediante un procedimiento espectrocolorimétrico (procedimiento de Bradford).
Los resultados se expresan como ng de DKK-3 por mg de proteína (media ± D.S.).
El nivel de significación entre el "control" y el "producto de referencia" se evaluó mediante un ensayo t de Student (*: p <0,05).
El nivel de significación entre el "control" y el "producto de ensayo" se evaluó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía) seguido de un ensayo de Holm-Sidak (*: p <0,05). A continuación se presentan los resultados sobre la modulación de la dosificación de DKK3.
[Tabla 13]
Conclusión: El hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención puede aumentar considerablemente la producción de DKK1, y tiende a reducir la producción de DKK3 en las células humanas. Tiene una gran capacidad para reducir la pigmentación de la piel gracias al principio de inhibición palmo-plantar, a través de su capacidad para aumentar considerablemente la DKK1 y reducir significativamente la DKK3, lo que aumenta la relación DKK1/DKK3. El aumento de esta proporción limita la vía de diferenciación pre-melanocitos/melanocitos, por lo que el número de melanocitos en funcionamiento disminuye con el tiempo, reduciendo la capacidad de coloración de la piel.
Ejemplo 11: Efecto del hidrolizado peptídico de peregrina según la invención para preservar el ADN
La dinámica de la longitud de los telómeros es muy importante para regular la vida útil replicativa en las células, particularmente en las especies longevas. El acortamiento de los telómeros y la actividad de la telomerasa son factores importantes en el envejecimiento y la tumorigénesis (SHAY, J. W., 2005, Senescence and Immortalization: Papel de los telómeros y la telomerasa, Carcinogénesis 26(5): 867-874). Los telómeros son secuencias complejas de nucleótidos que protegen los extremos de los cromosomas de la degradación, la fusión-recombinación no deseada y la activación inapropiada en respuesta a daños en el ADN. También desempeñan un papel esencial en la división celular y la estabilidad cromosómica. Cada vez hay más pruebas de que la estabilidad de los telómeros puede verse afectada por la exposición laboral y ambiental, ya que algunos de estos factores se han asociado a un aumento de la inflamación, el estrés oxidativo, el daño del ADN, la aberración cromosómica y las alteraciones epigenéticas. Los telómeros extremadamente cortos y largos se han asociado a enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares (ECV) y riesgo de cáncer.
La telomerasa es una ribonucleoproteína que cataliza la adición de repeticiones teloméricas a los extremos de los telómeros. Los telómeros son largos tramos de secuencias repetidas que cubren los extremos de los cromosomas y se cree que estabilizan el cromosoma. En los seres humanos, los telómeros suelen tener una longitud de entre 7 y 10 kb e incluyen varias repeticiones de la secuencia -TTAGGG-.
La telomerasa no se expresa en la mayoría de las células adultas y la longitud de los telómeros disminuye con los sucesivos ciclos de replicación. Tras un cierto número de ciclos de replicación, el acortamiento progresivo de los telómeros hace que las células entren en una fase de crisis telomérica, que a su vez conduce a la senescencia celular. Ciertas enfermedades se asocian a una rápida pérdida de telómeros, lo que conduce a una senescencia celular prematura. Se ha demostrado que la expresión del gen que codifica la proteína telomerasa humana en células humanas (BLASCO M., 2007, Telomere Length, Stem Cells and Aging, Nature Chemical Biology 3, p. 640 649) confiere un fenotipo inmortal, probablemente eludiendo la vía natural de senescencia de las células. Además, se ha demostrado que la expresión del gen de la telomerasa en células envejecidas con telómeros cortos produce un aumento de la longitud de los telómeros y restaura un fenotipo generalmente asociado a células más jóvenes. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del compuesto"hidrolizado peptídico dePeregrina" sobre el acortamiento de los telómeros en un modelo compuesto por fibroblastos humanos normales en cultivo monocapa. Es bien sabido que el telómero corresponde a un reloj biológico. La longitud de los telómeros disminuye gradualmente con la división celular, lo que acaba provocando la incapacidad de replicar la célula. La longitud de los telómeros se midió mediante PCR cuantitativa y se comparó con la longitud de los telómeros entre las células de los pasajes 2 y 5.
Protocolo: Se obtuvieron células de fibroblastos humanos de un donante de 44 años. Para realizar los experimentos, se utilizaron células en los pasajes 2 y 5. Se cultivaron fibroblastos durante 3 pases consecutivos en ausencia (control) o presencia de una concentración creciente a ensayar del hidrolizado peptídico deperegrina:0.01; 0,1 y 0,5% (v/v).
Preparación del compuesto de ensayo: El compuesto de ensayo"hidrolizado peptídico dePeregrina" se diluyó directamente en el medio de incubación para alcanzar las diferentes concentraciones descritas anteriormente.
Al final de la incubación, se tripsinizaron las células. El ADN se extrajo de las células utilizando un kit específico de extracción de ADN. El ADN se cuantificó mediante nanodrop.
La longitud de los telómeros se midió mediante PCR cuantitativa (q-PCR). Para cada muestra, la variación en la longitud de los telómeros se midió mediante cuantificación relativa utilizando el gen SCR (single copy reference) como gen de referencia. Para cada muestra, se realiza una q-PCR utilizando un conjunto de cebadores de telómeros que reconoce y amplifica las secuencias de telómeros y una segunda q-PCR utilizando el conjunto de cebadores SCR que reconoce y amplifica una región de 100 pb en el cromosoma 17 humano y sirve como referencia para la normalización de los datos.
Los resultados se expresan en unidades relativas correspondientes a la longitud de los telómeros en relación con las células en el pasaje 2 (media ± D.S.). El nivel de significación entre el "control" en los pasajes 2 y 5 se evaluó mediante un ensayo t de Student (*p <0,05). El nivel de significación entre el "control" y el "compuesto de ensayo" se evaluó independientemente para cada producto mediante un análisis de la varianza (ANOVA) de una vía seguido de un ensayo de Holm-Sidak (*: p <0,05).
Resultados: En nuestras condiciones experimentales, el hidrolizado peptídico deperegrinaprobado al 0,05%, 0,1% y 0,5% (v/v), redujo significativamente el acortamiento de los telómeros en fibroblastos humanos normales.
Acortamiento de los telómeros: inhibición (en comparación con el control) al 0,05% (v/v) 8,9% (p<0,05) y al 0,1% (v/v) 15,1% (p<0,01) y al 0,5% (v/v) 16,6% (p<0,01).
[Tabla 14]
Conclusión: En un contexto de multiplicación o división normal de las células humanas, el hidrolizado peptídicoperegrinasegún la invención demuestra una capacidad para aumentar considerablemente la longitud de los telómeros. Los telómeros son corchos que intervienen en la protección del material de ADN; el aumento del tamaño de los telómeros preserva la integridad del material de ADN a lo largo del tiempo. El aumento de la longitud de los telómeros está correlacionado con la capacidad de preservar el material de ADN. El hidrolizado peptídico dePeregrinapuede aumentar esta longitud, por lo que interviene en la conservación del material genético humano (ADN).
Ejemplo 12: Ensayos comparativos de diferentes productos sobre la hidratación de la superficie cutáneaEl estudio de corneometría se utiliza para medir el efecto hidratante de un producto en la superficie de la piel. El aparato utilizado es un corneómetro equipado con una sonda que mide la humedad de la piel mediante impedanciometría. Un grupo de 6 personas (2 hombres y 4 mujeres) probaron las superficies internas de sus antebrazos en condiciones hidrométricas y de temperatura similares. La cara interna del antebrazo izquierdo lleva las zonas 1 y 2, mientras que la cara interna del antebrazo derecho lleva las zonas 3 y 4.
La zona 1 corresponde a la zona de aplicación del gel hidratante de referencia; la zona 2 corresponde a la zona de aplicación del gel de referencia 2% del hidrolizado peptídico según la invención; la zona 3 corresponde a la zona de aplicación del gel de referencia 2% del hidrolizado peptídico conMoringa oleifera;la zona 4 corresponde a la zona de aplicación del gel de referencia 2% de Purisoft® según la patente FR3076460 de BASF Beauty Care Solutions.
La cantidad de producto aplicada a cada zona es la misma, y los tiempos de medición son los mismos para cada zona. Antes de aplicar el producto en cada zona, se realiza una lectura inicial para determinar el nivel cero de humedad de la piel. A continuación, para cada zona y cada producto, se realiza una primera medición 5 minutos después de la aplicación del producto en la zona, de nuevo por el mismo operario. El mismo operador realizó una última medición 30 minutos después de la segunda.
La combinación de las diferencias observadas antes y después de la aplicación no sigue una distribución normal estudiada en ANOVA (análisis de varianza). El valor obtenido de la diferencia entre las mediciones antes y después es, por tanto, el parámetro objeto de estudio. Los resultados obtenidos representan una tendencia cualitativa más que cuantitativa de los valores obtenidos:
[Tabla 15]
Conclusión: La zona 2 muestra un valor positivo de hidratación de la piel entre antes y después de la aplicación del producto que contiene el extracto según la invención, mientras que las zonas 3 y 4 que contienen extractos deMoringa oleíferasegún 2 procedimientos de extracción muestran valores negativos, es decir, la piel está menos hidratada después que antes de la aplicación de los productos. El hidrolizado peptídico según la invención permite mantener el beneficio de la hidratación en un producto de aplicación tópica, lo que distingue al hidrolizado peptídico de peregrina según la invención de los demás extractos probados. La figura 1 muestra los resultados obtenidos.
Ejemplo 13: Formulación de un producto de maquillaje
[Tabla 16]
empo : ormuac n e un pro uco e mpeza
[Tabla 17]
Ejemplo 15: formulación de un producto para el cuidado de la piel[Tabla 18]
Ejemplo 16: Comprimido relajante o adelgazante. 1 g: 2% de extracto seco según la invención (que contiene 60% de hidrolizado peptídico en un soporte de inulina) 47% de carbonato de calcio que contiene 200 UI de vitamina D 25% de gluconato de magnesio 23% de inulina 3% de estearato de magnesio).
Ejemplo 17: Polvo adelgazante en cápsulasde 750 mg que contienen 200 mg de cafeína, 200 mg de extracto seco según la invención (que contiene un 60% de hidrolizado peptídico en un soporte de inulina), 200 mg de quitosano y 150 mg de carbonato cálcico)
Ejemplo 18: Polvo supresor del apetito y adelgazante en cápsulasde 750 mg que contiene 200 mg de cafeína, 200 mg de extracto seco según la invención (que contiene un 60% de hidrolizado peptídico en un soporte de inulina), 200 mg de quitosano y 150 mg de konjac (glucomanano).
Ejemplo 19: Spray relajante sublingualque contiene un 2% del extracto según el ejemplo 1. 1% de tintura madre deRhodiola,1% de tintura madre de Melisa, 1% de tintura madre de Valeriana, 1% de tintura madre de Espino Blanco, 2% de extracto de cola de caballo, 0,15% de ácido salicílico, 7% de sorbitol y QSP en agua).
Ejemplo 20: Crema antiarrugas que contiene un 2% de extracto hidrolizado según el ejemplo 1
[Tabla 19]
Ejemplo 21: Ensayos toxicológicos del hidrolizado según la invención
Preparación del hidrolizado peptídico según el ejemplo 1: Semillas sin descascarillar deMoringa peregrina(Forssk.) Las semillas de fiori recolectadas cuando el fruto está maduro se secan hasta alcanzar un contenido de humedad interna inferior al 8%, preferiblemente en torno al 6%, y a continuación se prensan mediante una prensa mecánica de tornillo para separar el aceite del resto de la semilla y obtener aceite virgen y una torta. A continuación, la torta se aísla en forma de salchichas cortadas en trozos de 1 a 2 cm. Siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 1, obtenemos el extracto líquido que utilizamos puro en los ensayos siguientes.
1. Determinación de la actividad mutagénica en la cepa bacteriana Salmonella typhimurium (TA 100) - Ensayo de mutación inversa bacteriana
El ensayo se desarrolló en 3 fases principales:
• Se realiza un experimento preliminar para evaluar la citotoxicidad del elemento de ensayo y seleccionar el intervalo de dosis para los experimentos posteriores,
• Un experimento inicial de genotoxicidad (Ensayo 1), con y sin activación metabólica, con incorporación directa del sistema de ensayo y ensayo (o controles) en agar mínimo, en el intervalo de dosis definido por el estudio preliminar,
• Un segundo experimento (Ensayo 2), con preincubación del sistema de ensayo y del elemento de ensayo (o controles), con y sin activación metabólica, a niveles de dosis definidos por el responsable del estudio tras el análisis de los resultados del primer experimento. Este segundo experimento se llevó a cabo para confirmar o completar los resultados del primero, sobre todo cuando se obtuvieron resultados equívocos o negativos.
Se prepararon diluciones del extracto según el ejemplo 1 en agua para realizar el ensayo de citotoxicidad.
Esto se llevó a cabo en la cepa TA100 deSalmonella typhimuriuma concentraciones de 5.000, 1.600, 500, 160 y 50 μg/placa, con y sin S9-Mix.
[0170Los reactivos utilizados para la preparación de S9-Mix se prepararon de acuerdo con las siguientes instrucciones:
[Tabla 20]
Se expusieron bacterias al extracto de ensayo con y sin un sistema de activación metabólica. El sistema metabólico utilizado es una fracción postmitocondrial potenciada por cofactores (S9). Esta fracción S9, una fracción microsomal de homogeneizado de hígado de rata Sprague Dawley tratada con un inductor enzimático, se prepara según MARON, D.M. Y AMES, B.N. (1983) y fue suministrado por MOLTOX TM. Se almacena a una temperatura inferior a -70°C. La fracción microsomal S9 se utilizó a una concentración del 10% en S9-Mix. El protocolo aplicado fue el siguiente:
• Se llenaron 3 tubos de hemólisis con:
o dosificación sin activación metabólica:
■ 0,1 ml de las diferentes concentraciones de elementos de ensayo.
■ 0,5 ml de tampón fosfato estéril 0,2 M, pH 7,4,
■ 2 ml de agar superior para S.typhimurium,
■0.1 ml de inóculo bacteriano (TA100).
o dosificación con activación metabólica:
■ 0,1 ml de las diferentes concentraciones de elementos de ensayo,
■ 2 ml de agar superior para S.typhimurium,
■0,1 ml de inóculo bacteriano (TA100),
■ 0,5 ml de S9-Mix.
■ Mezclar y verter sobre la superficie del fondo de agar previamente distribuido en placas Petri.
■ Incubar a 37°C ± 2°C durante 48 a 72 horas.
Estas dosificaciones se realizaron para cada ensayo: ensayo de citotoxicidad preliminar, ensayo 1 y ensayo 2. El control no tratado, los controles negativos y los controles positivos producidos durante el procedimiento de preincubación se incubaron durante 20 a 30 minutos a 37°C ± 2°C antes de verter el agar superior.
El protocolo aplicado fue el siguiente:
• En 4 fracciones de 2 ml de agar top para S.typhimurium,introducir:
° 0.1 ml de tampón fosfato 0,2 M, pH 7,4,
° 0,1 ml de disolvente,
° 0,1 ml de S9-Mix.
° 0,1 ml del preparado del elemento que se va a analizar a la concentración más elevada,
• Se utiliza una fracción de 2 ml de la parte superior de agar para S.typhimuriumpara comprobar su esterilidad.
• Mezclar y verter sobre la superficie del fondo de agar previamente distribuido en placas Petri.
• Incubar a 37°C ± 2°C durante 48 a 72 horas.
• El ensayo se realiza por triplicado.
• No debe observarse crecimiento bacteriano.
Para al menos 5 concentraciones del extracto a ensayar, se realizó un ensayo sin activación metabólica y un ensayo con activación metabólica.
Expresión e interpretación de los resultados
Se pueden utilizar numerosos criterios para determinar si un resultado es positivo, en particular un aumento del número de revertidos correlacionado con la dosis del elemento a ensayar, o un aumento reproducible del número de revertidos a una o más concentraciones, con o sin activación metabólica.
• Se considera que el elemento de ensayo es mutagénico si, al final de las etapas de verificación, se ha obtenido de forma reproducible una relación dosis-respuesta en una o algunas de las 5 cepas con y/o sin activación metabólica. La mutagenicidad sólo se considera para una concentración dada cuando el número de revertidos es al menos dos veces la tasa de reversión espontánea para las cepas TA98, TA100 y TA102 (R > 2) y tres veces la tasa de reversión espontánea para las cepas TA1535 y TA1537 (R > 3).
• Se considera que el producto de ensayo no es mutagénico si, al final del ensayo 1 y del ensayo 2, la tasa de reversión ha permanecido siempre por debajo del doble de la tasa de reversión espontánea para todas las concentraciones del producto de ensayo.el doble de la tasa de reversión espontánea para todas las concentraciones del producto de ensayo ensayado, para las cepas TA98, TA100 y TA102 (R <2) y menos del triple de la tasa de reversión espontánea para las cepas TA1535 y TA1537 (R <3), con y sin activación metabólica, y siempre que siempre que se haya comprobado que la ausencia del efecto mutagénico no está relacionada con la toxicidad de las concentraciones ensayadas.
El estudio preliminar no mostró citotoxicidad del elemento de ensayo; por lo tanto, este rango de concentración se utilizó para el ensayo de genotoxicidad 1.
Basándose en el resultado obtenido para el ensayo 1, se decidió utilizar el mismo intervalo de dilución para el ensayo 2. Un análisis de los revertidos muestra que:
• No se observó ningún efecto citotóxico,
• Ninguna concentración del extracto de ensayo mostró un cociente R mayor o igual a por lo menos dos veces la tasa de reversión espontánea para TA98, TA100 y TA102 y tres veces la tasa de reversión espontánea para TA1535 y TA1537, con y sin activación metabólica,
• No se observó ninguna respuesta a la dosis, independientemente del sistema de ensayo o de las condiciones de ensayo.
A la vista de los resultados obtenidos durante este estudio, puede considerarse que el hidrolizado peptídico según el ejemplo 1 no presenta ninguna actividad mutagénica o pro-mutagénica.
2. Ensayo de fototoxicidadin vitro3T3 NRU
El principio del ensayo se basa en la comparación de la citotoxicidad del hidrolizado peptídico según el ejemplo 1 en presencia y ausencia de una dosis no citotóxica de UVA, en células cultivadas. La citotoxicidad se evalúa determinando la viabilidad celular mediante un colorante vital: rojo neutro, 24 horas después del tratamiento con los elementos de referencia y el extracto deM. peregrinasegún la invención, con o sin irradiación UVA. Las células utilizadas fueron fibroblastos de embrión de ratón de la línea Balb/c 3T3 clon 31 (ATCC - CCL163). El control positivo es una solución de clorpromazina ( NÚMERO CAS: 69-09-0). El control negativo es un diluyente de los extractos de ensayo y de referencia (solución salina tamponada /- 1% de disolvente). El hidrolizado peptídico se probó en 8 concentraciones en al menos cuatro pocillos de cultivo por concentración estudiada, en presencia o ausencia de UVA. Se tripsinizaron los fibroblastos y se sembraron dos placas de cultivo de 96 pocillos con 100 μl de una suspensión celular a 2105 células/ml (es decir, 2106 células por pocillo) en medio de cultivo completo.
Las placas sembradas se incubaron en el horno durante 24 horas a 37°C, 5% CO2. Al final de la incubación, se comprobó la semiconfluencia de la estera celular. Las diluciones se prepararon justo antes de aplicarlas a las células. Se midió el PH de la concentración más alta, que oscilaba entre 6,5 y 7,8. Se retiró el medio de cultivo y cada pocillo se enjuagó suavemente con 150 μl de PBS mantenido a temperatura ambiente antes de ser tratado con 100 μl de cada dilución del extracto o de referencia. Las placas de cultivo se incubaron en la oscuridad durante 1h ± 5 min a 37°C y 5% de COz. La irradiación se realizó con un irradiador solar BIO SUN (Vilber Lourmat RMX3W). BIO SUN es un sistema que controla la irradiación UV mediante un microprocesador programable. El sistema controla continuamente la emisión de luz ultravioleta. La irradiación se detiene automáticamente cuando la energía suministrada es igual a la energía programada. La irradiancia espectral del dispositivo sometido a ensayo se midió en la gama de longitudes de onda de 250 a 700 nanómetros utilizando un espectrorradiómetro calibrado.
Una de las 2 placas se irradió con la tapa puesta a temperatura ambiente, y la otra placa se protegió de los rayos UVA y se mantuvo a temperatura ambiente durante la irradiación. Tras la irradiación, se aspiró el medio de tratamiento y se enjuagaron las células. A continuación, se añadieron suavemente 100 μl de medio de cultivo completo y las placas se incubaron de 18 a 22 h a 37 °C y 5% de CO2. Al día siguiente, se evaluó la viabilidad celular (crecimiento, morfología, integridad de la monocapa) utilizando un microscopio de contraste de fases. Se retiró el medio de cultivo y cada pocillo se enjuagó y se mantuvo a temperatura ambiente antes de ser tratado con 100 μl de la solución de tinción. Las placas se volvieron a colocar en la incubadora durante 3 h en las mismas condiciones. Se retiró la solución de colorante y se enjuagaron las células; a continuación, se retiró la solución de enjuague y se añadieron 150 μl de solución de desorción a cada pocillo. Las placas se agitaron hasta la completa solubilización de los cristales. Las absorbancias se midieron a 450 nm.
Validación del ensayo:
La sensibilidad de las células a los rayos UVA se comprueba aproximadamente cada 10 pasajes, evaluando su viabilidad tras la exposición a dosis crecientes de irradiación. Las células se cultivan a la densidad utilizada en el ensayo. Se irradiaron al día siguiente con dosis de 2,5 y 9 J/cm2 y se determinó la viabilidad celular un día después mediante el ensayo NRU. Las células cumplen los criterios de calidad si su viabilidad tras la irradiación a 5 J/cm2 UVA es superior o igual al 80% de la viabilidad de los controles oscuros; a la dosis más alta de 9J/cm2 UVA, la viabilidad debe ser al menos del 50% de la de los controles oscuros.
Resultados:
El control negativo tiene una absorbancia mayor o igual a 0,4. La clorpromazina, el control positivo, tenía uncl50 entre 0,1 y 2 μg/ml en presencia de UVA y entre 7 y 90 μg/ml en ausencia de UVA. Estos resultados validan el ensayo. No se puede estimar la concentración de hidrolizado peptídico de torta deperegrinaque provoca la muerte del 50% de las células en presencia o ausencia de UVA. La mortalidad nunca alcanzó el 50%. No se puede estimar la concentración de hidrolizado peptídico de torta de peregrina que proporciona un 50% de viabilidad celular en presencia o ausencia de UVA. La viabilidad es siempre superior al 50%.
Conclusión: En las condiciones experimentales adoptadas, el hidrolizado peptídico de la torta oleaginosade peregrinapuede considerarse no fototóxico.
3. Evaluación del potencial irritante ocular mediante un estudio de citotoxicidadin vitroutilizando el procedimiento de liberación del rojo neutro en la línea celular SIRC
Este estudio in vitro se basa en la evaluación de la citotoxicidad del hidrolizado peptídico de tortas oleaginosas deperegrinamediante la determinación de la concentración que causa el 50% de muerte celular(Cl50) en una monocapa celular utilizando la técnica de liberación de rojo neutro. Las células utilizadas fueron fibroblastos de córnea de conejo SIRC libres de micoplasma (ATCC - CCL60).
El hidrolizado peptídico se diluyó en solución salina al 25% y al 50%. Se tripsinizaron los fibroblastos y se sembraron dos placas de cultivo de 24 pocillos con 1 ml de una suspensión celular a 2105 células/ml en medio de cultivo completo. Las placas sembradas se incubaron durante la noche a 37 °C y 5% de CO2. Al final de la incubación, se comprobó la confluencia de la alfombra celular. La solución de tinción se preparó a 0,5 mg/ml en medio de cultivo completo. Se retiró el medio de cultivo y se añadió 1 ml de la solución colorante a cada pocillo. Las placas se volvieron a colocar en la incubadora a 37°C y 5% de CO2durante 3h /- 15 minutos. Tras este tiempo de contacto, se retiró la solución colorante y se sustituyó por 1 ml de medio de cultivo completo por pocillo. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para estabilizar el sistema antes del contacto con el extracto o la referencia. Cada pocillo se enjuagó con 2 ml de PBS, se mantuvo a temperatura ambiente y, a continuación, se depositaron 500 μl de cada dilución de hidrolizado peptídico o de referencia en contacto con el tapete celular. El tiempo de contacto fue de 60 segundos (30 segundos para el control positivo). El tratamiento se realizó pocillo por pocillo, activándose el temporizador cuando se depositaba el hidrolizado peptídico o de referencia. La placa se agitó manualmente durante todo el tratamiento. Tras 55 segundos (o 25 segundos para el control positivo), se aspiró la dilución. A los 60 o 30 segundos exactos, se realizaron 5 enjuagues sucesivos (5 * 2 ml de PBS mantenidos a temperatura ambiente). Se aspiró el sobrenadante después de cada aclarado y, tras el último aclarado, se dejaron los pocillos sin medio hasta la fase de revelación. Tras el tratamiento completo de la placa de cultivo, se añadió 1 ml de la solución de desorción a cada pocillo. Se agita la placa durante unos 15 minutos hasta obtener un color uniforme. Se tomaron las soluciones obtenidas para cada pocillo de cultivo y se distribuyeron en 2 pocillos de una placa de 96 pocillos, es decir, 150 μl/pocillo.
Resultados:
Se evaluó que la concentración de hidrolizado peptídico que daba un 50% de muerte celular era >50%. El porcentaje de muerte celular al 50% de hidrolizado peptídico de se evaluó en un 17%.
Conclusión: En las condiciones experimentales adoptadas, la citotoxicidad del hidrolizado peptídico de la torta deperegrinapuede calificarse de insignificante.
4. Evaluación de la compatibilidad cutánea de un hidrolizado peptídico tras su aplicación única bajo vendaje oclusivo durante 48 horas bajo control dermatológico.
El objetivo de este estudio es evaluar el grado de compatibilidad cutánea del hidrolizado peptídico mediante un ensayo de parche, realizada en la superficie anterolateral del brazo durante 48 horas; y, en general, evaluar la capacidad del hidrolizado peptídico para mantener la piel en buen estado. se incluyeron en el estudio 10 voluntarios sanos, de ambos sexos, con edades comprendidas entre los 18 y los 65 años, sin piel seca ni sensible y sin lesiones dermatológicas en la zona de tratamiento. La compatibilidad cutánea del hidrolizado peptídico, preparado en forma de loción con un 5% del extracto deperegrinasegún el ejemplo 1 y un 95% de una mezcla de Propanediol/Sorbitol, se evaluó 48 horas después de la aplicación inicial, entre 30 y 40 minutos después de retirar el apósito. Las reacciones cutáneas (eritema y edema) se contaron de 0 a 3 utilizando las siguientes escalas:
[Tabla 21]
Cualquier otra reacción cutánea (bullas, pápulas, vesículas, sequedad, descamación, aspereza, efecto jabón...) se evaluó según la siguiente escala y se comunicó de forma descriptiva:
• 0: sin reacción,
• 0.5: muy ligero
• 1: ligero
• 2: moderado
• 3: importante.
Al final del estudio, se calculó un índice medio de irritación (I.M.I.) según la fórmula siguiente:
[Ec. 4]
I.I.M. = suma de reacciones cutáneas (E Oe+ ampoyas pápulas vesículas) / Números de voluntarios analizado
El I.I.M. obtenido permitió clasificar el extracto ensayado según la escala que figura en la tabla siguiente:
I.I.M. ≤ 0.20
No irritante
0,20 < I.I.M. ≤0 ,50
Ligeramente irritante
0,50 < I.I.M. ≤ 2
Moderadamente irritante
2 < I.I.M. ≤ 3
Muy irritante
Resultados: El Índice de Irritación Medio (I.I.P) del hidrolizado peptídico de la torta deperegrinaes igual a: 0.
Conclusión: El hidrolizado peptídico de la torta oleaginosaPeregrinapuede considerarse no irritante tras 48 horas consecutivas de aplicación a 12 voluntarios.
Conclusión general de los ensayos:
Los resultados de los ensayos realizadas anteriormente son concluyentes y demuestran para el hidrolizado peptídico según el ejemplo 1:
1) Los ensayos de irritación ocular y cutánea son negativas
2) Los ensayos de fototoxicidad son negativas
3) Los ensayos de mutagenicidad son negativas.
La seguridad del hidrolizado peptídico según la invención ha sido demostrada y es ideal para uso cosmético tópico a gran escala sin restricción en las poblaciones objetivo.
Ejemplo 22: Actividad despigmentante cutánea del extracto hidrolizado de tortas
El objetivo del ensayo es evaluar el potencial despigmentante y la aceptabilidad de un producto cosmético según la invención tras 28 días de aplicación. El producto probado es la crema antiarrugas descrita en el ejemplo 20.
[0198]Población analizada:
Número de voluntarios incluidos y analizados: 23
Mujer, edad media 64 años, entre 44 y 70 años, con lentigos en la cara, cuello, escote y/o manos.
Instrucciones de uso seleccionadas para el estudio: dos veces al día durante 28 días, aplicar un toque de producto sobre la piel limpia del rostro, cuello, escote y manos, y masajear hasta la completa absorción del producto; evitar el contacto con los ojos; aplicar el producto de protección solar suministrado antes de cualquier exposición al sol. Criterios de evaluación:
• Evaluación del potencial despigmentante: mediciones mexamétricas en tres puntos (zona pigmentada tratada, zona no pigmentada tratada, zona de control no pigmentada no tratada), en D1 y D28.
• Los voluntarios dicen sentir malestar.
• Fotografías ilustrativas de un lentigo utilizando el videodermoscopio C-Cube (Pixience SAS, Toulouse, Francia) en D1 y D28 (transmitidas como hojas de contacto por WeTransfer cuando se puso a disposición el informe final).
• Aceptabilidad cosmética: cuestionario cumplimentado por el voluntario en D28.
Resultados del estudio:
[Tabla 22]
El análisis de las mediciones mexamétricas mostró una reducción estadísticamente significativa del índice de melanina en las 2 zonas tratadas (zonas pigmentadas y no pigmentadas) en D28 en comparación con D1. Las variaciones registradas entre D28 y D1 en la zona no tratada resultaron ser estadísticamente insignificantes.
Conclusión: En las condiciones del estudio, el producto probado mostró una eficacia despigmentante significativa tras 28 días de uso.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Extracto de torta de semillas deMoringa peregrinaque comprende principalmente un hidrolizado peptídico que comprende derivados de aminoácidos, aminoácidos, péptidos y glucopéptidos cuyo peso molecular está comprendido entre 100 Da y 6.000 Da, preferentemente entre 1.500 Da y 5.000 Da, preferentemente entre 3.000 y 4.500 Da,caracterizado porquese obtiene a partir de semillas deMoringa peregrinamaduras, sin descascarillar, por proteólisis química a un pH superior a 13 durante un período aproximado de 2 horas a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C.
2. Extracto según la reivindicación 1,caracterizado porquecomprende además entre 0,3% y 3% de compuestos volátiles, de los cuales 50% de estos compuestos, es decir entre 0,15% y 1,5% del extracto, consiste en compuestos ligeros de nitrilo, principalmente isobutironitrilo y metilbutanonitrilo; de los cuales 5 a 10% de estos compuestos, es decir entre 0.015 y el 0,3% del extracto consiste en derivados de isotiocianato, principalmente isotiocianato de isopropilo e isotiocianato de isobutilo; del 1 al 5% de estos compuestos, es decir, entre el 0,003 y el 0,15%, consiste en aceites esenciales, principalmente eucaliptol, mentol y benzaldehído.
3. Procedimiento de obtención de un extracto de torta de semillas deMoringa peregrinasegún una de las reivindicaciones 1 ó 2,caracterizado porquecomprende las siguientes etapas según las cuales:
a) las semillas sin descascarillar recolectadas cuando están maduras del fruto de laMoringa peregrinase recogen y se secan hasta alcanzar un contenido de humedad interna inferior al 8%,
b) las semillas secas se prensan para separar el aceite del resto de la semilla con el fin de obtener una torta que contenga menos de un 6% en peso de aceite residual,
c) se tritura la torta obtenida en la etapa b),
d) la torta triturada obtenida en la etapa c) se dispersa en una fase acuosa,
e) la dispersión acuosa obtenida en la etapa d) se somete a proteólisis química durante un período aproximado de 2 horas, a un pH superior a 13 y a una temperatura comprendida entre 16 y 25°C, f) se neutraliza la proteólisis para estabilizar el hidrolizado peptídico obtenido,
g) el hidrolizado peptídico se recupera mediante separación sólido/líquido,
h) el hidrolizado peptídico se purifica por ultrafiltración y, a continuación, opcionalmente,
4. Procedimiento según la reivindicación 3,caracterizado porquela separación sólido/líquido de la etapa g) se lleva a cabo mediante diversos procedimientos como centrifugación, aireación y filtración,
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 o 4,caracterizado porqueen la etapa h) la ultrafiltración se lleva a cabo con un umbral de corte comprendido entre 100 Da y 6.000 Da y más particularmente entre 1.500 Da y 5.000 Da, y aún más particularmente entre 3.000 Da y 4.500 Da.
6. Composición cosmética o nutricosmética,caracterizada porquecomprende, como agente activo, una cantidad eficaz de un extracto de la torta de semillas deMoringa peregrinasegún una de las reivindicaciones 1 o 2, y un excipiente fisiológicamente aceptable.
7. Composición según la reivindicación 6,caracterizada porquese trata de una composición cosmética formulada para aplicación tópica sobre la piel yporqueel extracto de torta de semillas deMoringa peregrinaestá presente en la composición en una concentración de 0,002 a 20% en peso respecto al peso total de la composición, preferentemente de 0,01 a 10%.
8. Composición según la reivindicación 6,caracterizada porquese trata de una composición nutricosmética formulada para ser ingerida yporqueel extracto de torta de semillas deMoringa peregrinaestá presente en la composición en una concentración del 0,01 al 100% en peso respecto al peso total de la composición.
9. Uso cosmético o nutricosmético de una composición según una de las reivindicaciones 6 a 8, para mejorar el aspecto de la piel, las mucosas o las faneras, prevenir y/o combatir la sequedad de la piel y las mucosas, prevenir y/o combatir los signos cutáneos de envejecimiento y/o fotoenvejecimiento, favorecer el blanqueamiento de la piel y favorecer el adelgazamiento.
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