BR122024004006A2 - Extrato de torta de sementes de moringa peregrina, composições cosmética e nutricosmética e uso das mesmas - Google Patents

Abstract

A invenção está relacionada a um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina compreendendo predominantemente um hidrolisado de peptídeo e a um processo de obtenção do extrato. A invenção também está relacionada a composições cosméticas ou nutricosméticas compreendendo o referido extrato e o uso das referidas composições para melhorar a aparência da pele, membranas mucosas ou tegumentos, para prevenir e/ou combater o ressecamento da pele e membranas mucosas, para prevenir e /ou combater os sinais de envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele, para promover o clareamento da pele e para promover o emagrecimento.

Description

Campo técnico

[001] A invenção está relacionada ao campo cosmético e nutricosmético e, mais particularmente, ao campo de ingredientes ativos incluídos na formulação de composições para cuidados com a pele. A invenção está relacionada a um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina compreendendo predominantemente um hidrolisado de peptídeo. A invenção também está relacionada ao processo para obtenção do extrato particular de torta de sementes de Moringa peregrina, a composições cosméticas ou nutricosméticas compreendendo tais extratos e, finalmente, ao uso cosmético ou nutricosmético de tais composições para cuidar da pele, do couro cabeludo e dos tegumentos.

Antecedentes técnicos

[002] As Moringaceaesão uma família monogenérica (apenas um gênero, Moringa adans), um elemento da flora saharo-sindiana, constituída por entre 12 e 14 espécies de acordo com os autores, distribuídas da África Oriental até à Ásia. O gênero é convencionalmente dividido em três seções que, no entanto, não são confirmadas como monofiléticas pelas análises filogenéticas. As referidas análises revelaram antes clados centrados em certos caracteres morfológicos: paquicaules (“árvores garrafa”); “árvores tuberosas” e aquelas que não são árvores garrafa nem árvores tuberosas (“árvores delgadas”). A espécie Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, pertence ao terceiro grupo. Os escassos estudos genéticos sobre o gênero ou a família confirmam a realidade da espécie em relação às demais espécies do gênero, notavelmente no que diz respeito à moringa indiana, Moringa oleifera Lam. (vide notavelmente os artigos: Oslon, M.E. 2002, Combining Data from DNA Sequences and Morphology for a Phylogeny of Moringaceae (Brassicales), Systematic Botany 27(1): 55-73; Hassanein, A.M.A.E AL-SOQEE, A.A., 2018, Morphological and genetic diversity of Moringa oleifera and Moringa peregrina genotypes, Horticulture, Environment and Biotechnology 59(2): 251-261). Um artigo recente sobre Moringa peregrina amostrado em vários locais na Arábia Saudita concluiu, usando marcadores ITS, que havia estabilidade genética da espécie (Alaklabi, A., 2015, Genetic diversity of Moringa peregrina species in Saudi Arabia with ITS sequences, Saudi Journal of Biological Sciences 22: 186-190) com, no entanto, um alto nível de variação genética intrapopulacional.

[003] A espécie Moringa peregrinaé encontrada nos ambientes rochosos do Iêmen, Omã, Arábia Saudita, África Oriental, Sudão, Etiópia, Eritreia, Somália e Djibuti. Sua presença no Irã parece limitada às províncias do sudeste, mas isso requer confirmação (PROTA14 = Munyaniziza E. Yongabi K.A., Vegetable oils/Oleaginous plants, Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, http://database.prota.org/protahtml/moringa peregrina_fr.htm, acessado em 23/10/2019). No Oriente Médio e no Egito, a espécie agora é representada apenas por raras estações relictas dispersas (com exceção de algumas populações em altitude), principalmente nos setores da área do Sudão. Moringa peregrinaé hoje também considerada rara e em perigo no Sudão e no Iémen. Em relação às outras espécies de seu revestimento, Moringa peregrina ocupa os habitats mais áridos e inóspitos. É aparentemente mais resistente à seca do que Moringa oleifera que é plantada comercialmente em larga escala nas zonas tropicais e subtropicais. Estudos recentes mostraram que o tamanho e a circunferência das sementes tiveram um impacto favorável no tempo de germinação e na taxa e velocidade de crescimento dos indivíduos jovens (Gomaa N.H.E PICÓF.X., 2011, Seed germination, seedling traits, and seed bank of the tree Moringa peregrina (Moringaceae) in a hyper-arid environment, American Journal of Botany 98(6): 1024-1030), indicando um ajuste na alocação de recursos em relação à qualidade da semente e não ao número, o que possibilita Moringa peregrina reproduzir eficientemente em ambientes abióticos extremos (hiperáridos). Sementes de Moringa peregrinatêm uma mesotesta central mais espessa, em termos de camada celular, do que as de Moringa oleifera.

[004] Existem alguns relatos históricos que tendem a indicar que o óleo de Moringa peregrina foi ativamente comercializado no início do Islã na região de Al-Ula (Naseef, AAS, 1995, Al-'Ula, A study of Cultural and Social Heritage).O óleo produzido a partir de Moringa peregrina é hoje principalmente destinado ao consumo pessoal ou aos mercados locais. Na Arábia Saudita, as folhas eram tradicionalmente usadas como uma decocção para uso interno no tratamento de diabetes, doenças intestinais, doenças oculares e anemias (Abdel-Kader, M.S, Hazazi A.M A, ELMAKKI O.A. AND ALQASOUMI S.I., 2018, A survey on the traditional plants used in Al Kobah village, Saudi Pharmaceutical Journal 26(6): 817-821) e como diurético, rubefaciente e adstringente (AQEEL A.A.M., TARIQ M., MOSSA J.S., AL-YAHYA M.A. E AL-SAID M.S., 1984, “Plants used in Arabian Folk medicine”, Report submitted to Saudi Arabian National Centre for Science and Technology, Riyadh, Saudi Arabia). Em Omã, o óleo, extraído pelas mulheres no final do verão, é usado para combater enxaquecas, febres, queimaduras, lacerações e fraturas, constipação e dores de estômago, e para combater dores musculares e ressecamento do cabelo (GHAZANFAR S.A., 1994, Handbook of Arabian Medicinal Plants, 1st ed., CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, U.S.; GHAZANFAR S.A., 1998, Plants of Economic Importance, cap. 15, in GHAZANFAR, S.A. E FISHER, M. (ed.) Vegetation of the Arabian Peninsula. Geobotany 25, pages 241-264, Kluwer Academic Publishers, table 11.1, page 247 and 11.7 page 251). Também foi usado em composições perfumadas (GHAZANFAR SA, 1998, page 259) e no Omã e Iêmen como uma loção facial (GHAZANFAR SA E RECHINGER B., 1996, Two multi- purpose seed oils from Oman. Plants for Food and Medicine. Paper presented at the joint meeting of the Society for Economic Botany and International Society for Ethnopharmacology, July 1-7, 1996, London).

[005] Extratos provenientes de sementes de Moringa oleiferasão conhecidas no campo dos cosméticos. Por exemplo, FR 296 879 revela um extrato de sementes inteiras (com tegumentos) de Moringa oleifera que contém, por 100 g de extrato seco, a partir de 5% a 50% de óleo (incluindo triglicerídeos, ácidos graxos e lipídios polares) e a partir de 0,01% a 5% de polifenóis, e o uso das mesmas em composições cosméticas para combater o envelhecimento da pele. No referido documento, a extração com solvente moderadamente polar é realizada em toda a semente de Moringa oleifera.

[006] É também conhecido a partir de FR 2 776 519 que os extratos de proteínas de sementes de Moringa oleifera, conhecidas por seus efeitos clareadores em águas turvas, têm efeito suavizante, condicionador fisiológico, hidratante, reestruturante e reparador e um efeito antipoluição na pele e membranas mucosas. No referido documento, os princípios ativos são proteínas com pesos moleculares entre 6.500 e 8.800 Da, que são obtidas por extração aquosa da torta de Moringa oleifera com hidróxido de sódio a 4N durante uma hora a pH 7,5.

[007] É também conhecido a partir de FR 2 825 267 que os extratos de grãos inteiros ou moídos, com ou sem casca de sementes de Moringa, ou sementes nas quais a moagem foi realizada ou extratos proteicos desengordurados ou não desengordurados, têm benefícios nas áreas de desodorização e a supressão de odores desagradáveis, limpeza, higiene íntima, higiene oral e cuidados dentários, além de amaciar, hidratar, propriedades cosméticas calmantes e antifadiga na pele. No referido documento, é demonstrado que os extratos de proteínas inteiras têm atividade aumentada quando a semente não é desengordurada.

[008] O FR 3 076 460 está relacionado ao uso de um extrato de proteína não germinado e desengordurado de sementes de Moringa oleifera para o tratamento de pele sensíveis, sensibilizadas, reativas, frágeis e/ou fragilizadas e/ou membranas mucosas e/ou no tratamento e/ou prevenção de eritema, em particular, erupção cutânea de fraldas de bebês. No referido documento, o processo de extração permite a produção da maior fração de proteínas com pesos moleculares de cerca de 8800 Da.

[009] Finalmente, o KR2013/0088224 revela o uso de um extrato de sementes inteiras germinadas de Moringa oleifera em cosméticos, em particular obtidas por extração usando um fluido supercrítico. O referido processo possibilita isolar aminoácidos apolares e carotenoides, que são descritos como agentes ativos para uso cosmético clareador.

[010] Todos os documentos acima mencionados estão relacionados ao uso da espécie Moringa oleifera; nenhum deles descreve o uso no campo cosmético de extratos obtidos a partir da espécie Moringa peregrina.

[011] Mais especificamente, para as espécies Moringa peregrina, sabe-se que certos compostos fenólicos e flavonoides obtidos a partir das folhas ou da semente inteira de Moringa peregrina tem atividade antioxidante (AL-DABBAS M., 2017, Antioxidant activity of different extracts from the aerial part of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, from Jardan, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 30(6): 2151-2157). Esses compostos são extraídos com solventes tais como metanol, acetato de etila ou hexano a partir das folhas ou das sementes inteiras. Parece que são as folhas que compreendem a maior quantidade de compostos ativos. O XP055753092, 2005 de ABU TARBOUSH et al.também revela a extração de um hidrolisado de sementes com casca de Moringa peregrina produzidas por hidrólise enzimática durante um período de 10 horas. O objetivo dessa extração é obter um produto que tem uma alta capacidade de absorção de óleo e água. Finalmente, NASHEF et al., o XP0010830, 1977, revela em geral as consequências da hidrólise alcalina principalmente em proteínas puras que podem levar a modificações das propriedades físicas e químicas das proteínas e, ainda, do seu valor nutritivo. As condições de hidrólise usadas com hidróxido de sódio a 0,1 M são uma temperatura de 50 °C por um período de 24 horas. O referido documento menciona lesões renais em ratos alimentados com proteínas tratadas com bases nestas condições.

[012] Assim, dependendo da espécie usada no gênero Moringa, é observado que, dependendo da parte da planta (folha ou semente), da parte da semente (semente inteira ou não, com ou sem casca) e do processo de extração realizado, notavelmente a escolha do solvente, as moléculas extraídas se mostram diferentes. Já a composição do extrato condiciona a atividade biológica e consequentemente a eficácia cosmética.

[013] Diante do exposto, um problema que a invenção se propõe a resolver é o de desenvolver novos produtos com base em um extrato da espécie Moringa peregrina do gênero Moringa e da família Moringaceae que podem ser usados em cosméticos e que são fáceis de usar.

[014] Por conseguinte, o requerente revelou um novo extrato obtido a partir da torta de sementes da espécie Moringa peregrina, que melhora a aparência da pele, das membranas mucosas e dos tegumentos e notavelmente para prevenir e/ou combater o ressecamento da pele e/ou das membranas mucosas, para prevenir e/ou combater os sinais de envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele, para promover o clareamento da pele e prevenir as marcas da idade, e também para promover o emagrecimento e prevenir ou aliviar a vermelhidão da pele. O extrato de acordo com a invenção compreende predominantemente um hidrolisado de peptídeos de torta de sementes de Moringa peregrina. O extrato obtido especificamente a partir da torta de sementes de Moringa peregrina sem casca é novo em dois aspectos no campo cosmético em relação aos extratos do estado da técnica, primeiro devido à origem espécie-específica usada e segundo devido ao seu perfil molecular particular.

[015] Pelo acordo intergovernamental de 10 de abril de 2018 entre o governo da República Francesa e o Reino da Arábia Saudita, o requerente, Agência Francesa para o Desenvolvimento da AlUla (AFALULA) e a Comissão Real para a AlUlA (RCU) notavelmente tem o projeto conjunto de desenvolvimento de agricultura sustentável e da economia local, notavelmente para a produção local de produtos naturais derivados a partir de plantas indígenas e de proteção da biodiversidade e dos direitos da região de AlUla do Reino da Arábia Saudita. O Reino da Arábia Saudita é um membro do Protocolo de Nagoya desde 8 de outubro de 2020. No momento da elaboração da presente patente, os regulamentos de implementação em relação aos quais o Protocolo de Nagoya será integrado aos aspectos relevantes da lei local estão sendo examinados. Consequentemente, nesse estágio, o Reino da Arábia Saudita não tem requisitos específicos no que diz respeito ao presente pedido de patente e ao Protocolo de Nagoya. Assim, na data do depósito do pedido de patente, não há exigência de certificado de conformidade em relação ao acesso a recursos genéticos.

Resumo

[016] Um primeiro objetivo da invenção é um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina compreendendo predominantemente um hidrolisado de peptídeos que compreende derivados de aminoácidos, aminoácidos, peptídeos e glicopeptídeos com um peso molecular entre 100 Da e 6000 Da, preferencialmente entre 1500 Da e 5000 Da, mais preferencialmente entre 3000 Da e 4500 Da, e pelo fato de que é obtido a partir das sementes sem casca, quando o fruto da Moringa peregrinaestá maduro, por proteólise química a um pH superior a 13 por um tempo de cerca de 2 horas a uma temperatura entre 16 e 25 °C.

[017] Em virtude de suas características particulares, o extrato de acordo com a invenção é único no gênero Moringa e na família Moringaceae. Será demonstrado que o extrato da espécie Moringa peregrina tem um hidrolisado de peptídeos particular que é diferente daqueles conhecidos a partir das outras espécies do gênero, notavelmente da espécie Moringa oleifera, que o requerente conseguiu revelar.

[018] Um segundo objetivo da invenção é um processo para obtenção de um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas nas quais: a) as sementes sem casca, colhidas quando o fruto da Moringa peregrina está maduro, são coletadas e secas para obter um teor de umidade interna inferior a 8%, b) as sementes secas são prensadas de modo a separar o óleo do restante da semente, de modo a obter a torta compreendendo menos de 6% em peso de óleo residual, c) a torta obtida na etapa b) é moído, d) a torta moída obtido na etapa c) é disperso em fase aquosa, e) a proteólise química da dispersão aquosa obtida na etapa d) é realizada por um tempo de cerca de 2 horas, a um pH superior a 13 e a uma temperatura entre 16 e 25 °C, f) a proteólise é neutralizada para estabilizar o hidrolisado de peptídeos obtido, g) o hidrolisado de peptídeos é recuperado por separação sólido/líquido, h) o hidrolisado de peptídeos é purificado por ultrafiltração e então, opcionalmente, i) a liofilização do hidrolisado de peptídeos obtido na etapa h) é realizada.

[019] Um terceiro objetivo da invenção é uma composição cosmética ou nutricosmética compreendendo, como agente ativo, uma quantidade eficaz de um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina de acordo com a invenção e um excipiente fisiologicamente aceitável.

[020] Por fim, um quarto objetivo da invenção é o uso cosmético ou nutricosmético de uma composição de acordo com a invenção, para melhorar a aparência da pele, membranas mucosas ou dos tegumentos, para prevenir e/ou combater o ressecamento da pele e das membranas mucosas, para prevenir e/ou combater os sinais de envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele, por promover o clareamento da pele e por promover o emagrecimento.

Breve descrição das figuras

[021] A invenção será melhor entendida e objetivos adicionais, detalhes, características e vantagens da mesma aparecerão mais claramente a partir da descrição a seguir de várias modalidades particulares da invenção, dada meramente para ilustração e sem limitação, com referência aos desenhos anexos.

[022] A [fig.1] representa os resultados comparativos do efeito hidratante de vários produtos na superfície da pele.

Descrição das modalidades

[023] Nesta descrição, a menos que especificado de outra forma, entende- se que quando uma faixa é dada, ela inclui os limites superior e inferior da referida faixa.

[024] Na presente invenção, as seguintes abreviações têm os significados dados abaixo: - MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (o teste MTT é um método rápido para contar células vivas); - SDS: Dodecil Sulfato de Sódio; - PBS: Solução Salina Tamponada com Fosfato; - ELISA: Ensaio de Imunoabsorção Enzimática; - PCR: Reação em cadeia da polimerase; - ANOVA: Análise de Variância; - MSH: Hormônio Estimulante de Melanócitos.

[025] Na presente invenção, aplicam-se as seguintes definições: - “predominantemente um hidrolisado de peptídeo”: uma quantidade superior a 10%, preferencialmente superior a 20%, mais preferencialmente superior a 30% e que pode ser até cerca de 40% (massa/massa) de matéria seca de peptídeos, oligopeptídeos, glicopeptídeos e aminoácidos ou derivados voláteis de nitrila dos mesmos, mais preferencialmente 50% do peso da matéria seca; - “quantidade efetiva”: a quantidade necessária de moléculas ativas para obter o resultado desejado, nomeadamente tornando possível melhorar notavelmente a aparência da pele; - “proteólise”: a segmentação de proteínas em peptídeos, oligopeptídeos e os fragmentos básicos dos mesmos (aminoácidos) por meio de hidrólise química ou enzimática; - “aplicação tópica”: aplicar ou espalhar o princípio ativo de acordo com a invenção, ou uma composição contendo o mesmo, sobre a superfície da pele, uma membrana mucosa ou os tegumentos; - “fisiologicamente aceitável”: adequado para uso tópico, em contato com a pele humana, ou para uso por meio de outras vias de administração, por exemplo, por via oral ou por injeção na pele, sem qualquer risco de toxicidade, incompatibilidade, instabilidade ou resposta alérgica; - “torta”: a parte desengordurada da semente após a prensagem. É o resíduo sólido a partir da extração do óleo das sementes. É um coproduto da operação de moagem, o processo de fabricação do óleo. Geralmente representa a partir de 50% a 75% da massa das sementes; - “sementes sem casca”: significa que a casca (pericarpo) e o tegumento das sementes colhidas são mantidos em torno do caroço; - “quando o fruto está maduro”: significa que o fruto está maduro, preferencialmente quando a vagem está no início da deiscência e passa da cor bege escuro para marrom e quando uma torção de 180° do quarto inferior da vagem provoca a abertura das válvulas; - “cerca de”: uma margem de mais ou menos 10% a 20% em relação à informação dada; - “pool de moléculas ativas”, também “princípio ativo”: o hidrolisado de peptídeos extraído de acordo com o processo da invenção a partir da torta de semente de Moringa peregrina. Este hidrolisado é responsável pelas atividades biológicas descritas na presente invenção; - “agente ativo”: uma quantidade suficiente de um extrato de acordo com a invenção para obter as atividades biológicas descritas. Dependendo se o extrato é líquido ou seco, e concentrado ou não, as quantidades do agente ativo podem variar em proporções a partir de 0,002% a 40% em peso em relação ao peso total da composição; - “sinais de envelhecimento da pele”: qualquer modificação na aparência externa da pele e dos tegumentos devido ao envelhecimento, por exemplo, rugas e linhas finas, pele enrugada, flacidez da pele, afinamento da pele, falta de elasticidade e/ou tonicidade da pele, pele opaca e sem brilho ou manchas de pigmentação na pele, descoloração do cabelo ou manchas nas unhas, mas também qualquer modificação interna da pele que não seja sistematicamente refletida por uma aparência externa modificada, por exemplo, qualquer degradação interna da pele após exposição à radiação ultravioleta (UV).

[026] Um primeiro objetivo da invenção é um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina compreendendo predominantemente um hidrolisado de peptídeos que compreende derivados de aminoácidos, aminoácidos, peptídeos e glicopeptídeos com um peso molecular entre 100 Da e 6000 Da, preferencialmente entre 1500 Da e 5000 Da, mais preferencialmente entre 3000 Da e 4500 Da, e pelo fato de que é obtido a partir das sementes sem casca, quando o fruto da Moringa peregrinaestá maduro, por proteólise química a um pH superior a 13 por um tempo de cerca de 2 horas a uma temperatura entre 16 e 25 °C.

[027] O hidrolisado de peptídeo, compreendendo peptídeos, oligopeptídeos, glicopeptídeos e aminoácidos, como no perfil definido abaixo, nunca foi demonstrado em um extrato de sementes do gênero Moringa peregrina. As espécies Moringa peregrina cresce em climas muito áridos. Assim, sua capacidade de adaptação à seca e de reprodução em condições extremófilas permitiu a obtenção de características únicas, que o requerente conseguiu identificar por meio do uso de um processo de extração específico na torta de semente de Moringa peregrina.

[028] No contexto da presente invenção, a parte vegetal escolhida é a torta de sementes de Moringa peregrina. Sabe-se que sementes de Moringa peregrinasão usadas para a extração de seu óleo, que é útil para consumo pessoal ou em vários tratamentos medicinais tradicionais. A torta obtida após a remoção do óleo da semente é um produto residual que atualmente é usado notavelmente para alimentação animal.

[029] De acordo com uma modalidade preferencial, o extrato de acordo com a invenção é obtido a partir da torta de sementes sem casca de Moringa peregrina.

[030] De acordo com uma modalidade, o hidrolisado de peptídeos do extrato de acordo com a invenção compreende derivados de aminoácidos, aminoácidos, peptídeos e glicopeptídeos com um peso molecular entre 100 Da e 6000 Da, mais particularmente entre 1500 Da e 5000 Da e ainda mais particularmente entre 3000 Da e 4500 Da.

[031] De acordo com outra modalidade, o extrato também compreende entre 0,3% e 3% de compostos voláteis, dos quais 50% destes compostos, ou seja, entre 0,15% e 1,5% do extrato de acordo com a invenção, é constituído por compostos nitrílicos leves, principalmente isobutironitrila e metilbutanonitrila; dos quais 5% a 10% destes compostos, ou seja, entre 0,015% e 0,3% do extrato de acordo com a invenção, é constituído por derivados de isotiocianato, principalmente isotiocianato de isopropila e isotiocianato de isobutila; dos quais 1% a 5% desses compostos, ou seja, entre 0,003% e 0,15% do extrato de acordo com a invenção, é constituído de óleo essencial, principalmente de eucaliptol, mentol e benzaldeído.

[032] Um segundo objetivo da invenção é um processo para obtenção de um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas nas quais: a) as sementes sem casca, colhidas quando o fruto de Moringa peregrina está maduro, são coletadas e secas para obter um teor de umidade interna inferior a 8%, b) as sementes secas são prensadas de modo a separar o óleo do restante da semente, de modo a obter a torta compreendendo menos de 6% em peso de óleo residual, c) a torta obtida na etapa b) é moído, d) a torta moída obtido na etapa c) é disperso em fase aquosa, e) a proteólise química da dispersão aquosa obtida na etapa d) é realizada por um tempo de cerca de 2 horas, a um pH superior a 13 e a uma temperatura entre 16 e 25 °C, f) a proteólise é neutralizada para estabilizar o hidrolisado de peptídeos obtido, g) o hidrolisado de peptídeos é recuperado por separação sólido/líquido, h) o hidrolisado de peptídeos é purificado por ultrafiltração e então, opcionalmente, i) a liofilização do hidrolisado de peptídeos obtido na etapa h) é realizada.

[033] As sementes sem casca são coletadas, ou seja, a casca (pericarpo) na qual se guardam as sementes, quando o fruto está maduro e preferencialmente quando a vagem está em início de deiscência.

[034] As sementes são secas para obter um teor de umidade interna inferior a 8% e preferencialmente cerca de 6%; a secagem é realizada preferencialmente em prateleira ventilada ao abrigo da luz solar, preferencialmente à sombra ao ar livre.

[035] As sementes secas são então moídas extemporaneamente com prensagem a frio, o que permite que o óleo seja separado mecanicamente do restante da semente comprimida, ou seja, a torta.

[036] A torta é então moída mecanicamente com qualquer tipo de moinho mecânico, tal como moinho de martelo, moinho de malho, moinho de facas, moinho esmagador/de trituração, moinho de bolas ou moinho de pilão, mas também com qualquer tipo de moinho criogênico.

[037] A dispersão em fase aquosa de acordo com a etapa d) e a proteólise de acordo com a etapa e) são vantajosamente sempre realizadas com agitação, permitindo assim a dispersão e homogeneização do sólido no líquido, melhorando assim a superfície de troca global e consequentemente a proteólise.

[038] Um hidrolisado de peptídeos líquido com uma densidade superior a 1 e preferencialmente cerca de 1,1 é obtido, compreendendo um teor de matéria seca entre 10% e 15%, preferencialmente cerca de 12,5%, compreendendo entre 1% e 6% de compostos nitrogenados, notavelmente derivados voláteis de nitrila em uma proporção de a partir de 0,5% a 1,5%, preferencialmente cerca de 0,8%, e 20 mg/litro de polifenóis (0,0002%).

[039] De acordo com uma modalidade preferencial do processo de acordo com a invenção, a separação sólido/líquido da etapa g) é realizada por vários processos tais como centrifugação, desidratação ou filtração.

[040] De acordo com outra modalidade preferencial do processo de acordo com a invenção, a ultrafiltração na etapa h) é realizada com um limiar de corte entre 100 Da e 6000 Da, mais particularmente entre 1500 Da e 5000 Da e ainda mais particularmente entre 3000 Da e 4500 Da.

[041] Em uma modalidade de acordo com a invenção, o processo para obtenção de um extrato de torta de sementes é obtido a partir da torta de sementes sem casca por proteólise, com agitação, em uma proporção não superior a 25% em peso de matéria sólida em relação ao peso total usado no solvente aquoso, a uma temperatura entre 16 e 25 °C por um período de cerca de 2 horas.

[042] Em uma modalidade do processo para obter o extrato líquido de Moringa peregrina obtido, o hidrolisado de peptídeos é purificado por destilação, microfiltração, ultrafiltração e/ou nanofiltração para concentrar o extrato como compostos de interesse em relação aos derivados nitrílicos voláteis também extraídos. Essas etapas de purificação possibilitam concentrar o agrupamento de compostos de interesse em detrimento de outros compostos extraídos, tais como os mencionados.

[043] Em outra modalidade do processo de extração de acordo com a invenção, o extrato líquido obtido é seco de modo a obter um extrato seco de torta de sementes de Moringa peregrina contendo uma quantidade superior a 10%, preferencialmente superior a 20%, mais preferencialmente superior a 30% e que pode ser até cerca de 40% (massa/massa) de matéria seca de peptídeos, oligopeptídeos, glicopeptídeos e aminoácidos ou os derivados voláteis de nitrila dos mesmos, mais preferencialmente 50% do peso da matéria seca.

[044] De acordo com uma modalidade da invenção, o extrato líquido da torta de sementes de Moringa peregrina obtido é preferencialmente seco, por exemplo, por atomização, liofilização ou zeodração de modo a obter um extrato sólido de sementes de Moringa peregrina, tendo-se evaporado a água. A secagem pode ser realizada na presença de um aditivo de suporte de secagem tal como maltodextrina, ciclodextrina ou inulina, ou na presença de um suporte mineral tal como filossilicato, silicato de magnésio ou carbonato e sais dos mesmos.

[045] A invenção também se refere ao extrato da torta de sementes de Moringa peregrina que pode ser obtido por meio do processo de extração de acordo com a invenção.

[046] Um terceiro objetivo da invenção é uma composição cosmética ou nutricosmética compreendendo, como agente ativo, uma quantidade eficaz de um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina de acordo com a invenção e um excipiente fisiologicamente aceitável.

[047] A composição de acordo com a invenção pode ser formulada na forma de várias preparações adequadas para administração tópica ou para administração oral.

[048] De acordo com uma primeira variante, as várias preparações são adequadas para administração tópica e incluem cremes, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, leites, pomadas, loções, óleos, bálsamos, soluções aquosas ou aquosas-alcoólicas ou glicólicas, soros, pós, adesivos, sprays ou qualquer outro produto para aplicação externa, por exemplo, dispositivos médicos ou produtos cosméticos-têxteis.

[049] De acordo com uma segunda variante, as várias preparações são adequadas para administração oral; o extrato vegetal compreendendo o hidrolisado de peptídeos que pode ser incluído em uma composição alimentar ou em um suplemento alimentar. O suplemento alimentar pode estar na forma de cápsulas de gel duro ou gelatina mole ou cápsulas vegetais no contexto da presente invenção. O referido suplemento alimentar pode então conter a partir de 0,01% a 100% em peso do extrato vegetal.

[050] No contexto de um uso alimentar, para fins nutritivos ou cosméticos (cosmeto-alimentares ou nutricosméticos), a composição será vantajosamente formulada na forma de uma preparação que é adequada para administração oral. Não pode compreender nenhum excipiente e pode ser constituído, em sua totalidade, pelo extrato vegetal compreendendo o hidrolisado de peptídeos na forma seca.

[051] De acordo com uma modalidade preferencial, as composições de acordo com a invenção destinam-se mais particularmente à administração tópica. Estas composições devem assim conter um meio cosmeticamente aceitável, isto é, um meio que é compatível com a pele e os tegumentos, e abranger todas as formas cosméticas. Estas composições podem ser apresentadas notavelmente na forma de cremes, emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo ou emulsões múltiplas, soros, soluções, suspensões, géis, leites, loções, adesivos ou mesmo pós, e podem ser adequadas para aplicação à pele, aos lábios e/ou aos tegumentos. Essas composições compreendem os excipientes que são necessários para sua formulação, tais como solventes, emolientes, espessantes, diluentes, tensoativos, antioxidantes, agentes bioativos, corantes, conservantes e fragrâncias. Eles podem ser usados como produtos de cuidados com a pele e/ou como produtos de maquiagem para a pele.

[052] A composição de acordo com a invenção pode, em particular, consistir em uma composição de tratamento capilar, e notavelmente um xampu, um condicionador de cabelo, uma loção de tratamento, um creme ou gel para penteado, uma loção de reestruturação capilar, uma máscara, etc. A composição cosmética de acordo com a invenção pode ser usada notavelmente em tratamentos envolvendo uma aplicação que pode ou não ser seguida de enxágue, ou alternativamente na forma de um xampu. A composição de acordo com a invenção pode ser vantajosamente usada em tratamentos anticaspa. Também pode ser na forma de um corante ou rímel para ser aplicado com uma escova ou pente, em particular nos cílios, nas sobrancelhas ou no cabelo.

[053] As composições de acordo com a invenção também compreendem quaisquer aditivos comumente usados no campo de aplicação previsto, e também os adjuvantes necessários para sua formulação, tais como solventes, espessantes, diluentes, antioxidantes, corantes, protetores solares, agentes autobronzeadores, pigmentos, enchimentos, agentes conservantes, fragrâncias, absorventes de odores, ativos cosméticos ou farmacêuticos, óleos essenciais, vitaminas, ácidos graxos essenciais, tensoativos, polímeros formadores de filme, etc.

[054] O Dicionário e Manual INCI (“International Nomenclature of Cosmetic Ingredients” (13th edition, 2010) published by The Personal Care Products Council Inc., Washington, DC) descreve uma grande variedade, sem limitação, de ingredientes cosméticos e farmacêuticos comumente usados na indústria de cuidados com a pele, que são adequados para uso como ingredientes adicionais nas composições de acordo com a presente invenção.

[055] Em qualquer caso, um técnico no assunto terá o cuidado de garantir que esses adjuvantes e as proporções das mesmas sejam escolhidos de modo que as propriedades vantajosas desejadas da composição de acordo com a invenção não sejam afetadas adversamente.

[056] De acordo com uma modalidade vantajosa da invenção, a quantidade de extrato vegetal na composição cosmética de acordo com a invenção é a partir de 0,002% a 20% em peso e, em particular, a partir de 0,01% a 10% em peso em relação ao peso total da composição.

[057] De acordo com outra modalidade vantajosa da invenção, a quantidade ou teor de extrato vegetal na composição nutricosmética de acordo com a invenção é a partir de 0,01% a 100% em peso em relação ao peso total da composição. Mais preferencialmente, a quantidade de extrato vegetal é a partir de 0,02% a 40% em peso e em particular a partir de 0,2% a 20% em peso em relação ao peso total da composição.

[058] Um quarto objetivo da invenção é o uso cosmético ou nutricosmético de uma composição de acordo com a invenção, para melhorar a aparência da pele, membranas mucosas ou dos tegumentos, para prevenir e/ou combater o ressecamento da pele e das membranas mucosas, para prevenir e/ou combater os sinais de envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele, por promover o clareamento da pele e por promover o emagrecimento.

[059] Embora a invenção tenha sido descrita em relação a várias modalidades particulares, é bastante óbvio que ela não está de forma alguma limitada a mesma e que abrange todos os equivalentes técnicos dos meios descritos e também combinações dos mesmos, se estiverem dentro do contexto da invenção.

[060] O uso do verbo “conter”, “compreender” ou “incluir” e suas formas conjugadas não exclui a presença de elementos ou etapas diferentes das declaradas em uma reivindicação.

Exemplos Exemplo 1: Preparação de um extrato vegetal de acordo com a invenção a partir de torta de Moringa peregrina

[061] Sementes de Moringa peregrina (Forssk.) Fiori obtidos quando o fruto estava maduro foram secos para obter um teor de umidade interna inferior a 8% e preferencialmente cerca de 6%, e então prensados com uma prensa mecânica sem fim, de modo a separar o óleo do restante da semente a fim de obter, por um lado, o óleo virgem de peregrina (nome INCI: “óleo de semente de Moringa peregrina”) e, por outro lado, uma torta. A torta é então isolado na forma de rolos pré-cortados em pedaços de 1 a 2 cm sobre os quais é realizada a extração. A composição das matérias-primas usadas no processo é dada abaixo.

[062] [Tabela 1]:

[063] Protocolo: a) uma solução com uma concentração a 1 molar de um agente alcalino forte, notavelmente tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de cálcio, ou uma mistura aquosa com uma concentração a 1 molar de agentes alcalinos fortes, mas preferencialmente hidróxido de sódio, é preparada; esta solução alcalina forte tem um pH superior a 13; j) a torta de Peregrinapré-cortada em pedaços de cerca de 1 cm é pesado em uma razão [1:10] (massa/massa) em solução alcalina; k) a torta obtida na etapa b) é moído; l) a torta moída obtido na etapa c) é disperso em fase aquosa; m) a proteólise química é realizada na dispersão aquosa obtida na etapa d), por um tempo de cerca de 2 horas a uma temperatura de 20 °C; n) a proteólise é neutralizada, para estabilizar o hidrolisado de peptídeos obtido, com um ácido fraco de modo a tamponar a solução na faixa de pH 4,5 a 5,5; o) o hidrolisado de peptídeos é recuperado por separação sólido/líquido; p) o hidrolisado de peptídeos é purificado por ultrafiltração.

[064] Um filtrado amarelo translúcido contendo cerca de 12,48% de matéria seca é obtido. O extrato líquido obtido é referido mais a diante como o “hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção” ou “hidrolisado de peptídeos de peregrina”. Este extrato líquido é subsequentemente utilizado para os testes de eficiência.

[065] Este hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção tem uma densidade superior a 1 e preferencialmente cerca de 1,1, compreendendo um teor de matéria seca entre 10% e 15%, preferencialmente cerca de 12,5%, compreendendo entre 1% e 6% de compostos nitrogenados, principalmente peptídeos e glicopeptídeos, e também derivados nitrílicos voláteis em uma proporção a partir de 0,5% a 1,5%, preferencialmente cerca de 0,8%, e 20 mg/litro de polifenóis (0,0002%). A composição dos compostos voláteis do hidrolisado de peregrina de acordo com a invenção é dado abaixo.

[066] [Tabela 2]:

[067] O hidrolisado de peptídeos de peregrinacontém isotiocianato de isopropila e isotiocianato de isobutila em níveis relativamente altos, confirmando publicações anteriores sobre a espécie (Kjaer et al. 1979, Isothiocyanates in Myrosinase-treated seed extracts of Moringa peregrina, Phytochemistry, 18, pages 1485-1487; Afsharypuor et al., 2010, Volatile Constituents of the Seed Kernel and Leaf of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, Agricolt. Cultivated in Chabahar (Iran), Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6(2): 141-144; Dehshahri S. et al., 2012, Determination of volatile glucosinate degradation products in seed coat, stem and in vitro cultures of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, ScienceOpen, Research in Pharmaceutical Sciences 7(1): 51-56). Os isotiocianatos são compostos produzidos por várias plantas pertencentes à ordem Brassicales, notavelmente nas famílias Brassicaceae, Capparaceae, Caricaceae e Moringaceae como um sistema de defesa contra o ataque por patógenos. No gênero Moringa, eles foram notavelmente identificados em M. oleifera e M. stenopetala (Baker F.) Cufold. (Abd Rani N.Z., Kharaina, H. and Kumolosasi, E., 2018, Moringa genus: A Review of Phytochemistry and Pharmacology, Frontiers in Pharmacology, volume 9, art. 108). Os isotiocianatos são derivados a partir da hidrólise de glucosinolatos pela enzima mirosinase quando os tecidos vegetais são danificados. Tem sido relatado que os isotiocianatos têm vários efeitos biológicos, como atividade antifúngica (Troncoso-Rojas, R. and Tiznado-Hernández, M.E., 2007, Natural compounds to control fungal diseases in fruits & vegetables, em Troncoso-Rojas, R., Tiznado-Hernández, M.E., González-León, A. (eds) Recent advances in alternative postharvest technologies to control fungal diseases in fruits & vegetables. Editorial. Transworld Research Network, Kerala, India, pages 127-156; Troncoso-Rojas, R. et al., 2005, Analysis of the isothiocyanates present in cabbage leaves extract and their potential application to control Alternaria rot in bell peppers, Food Research International 38:701-708), antimicrobiana, anticancerígena e efeitos anti-inflamatórios (Park, E.J. et al., 2011, Inhibition of lipopolysaccharide induced cyclooxygenase-2 expression and inducible nitric oxide synthase by 4-[(2'-O-acetyl-a-L-rhamnosyloxy)benzyl]isothiocyanate from M. oleifera, Nutrition and Cancer 63(6): 971-982; Rajan, T.S. et al., 2016, Anticancer activity of glucomoringin isothiocyanate in human malignant astrocytoma cells, Fitoterapa 110: 1-7; Padla E.P. et al., 2012, Antimicrobial isothiocyanates from the seeds of Moringa oleifera Lam, Zeitschrift für Naturforschung C, 67, 557-564; Waterman, C. et al., 2014, Stable, water extractable isothiocyanates from Moringa oleifera leaves attenuate inflammation in vitro. Phytochemistry 103: 114-122). O furfural está presente em uma concentração muito padrão encontrada neste tipo de semente e em inúmeras frutas secas. Dissulfeto de carbono, isobutironitrila, isobutirato de metila, metilbutanonitrila e hexanonitrila são compostos voláteis derivados de aminoácidos. Eles são marcadores de degradação de proteínas. Esses compostos de degradação representam cerca de 50% dos compostos voláteis no extrato da torta de peregrina hidrolisado. Este resultado indica que o extrato é constituído principalmente por proteínas ou peptídeos. Apenas traços muito pequenos de gorduras ou açúcares livres foram detectados no extrato hidrolisado de Moringa peregrina, e óleos essenciais, este último representando 4% dos compostos voláteis com a presença de mentol em cerca de 1%, a presença de eucaliptol em 1% e a presença de benzaldeído em cerca de 2%. Na matéria seca, o tampão citrato (que é um composto sacarídeo) representa cerca de 50% do restante e inclui os compostos glicosilados (sacarídeos) resultantes da degradação por proteólise das proteínas, oligopeptídeos e aminoácidos. Por fim, a presença de cerca de 20 mg/litro de polifenóis (0,0002%) derivados a partir de sementes de peregrina devem ser anotadas. O ácido benzóico não deve ser levado em consideração na caracterização, uma vez que é um estabilizante adicionado ao extrato. Este filtrado líquido compõe o extrato de acordo com a invenção e é usado na forma pura nos testes que seguem.

[068] A matéria seca do extrato descrito acima é obtida por meio de um método gravimétrico baseado na massa antes e depois a evaporação presente no extrato líquido. Esta massa seca é composta principalmente por proteínas e glicoproteínas com um peso molecular entre 100 e 6000 Da, que são parcialmente degradadas e solúveis em água, e são referidas como oligopeptídeos ou glico-oligopeptídeos ou hidrolisado de peptídeos de acordo com a invenção, derivados a partir da hidrólise de torta de Moringa peregrina. O extrato seco também compreende um tampão de citrato de sódio que estabiliza esses oligopeptídeos e glico-oligopeptídeos em um estado hidrolisado estático. Finalmente, este extrato é estabilizado microbiologicamente com um agente de preservação solúvel em água, tal como benzoato de sódio.

Exemplo 2: Efeito do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção como um antioxidante

[069] O objetivo deste estudo é avaliar a modulação da atividade antioxidante pelo hidrolisado de peptídeos de peregrina em um modelo colorimétrico in vitro acelular usando o radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila) e também o antioxidante de referência, o ácido ascórbico. O método usado é conhecido como inibição. Isso é baseado na degradação do radical oxidante de cor violeta DPPH, que absorve a 540 nm, com um antioxidante de referência, o ácido ascórbico. Esta reação serve como um controle positivo e leva à formação do composto DPPH que é incolor ou mesmo amarelo pálido. O hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção e o produto de referência “ácido ascórbico” são colocados em contato com a solução de DPPH por 30 minutos a 40 °C. A atividade antioxidante é então avaliada ao medir a absorbância a 540 nm. A modulação desta atividade é expressa como uma porcentagem de estimulação da atividade antioxidante pelo agente ativo testado, com, por referência, a atividade antioxidante máxima obtida na presença de ácido ascórbico (T+).

[070] Protocolo: Uma solução de DPPH é incubada por 30 minutos a 40 °C, na ausência (controle) ou na presença do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção (T+) e em concentrações decrescentes da amostra de teste. Ao final do período de incubação, a atividade antioxidante na presença do produto de referência e na presença ou ausência do hidrolisado de peptídeos de peregrina foi revelado por coloração após 30 minutos a 40 °C. Foi assim avaliado ao medir a absorbância do meio reacional a 540 nm. Para cada concentração testada, a modulação da atividade antioxidante com o produto teste é calculada de acordo com a seguinte fórmula.

[071] [Fórmula 1] Modulação percentual da atividade antioxidante = 100 x [(OD540 Controle - OD540 Produto de teste)/OD540 Produto de referência].

[072] Se o resultado for negativo, o produto de teste será considerado como oxidante; se o resultado for positivo, a porcentagem será expressa como estimulação da atividade de sequestro de radicais livres. Os resultados obtidos para a inibição de DPPH com o hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção são dados abaixo.

[073] [Tabela 3]:

[074] Conclusão: O hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção é capaz de proteger contra os radicais livres: tem propriedades antioxidantes significativas em e acima de uma concentração de 1%.

Exemplo 3: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção como um inibidor de metaloprotease

[075] O objetivo deste estudo é de avaliar a modulação da atividade anti-metaloprotease pelo hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção em um modelo acelular in vitro usando uma colagenase tipo I e hialuronidase, um complexo de substrato e um cromóforo, ninidrina. Uma solução tamponada de colagenase tipo I e hialuronidase reage com um complexo de substrato específico e o transforma para formar um composto que é capaz de ativar um cromóforo por incubação a 80 °C por 15 minutos. As atividades de colagenase e hialuronidase podem assim ser avaliadas ao medir a absorbância a 565 nm. A amostra é colocada em contato com a solução de colagenase e hialuronidase juntamente com o complexo de substrato enzimático a 37 °C por 5 minutos. O substrato transformado com as enzimas é capaz de ativar o cromóforo por incubação a 80 °C por 15 minutos. As atividades de colagenase e hialuronidase na presença/ausência da amostra são então avaliadas ao medir a absorbância a 565 nm. A modulação desta atividade é expressa como uma percentagem de inibição ou de ativação da atividade de colagenase e hialuronidase na ausência do agente ativo, ou seja, apenas na presença do substrato enzimático.

[076] Protocolo: Uma solução das enzimas colagenase tipo I e hialuronidase é incubada em seu substrato por 5 minutos, na ausência ou presença do extrato de peregrina de acordo com a invenção. As soluções são então colocadas em contato com o cromogênico ninidrina, seguido de incubação por 15 minutos a 80 °C. Ao final do período de incubação, a atividade das enzimas colagenase e hialuronidase com e sem o produto teste ou de referência foi avaliada ao medir a absorbância do meio de reação à 565 nm. Para cada concentração testada, a modulação das atividades enzimáticas de colagenase e hialuronidase com o produto de teste é calculada de acordo com a seguinte fórmula.

[077] [Fórmula 2] Modulação percentual da atividade enzimática da colagenase/hialuronidase = 100 x [(teste OD ou produto de referência - OD colagenase/hialuronidase sozinha)/OD colagenase/hialuronidase sozinha].

[078] Se o resultado for negativo, a porcentagem é expressa como inibição enzimática; se o resultado for positivo, a porcentagem é expressa como ativação enzimática. Os resultados da inibição da metaloprotease são dados abaixo.

[079] [Tabela 4]:

[080] Conclusão: O hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção dá origem a uma forte inibição de metaloproteases (colagenase/hialuronidase). É capaz de inibir totalmente essas metaloproteases a partir de uma concentração de 0,5% e tem bom potencial para proteger a matriz extracelular da pele com grande eficiência e, por meio dessa inibição, revela um efeito antienvelhecimento.

[081] Os testes comparativos são reportados abaixo com o extrato obtido de acordo com a patente de Pierre Fabre FR 2 946 879, cujos resultados, de acordo com o mesmo teste envolvendo simplesmente colagenase, são os seguintes.

[082] [Tabela 5]:

[083] Conclusão: o extrato de acordo com a patente de Pierre Fabre mostra uma leve ação inibitória dependente de dose inversa da atividade de colagenase com um pico de inibição de 42%, todas as concentrações combinadas, em oposição a um pico de inibição de 100% para o hidrolisado de peptídeos de acordo com a invenção.

[084] A atividade antienvelhecimento neste parâmetro parece ser diferente e inovadora em comparação com os efeitos observados com o extrato de acordo com a patente de Pierre Fabre.

Exemplo 4: Efeito do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção na inibição das enzimas histona desacetilases (HDAC) e sirtuína I

[085] O objetivo deste estudo é demonstrar a atividade inibitória do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção nas enzimas HDACs e sirtuína I. Uma solução tamponada de HDACs e sirtuína I reage com um substrato por 20 minutos a 37 °C e o transforma para formar um composto que fica corado na presença de um revelador após incubação a 37 °C por 10 minutos. A atividade máxima de desacetilação das sirtuínas pode assim ser avaliada ao medir a absorbância a 405 nm. O extrato de peregrina de acordo com a invenção ou o produto de referência “inibidor de tricostatina A (STA) 1 µM” são colocados em contato com a solução de sirtuínas juntamente com o substrato enzimático por 20 minutos a 37 °C, e o substrato transformado com a enzima é corado ao adicionar um revelador. A atividade de desacetilação das HDACs e sirtuína I na presença do agente ativo é então avaliada ao medir a absorbância a 405 nm. A modulação desta atividade é expressa como uma porcentagem de inibição ou ativação da atividade máxima das HDACs e da sirtuína I na ausência do agente ativo, ou seja, apenas na presença do substrato para as enzimas HDAC e sirtuína I.

[086] Protocolo: Uma solução de enzimas sirtuínas é incubada em seu substrato por 20 minutos na ausência (controle) ou presença do produto de referência, ou de concentrações crescentes dos produtos teste. O hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção é testado nas seguintes concentrações: 2%; 1%; 0,1% (V/V). Ao final do período de incubação, a atividade das enzimas sirtuínas com e sem o produto teste ou de referência foi revelada por coloração usando uma solução reveladora (10 minutos a 37 °C) e avaliada ao medir a absorbância do meio reacional a 405 nm. Para cada concentração testada, a modulação da atividade desacetilante das enzimas histona desacetilases e sirtuína I com o produto de teste é calculada de acordo com a seguinte fórmula.

[087] [Fórmula 3] Modulação percentual da atividade enzimática de sirtuína = 100 x [(OD405 teste ou produto de referência) - (OD405 HDACs e sirtuína I sozinhas)]/OD405 sirtuínas sozinhas.

[088] Se o resultado for negativo, a porcentagem é expressa como inibição da reação enzimática; se o resultado for positivo, a porcentagem é expressa como ativação da reação enzimática. Os resultados para a inibição das enzimas histona desacetilases (HDAC) são dados abaixo.

[089] [Tabela 6]:

[090] Conclusão: A 2%, o hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção apresenta inibição significativa de HDAC; essa inibição reflete a capacidade de promover a autoproteção das células da pele contra a deriva genética, notavelmente associada ao processo de envelhecimento. Assim, o extrato parece ser útil contra um dos desvios genéticos mais comuns na superfície da pele, nomeadamente fibrose, que se manifesta pelo aparecimento de “marcas na pele” (protuberâncias fibróticas). O extrato pode interferir vantajosamente com a fibrose na superfície da pele e, assim, prevenir o envelhecimento da pele.

Exemplo 5: Efeito tensor do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção.

[091] O objetivo deste estudo é avaliar o efeito tensor do hidrolisado de peptídeos de peregrina ativo em um modelo acelular in vitro de discos de colágeno liofilizado. Discos de colágeno liofilizado de 8 mm de diâmetro foram usados. A contração desses discos em resposta a vários tratamentos foi medida por análise de imagem. Quanto mais a área de superfície dos discos de colágeno diminui, maior o efeito tensor dos agentes ativos. O produto de referência usado neste estudo é a albumina sérica bovina a 100 mg/mL.

[092] Protocolo: Discos de colágeno de 8 mm de diâmetro foram embebidos com 40 µL de água ultrapura (controle), o produto de referência, ou concentrações crescentes do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção: 0,05; 0,1 e 0,5% (v/v). O hidrolisado de peptídeos de peregrina foi dissolvido diretamente em água ultrapura. As imagens digitais de cada um dos discos foram tiradas com um scanner antes e 30 minutos após a imersão. A área de superfície dos discos de colágeno foi medida nas imagens usando um software de análise de imagem. Os resultados para o efeito tensor são dados abaixo.

[093] [Tabela 7]:

[094] Conclusão: O hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção mostra um efeito tensor muito significativo em baixa concentração (menos de 1%). Estes resultados demonstram um efeito de “lifting” e consequentemente um efeito antienvelhecimento a curto prazo.

[095] Os exemplos 2 a 5 demonstram que o hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção tem o perfil de um bom agente ativo antienvelhecimento, a curto ou longo prazo.

Exemplo 6: Efeito do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção na inibição da ação da endotelina-1

[096] Tem sido relatado nos últimos anos que a endotelina promove um aumento na concentração de cálcio intracelular em melanócitos epidérmicos (células de melanina) para facilitar o crescimento celular por meio do sistema de transdução de sinal intracelular. Essa ação melhora a atividade da tirosinase, que é uma enzima determinante da taxa de síntese de melanina (Kadono, S. et al., 2001, The Role of the Epidermal Endothelin Cascade in the Hyperpigmentation Mechanism of Lentigo Senilis, Journal of Investigative Dermatology, 116(4): 571 577). Também foi relatado (Kawahara N. et al., 2005, About the Component of Snow Tea, Collection of Pharmaceutical, Society of Japan annual convention Subject matter, abstratct 30-0823, page 159) que a endotelina é um fator ativador de melanócitos produzido por queratinócitos epidérmicos e também um fator importante na pigmentação induzida por luz ultravioleta ou manchas hepáticas senis (Pang, Y., Geng, J., Qin, Y . et al. Endothelin-1 increases melanin synthesis in an established sheep skin melanocyte culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 52, 749-756 (2016) ou Hachiya, Akira et al. Biochemical Characterization of Endothelin-converting Enzyme-1a in Cultured Skin-derived Cells and Its Postulated Role in the Stimulation of Melanogenesis in Human Epidermis. Journal of Biological Chemistry, volume 277, issue 7, 5395-540). Estas ações biológicas da endotelina sugerem que os agentes ativos que são capazes de inibir a ação da endotelina podem ser úteis para reduzir ou prevenir a produção de melanina ou pigmentação.

[097] A endotelina é o vasoconstritor mais potente conhecido no corpo humano. Além disso, a depleção de endotelina também é conhecida por criar um efeito vasodilatador (Hirata, Y. et al., 1988, Cellular mechanism of action by a novel vasoconstrictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 154(3): 868-875; Shalinkumar P. et al., 2008, H2S Mediates the Vasodilator Effect of Endothelin-1 in the Cerebral Circulation. American Journal of Physiology. Heart Circulatory Physiology, 315, pages 1759-1764).

[098] O objetivo é testar a endotelina tipo-1 em células endoteliais microvasculares humanas após exposição por 24 horas ao hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção.

[099] Protocolo: As células endoteliais microvasculares humanas foram fornecidas pela empresa PELOBiotech e cultivadas em placas de 96 poços de acordo com os procedimentos de produção do fornecedor. Os extratos são deixados para atuar em várias concentrações nas células endoteliais a 80% de confluência por 24 horas, e a endotelina-1 nos sobrenadantes das células é então quantificada usando o kit de ELISA PicoKine (EDN1). Um teste de viabilidade é realizado previamente para definir as doses não tóxicas a serem usadas no ensaio de endotelina-1. Um controle negativo é realizado usando células em meio de cultura sem tratamento. O controle positivo no teste de viabilidade é 0,5% de SDS. Todas as condições são preparadas em meio de cultura e as células são subsequentemente incubadas a 36,5 °C / 5% de CO2 por 24 horas. a) Aplicação das soluções de teste nas células endoteliais:

[100] Os produtos de teste são colocados em contato com células endoteliais na subconfluência em placas de 96 poços. Para cada concentração, o teste é realizado em três poços. As placas são incubadas por 24 horas ± 1 hora a 36,5 °C / 5% de CO2. b) Teste de viabilidade:

[101] A viabilidade celular é avaliada com o método MTT nas células após incubação com os produtos. Após incubação por 24 horas, os sobrenadantes são recuperados e armazenados a -20 °C para os ensaios. Os poços são então enxaguados uma vez com 200 µL de PBS. 50 µL de uma solução de MTT a 0,5 mg/mL são adicionados a cada poço: incubação por 3 horas a 36,5 °C / 5% de CO2. 100 µL de isopropanol são adicionados a cada poço. Após homogeneização, é feita uma leitura de absorbância a 550 nm. Para cada condição, a razão dos valores médios de densidade óptica das células para os valores médios de densidade óptica dos controles negativos determina a razão de viabilidade. c) Ensaio de endotelina-1:

[102] O ensaio é realizado usando o kit ELISA. Os resultados para a inibição da ação da endotelina são dados abaixo.

[103] [Tabela 8]:

[104] Conclusão: O teste de viabilidade realizado ao final do tratamento não mostrou efeitos tóxicos para as concentrações testadas.

[105] O ensaio de endotelina-1 é realizado nos sobrenadantes celulares em concentrações não tóxicas. A quantidade de endotelina-1 para cada condição é testada usando o kit ELISA.

[106] Para as células de controle negativo, os valores são da ordem de 134,94 pg/mL. Para as células tratadas com várias concentrações de extratos, os valores são de 87,85 pg/mL (com 2% do extrato de acordo com a invenção) a 118,15 pg/mL (com 0,1% do extrato de acordo com a invenção), o que mostra inibições muito significativas em e acima de 0,1% do extrato de acordo com a invenção com cerca de 12,44% de inibição da produção de endotelina tipo-1 e até 34,90% de inibição com 2% do extrato de acordo com a invenção.

[107] Os resultados sobre a endotelina e a sua inibição específica dependente de dose demonstram que o hidrolisado de peptídeos de acordo com a invenção é um poderoso agente clareador da pele.

Exemplo 7: Efeito do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção na liberação ácidos graxos livres

[108] A lipólise nos adipócitos, ou a hidrólise de triacilglicerol (TAG) para liberar ácidos graxos e glicerol para uso por outros órgãos, é uma função única do tecido adiposo branco. A lipólise nos adipócitos ocorre na superfície das gotículas lipídicas citosólicas, que recentemente chamaram muita atenção como organelas dinâmicas, uma parte integrante do metabolismo lipídico. A recente identificação de AdPLA como uma principal fosfolipase adiposa A(2) levou à descoberta de uma regulação autócrina/parácrina dominante da lipólise pela PGE (2). Os mecanismos acima são fatores chave na lipólise e regulação da mesma. Descobertas recentes ligam a lipólise a deficiências ou mutações genéticas e preveem a ativação da lipólise nos adipócitos como um potencial alvo terapêutico (Ahmadjan M. et al., 2010, Lipolysis in Adipocytes, The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 42(5): 555-559).

[109] O objetivo do estudo é avaliar a capacidade do hidrolisado de peptídeos de acordo com a invenção em aumentar a liberação de glicerol em cultura de células humanas (adipócitos). O teor de glicerol está correlacionado com a lipólise. Um aumento no teor de glicerol implica em um efeito lipolítico. O efeito cosmético de emagrecimento está associado ao efeito lipolítico.

[110] Protocolo: Os adipócitos humanos são cultivados em placas de 24 e 12 poços de acordo com os procedimentos internos. Para isso, as amostras são deixadas agir em concentrações definidas em adipócitos confluentes por 24 horas. Um teste preliminar de viabilidade com MTT após 24 horas possibilita avaliar a citotoxicidade e escolher as concentrações para o teste de “efeito lipolítico”. Este “efeito lipolítico” é avaliado ao testar o glicerol nos sobrenadantes após 24 horas de exposição nas amostras.

[111] Um controle negativo é realizado usando células em meio de cultura sem tratamento. O controle positivo para o teste de viabilidade é 0,5% de SDS. O controle positivo para o teste de “efeito lipolítico” é 0,05% de cafeína. Todas as condições são preparadas em meio de cultura e as células são subsequentemente incubadas a 36,5 °C / 5% de CO2 por 24 horas ± 1 hora.

[112] Aplicação das soluções de teste nos adipócitos: - os produtos de teste são colocados em contato com os adipócitos confluentes em placas de 24 poços (teste de citotoxicidade) e placas de 12 poços (teste de “efeito lipolítico”); - para cada concentração, o teste é realizado em três poços; - as placas são incubadas por 24 horas ± 1 hora a 36,5 °C / 5% de CO2.

[113] Teste de viabilidade: - a viabilidade celular é avaliada com o método MTT nas células após incubação por 24 horas com os produtos; - após incubação por 24 horas, os poços pretendidos são enxaguados uma vezcom 200 µL de PBS; - 300 µL de uma solução de MTT a 0,5 mg/mL são adicionados a cada poço: incubação por 3 horas a 36,5 °C / 5% de CO2; - 800 µL de isopropanol são adicionados a cada poço; - após homogeneização, é feita uma leitura de absorbância a 550 nm; - para cada condição, a razão dos valores médios de densidade óptica das células para os valores médios de densidade óptica dos controles negativos determina a razão de viabilidade; - um valor de corte de viabilidade de 70% em relação ao valor de controle negativo é usado para classificar as substâncias de teste como citotóxicas ou não citotóxicas.

[114] Teste de “efeito lipolítico”: - o efeito lipolítico é avaliado ao testar o glicerol no meio de cultura após 24 horas ± 1 hora de incubação com os produtos; - os meios de cultura são misturados com o “reagente de glicerol livre” de acordo com o protocolo do fornecedor; - a solução de glicerol é usada para fazer a curva padrão em concentrações de 0 a 6250 µM; - a leitura de OD é feita a 550 nm. Os resultados para a liberação de ácidos graxos livres são dados abaixo.

[115] [Tabela 9]:

[116] Conclusão: Foi demonstrado que o hidrolisado de peptídeos de acordo com a invenção promoveu a liberação de glicerol dos adipócitos humanos e, assim, induziu um efeito de emagrecimento.

Exemplo 8: Efeito do extrato de peregrinade acordo com a invenção no estímulo da proteína ZAG

[117] A a-2-glicoproteína de zinco (ZAG) é uma glicoproteína plasmática que recebe o nome de sua mobilidade eletroforética e sua capacidade de ser precipitada com sais de Zn. A ZAG é um membro da superfamília de genes de imunoglobulinas e tem uma estrutura tridimensional que é altamente homóloga às moléculas de MHC de classe I e II. A ZAG foi detectada imuno- histoquimicamente em células epiteliais secretoras normais da mama, próstata e fígado, nas glândulas salivares, brônquicas, gastrointestinais e sudoríparas, e em epitélios estratificados normais, incluindo a epiderme. O ZAG mRNA permanece uniformemente distribuído em vários tipos de células [Za7]. Devido à sua produção pelo epitélio secretor, a ZAG está presente na maioria das secreções corporais e constitui 2,5% das proteínas na saliva e 30% daquelas em fluidos seminais, respectivamente.

[118] As funções padrão do ZAG não são claras. No entanto, a ZAG foi isolada a partir da urina de pacientes com câncer humano sofrendo de caquexia e pode funcionar como um fator de mobilização de lipídios. A ZAG purificada extraída a partir de soro humano ou murino, ou extraído a partir de urina humana em pacientes com câncer, induz a lipólise, levando à liberação de glicerol. Também aumenta o uso de lipídios em adipócitos humanos e murinos (Hirai K. et al., 1998, Biological Evaluation of a Lipid-Mobilizing Factor Isolated from the Urine of Cancer Patients, Cancer Research, 58(11): 2359-2365). A ZAG ativa a atividade da adenilato ciclase dependente de guanosina trifosfato (GTP) nas membranas de adipócitos, aumentando os níveis celulares de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP). Isso pode potencialmente levar à ativação de múltiplas vias celulares.

[119] Para intensificar o conhecimento das propriedades biológicas de ZAG, transfectantes de ZAG recombinantes humanos (rh) estáveis foram criados na linhagem celular de melanoma murino B16F10. O efeito da transfecção de ZAG na produção de melanina foi determinado in vitro e in vivo. Finalmente, o efeito da ZAG na expressão e atividade da tirosinase foi determinado. Como um todo, esses estudos mostram que a ZAG inibe a produção de melanina em melanócitos normais e malignos. Os mecanismos incluem efeitos pós-transcricionais na proteína tirosinase, com potencial para efeitos indiretos adicionais. Esses estudos permitiram a identificação de uma função biológica da ZAG até então desconhecida e possibilitaram um método para modular a produção de melanina, prevenindo e/ou reduzindo assim a pigmentação da pele e do cabelo devido ao aumento da produção de melanina (Hale L., Method of Modulating Melanin Production, Patente dos Estados Unidos N°. US7,803,750 B2, 2010) e (Ghada F.M. et al., 2015, Highlights in Pathogenesis of Vitiligo, World Journal of Clinical Cases 3(3): 221-230).

[120] O objetivo deste estudo é avaliar a capacidade do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção para aumentar a liberação de ZAG em cultura de células humanas (queratinócitos). O teor de ZAG deve ser correlacionado com um efeito clareador, um efeito emagrecedor, um efeito antifibrótico e um efeito calmante.

[121] Protocolo: Os queratinócitos humanos normais são isolados a partir dos prepúcios e cultivados em placas de 24 e 96 poços de acordo com os procedimentos internos.

[122] As amostras são deixadas agir em concentrações definidas nos queratinócitos a 80% de confluência por 48 horas, e as ZAGs nos sobrenadantes celulares são então quantificadas usando o kit ELISA.

[123] Um teste de viabilidade é realizado previamente para definir as doses não tóxicas a serem usadas no ensaio de ZAG.

[124] O controle negativo é realizado usando células em meio de cultura sem tratamento.

[125] O controle positivo para o teste de viabilidade é 0,5% de SDS.

[126] Todas as condições são preparadas em meio de cultura e as células são subsequentemente incubadas a 36,5 °C / 5% de CO2 por 24 horas para o teste de viabilidade e 48 horas para o ensaio de ZAG.

[127] Aplicação de soluções de teste aos queratinócitos: - os produtos de teste são colocados em contato com os queratinócitos na subconfluência em placas de 24 e 96 poços; - para cada concentração, o teste é realizado em três poços; - as placas são incubadas por 24 horas e 48 horas a 36,5 °C / 5% de CO2.

[128] Teste de viabilidade: - a viabilidade celular é avaliada com o método MTT nas células após incubação com os produtos; - após incubação por 24 e 48 horas, os poços pretendidos são enxaguados uma vez com 200 µL de PBS; - 50 µL de uma solução de MTT a 0,5 mg/mL são adicionados a cada poço: incubação por 3 horas a 36,5 °C / 5% de CO2; - 100 µL de isopropanol são adicionados a cada poço; - após homogeneização, é feita uma leitura de absorbância a 550 nm; - para cada condição, a razão dos valores médios de densidade óptica das células para os valores médios de densidade óptica dos controles negativos determina a razão de viabilidade.

[129] Ensaio de proteína ZAG: - após incubação por 48 horas, todos os sobrenadantes são recuperados e armazenados a -20 °C para os ensaios; - o ensaio é realizado usando um kit ELISA. Os resultados do ensaio de ZAG são dados abaixo.

[130] [Tabela 10]:

[131] Conclusão: O hidrolisado de peptídeos de peregrina pode aumentar significativamente a produção de ZAG, com boa dependência de dose e baixa toxicidade em células humanas. Como tal, isso tem um efeito de clareamento, um efeito de emagrecimento, um efeito antifibrótico e um efeito calmante com base em sua capacidade de aumentar significativamente a ZAG.

Exemplo 9: Efeito do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção na inibição da produção de melanina

[132] A pigmentação da pele é um processo complexo que, tanto na epiderme quanto nos folículos capilares, é iniciado com a síntese de melanina nos melanossomos dentro dos melanócitos, seguida pela transferência dos melanossomos para os queratinócitos circundantes, que por sua vez transportam o pigmento e, opcionalmente, degradam ele. Em humanos, toda a população de melanócitos está localizada nos folículos capilares e na camada basal da epiderme. Independentemente de sua localização na pele, os melanócitos têm uma origem embriológica comum, a crista neural da qual derivam na forma de melanoblastos (células não pigmentadas). Existem dois tipos de melanina nas células epidérmicas: a eumelanina, um pigmento marrom- preto, e a feomelanina, um pigmento amarelo-vermelho. Eumelanossomos e feomelanossomas coexistem nos melanócitos. A tirosinase é a enzima chave que regula as primeiras etapas na síntese de feomelanina e eumelanina: a conversão de L-tirosina em L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) e a oxidação deste composto em dopaquinona. Da dopaquinona, as vias sintéticas divergem para eumelanina e feomelanina. O principal papel da melanina é de proteger a pele contra os efeitos nocivos da radiação UV, prevenindo assim o desenvolvimento de câncer de pele (Brenner M. et al., 2008, The protective role of melanin against UV damage in human skin, Photochemistry and Photobiology 84(3): 539-549).

[133] O objetivo é reunir todos os dados usados, e também os resultados obtidos, a fim de realizar o teste de modulação de melanina em melanócitos humanos após exposição ao extrato de peregrina de acordo com a invenção por 5 dias.

[134] Protocolo: Os melanócitos humanos são cultivados em placas de 96 e 24 poços.

[135] O extrato de peregrina de acordo com a invenção atua nos melanócitos confluentes em concentrações de 5%, 2%, 1% e 0,1% por 5 dias. Um pré-teste de viabilidade com MTT após 24 horas possibilita avaliar a citotoxicidade e escolher as concentrações para o teste de modulação de melanina. Esta modulação é avaliada pela dosagem de melanina nos lisados celulares após 5 dias de exposição aos extratos. O controle negativo é realizado usando células em meio de cultura sem tratamento. O controle positivo para o teste de viabilidade é 0,5% de SDS. Para o teste de modulação da melanina, meios com e sem a-MSH são usados como controles negativos.

[136] Todas as condições são preparadas em meio de cultura e as células são subsequentemente incubadas a 36,5 °C / 5% de CO2 por 24 horas para o teste de citotoxidade e 5 dias para o ensaio de melanina.

[137] Aplicação das soluções de teste nos melanócitos: As concentrações de teste são colocadas em contato com os melanócitos confluentes em placas de 96 poços (teste de citotoxicidade) e placas de 24 poços (ensaio de melanina). Para cada concentração, o teste é realizado em três poços. As placas são incubadas por 24 horas ± 1 hora e 5 dias a 36,5 °C / 5% de CO2.

[138] Teste de viabilidade: A viabilidade celular é avaliada com o método MTT nas células após incubação por 24 horas com os produtos. Após incubação por 24 horas, os poços pretendidos são enxaguados uma vez com 200 µL de PBS. 50 µL de uma solução de MTT a 0,5 mg/mL são adicionados a cada poço e incubação é realizada por 3 horas a 36,5 °C / 5% de CO2. 150 µL de isopropanol são adicionados a cada poço. Após homogeneização, é feita uma leitura de absorbância a 550 nm. Para cada condição, a razão dos valores médios de densidade óptica das células para os valores médios de densidade óptica dos controles negativos determina a razão de viabilidade.

[139] Um valor de corte de viabilidade de 70% em relação ao valor de controle negativo é usado para classificar as substâncias de teste como citotóxicas ou não citotóxicas. Uma classificação “não citotóxica” é dada nos resultados in vitro para uma viabilidade > 70% e uma classificação “citotóxica” é dada para uma viabilidade < 70%.

[140] A concentração de 5% do extrato de acordo com a invenção provou ser citotóxica a 5% sob as condições de teste. As concentrações de 2%, 1% e 0,1% são assim usadas para o teste de modulação de melanina. A quantidade de melanina presente nas células é avaliada após a lise celular. Os resultados para a inibição da produção de melanina são dados abaixo.

[141] [Tabela 11]:

[142] Conclusão: O hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção inibe a produção de melanina in celullo, o que lhe confere um efeito despigmentante e uma propriedade de clareamento da pele.

Exemplo 10: Efeito do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção na modulação do ensaio de DKK1 e DKK3

[143] O envolvimento das interações entre melanócitos e fibroblastos na regulação da melanogênese é bem conhecido e tem sido intensamente estudado. Embora essas interações ainda não sejam totalmente compreendidas, elas são a causa da “brancura” das áreas palmoplantares e agora são usadas em cosméticos para o desenvolvimento de produtos despigmentantes. Yamaguchi et coll. (Yamaguchi Y. et al., 2004, Mesenchymal-Epithelial Interactions in the Skin: Increased Expression of Dickkopf by Palmoplantar Fibroblasts Inhibits Melanocyte Growth and Differentiation, Journal of Cell Biology 165(2): 275-285) demonstraram que um mensageiro solúvel produzido pelos fibroblastos das regiões palmoplantares foi capaz de modificar o programa de diferenciação dos melanócitos dessas regiões, levando à diminuição da produção de melanina. Este mensageiro foi identificado pela equipe como uma proteína chamada Dikkopf-1 (DKK-1).

[144] As vias de sinalização usadas pelo DKK-1 para produzir esses resultados estão agora claramente identificadas. Em virtude de sua ação antagônica sobre o receptor Wnt, o DKK-1 é de fato capaz de “desviar” as vias de sinalização intracelular ativadas pela ß-catenina, que são geralmente responsáveis pela regulação dos genes envolvidos na melanogênese. Yamaguchi et coll.também demonstraram que DKK-3, uma molécula semelhante a DKK-1, mas sem qualquer efeito sobre o receptor Wnt, pode desempenhar um papel regulador no efeito de DKK-1. De fato, quanto maior a quantidade de DKK-3 na vizinhança deste receptor Wnt, mais fracas serão as interações entre DKK-1 e este receptor. O aumento de DKK3 reduz os efeitos inibitórios de DKK-1 na melanogênese. Os estudos de Yamaguchi et coll. (cf. supra) sugerem que a identificação de agentes que tem uma influência na razão DKK1/DKK3 em culturas de fibroblastos dérmicos humanos normais de origem não palmoplantar possibilitaria controlar a produção de melanina usando melanócitos humanos não palmoplantares normais

[145] O objetivo deste estudo é avaliar o efeito do composto conhecido como “hidrolisado de peptídeos de peregrina” na síntese e liberação de DKK-1 em um modelo composto de fibroblastos humanos normais em cultura de monocamada.

[146] Protocolo: As células de fibroblastos humanos foram obtidas a partir de um doador de 68 anos. Para realizar os experimentos, os fibroblastos foram cultivados como uma cultura de monocamada até atingir a confluência. 100 nM de dexametasona foi usada como um indutor de referência da síntese e liberação de DKK-1.

[147] Os discos de pele foram incubados por 48 horas na ausência (controle) ou presença de produto de referência ou produto de teste: Hidrolisado de peptídeos de peregrina: 0,01%; 0,1% e 0,5% (v/v).

[148] No final da incubação, os meios de incubação foram removidos para realizar a medição de liberação de DKK-1.

[149] O composto de teste “hidrolisado de peptídeos de peregrina” foi diluído diretamente no meio de incubação de modo a atingir as várias concentrações descritas acima.

[150] Ao final do período de incubação de 48 horas, o DKK-1 liberado no meio de incubação foi quantificado por meio de um kit ELISA sensível específico.

[151] Ao final do período de incubação, as proteínas contidas nos lisados celulares foram quantificadas por meio de um método espectrocolorimétrico (método de Bradford).

[152] Os resultados são expressos como ng DKK-1 por mg de proteína (média ± S.D.).

[153] O nível de significância entre o “controle” e o “produto de referência” foi avaliado por meio do teste de Student (*: p < 0,05).

[154] O nível de significância entre o “controle” e o “produto de teste” foi avaliado por uma análise de variância uma via (ANOVA de uma via) seguida de um teste de Holm-Sidak (*: p < 0,05).

[155] Em nossas condições experimentais, o produto de referência conhecido como “dexametasona”, testado em 100 nm, aumentou significativamente a DKK-1 liberada em 181,8% (p < 0,01) em relação ao “controle”. Os resultados em relação à modulação do ensaio de DKK1 são dados abaixo.

[156] [Tabela 12]:

Estudo sobre DKK3

[157] O objetivo deste estudo é avaliar o efeito de compostos conhecidos como “hidrolisado de peptídeos de peregrina” na síntese e liberação de DKK-3 em um modelo composto de fibroblastos humanos normais em cultura de monocamada.

[158] As células de fibroblastos humanos foram obtidas a partir de um doador de 68 anos.

[159] Para realizar os experimentos, os fibroblastos foram cultivados como uma monocamada até atingir a confluência.

[160] As células de fibroblastos humanos foram obtidas a partir de um doador de 68 anos.

[161] Para realizar os experimentos, os fibroblastos foram cultivados como uma monocamada até atingir a confluência.

[162] Ao final do período de incubação de 48 horas, o DKK-3 liberado no meio de incubação foi quantificado por meio de um kit ELISA sensível específico.

[163] Ao final do período de incubação, as proteínas contidas nos lisados celulares foram quantificadas por meio de um método espectrocolorimétrico (método de Bradford).

[164] Os resultados são expressos como ng DKK-3 por mg de proteína (média ± S.D.).

[165] O nível de significância entre o “controle” e o “produto de referência” foi avaliado por meio do teste de Student (*: p < 0,05).

[166] O nível de significância entre o “controle” e o “produto de teste” foi avaliado por uma análise de variância de uma via (ANOVA de uma via) seguida de um teste de Holm-Sidak (*: p < 0,05). Os resultados em relação à modulação do ensaio de DKK3 são dados abaixo.

[167] [Tabela 13]:

[168] Conclusão: O hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção pode aumentar consideravelmente a produção de DKK1 e tende a reduzir a produção de DKK3 nas células humanas. Tem uma alta capacidade de diminuir a pigmentação da pele por meio do princípio de inibição palmoplantar, por meio de sua capacidade de aumentar consideravelmente DKK1 e diminuir significativamente DKK3, aumentando assim a razão DKK1/DKK3. O aumento dessa razão tem o efeito de limitar a via de diferenciação de pré- melanócitos/melanócitos; assim, o número de melanócitos operacionais diminui ao longo do tempo, reduzindo a capacidade da pele de se tornar colorida.

Exemplo 11: Efeito do hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção sobre a preservação de DNA

[169] A dinâmica dos comprimentos dos telômeros é muito importante para regular o tempo de vida replicativa nas células, em particular no caso de espécies que têm vida longa. O encurtamento dos telômeros e a atividade da telomerase são fatores importantes no envelhecimento e na tumorigênese (Shay, J.W., 2005, Senescence and Immortalization: Role of Telomeres and Telomerase, Carcinogenesis 26(5): 867-874). Os telômeros são sequências de nucleotídeos complexas que protegem as extremidades dos cromossomos da degradação, recombinação de fusão indesejável e ativação inadequada da resposta ao dano do DNA. Eles também desempenham um papel essencial na divisão celular e na estabilidade cromossômica. Há evidências cada vez maiores de que a estabilidade dos telômeros pode ser afetada por exposições ocupacionais e ambientais, uma vez que alguns desses fatores têm sido associados ao aumento da inflamação, estresse oxidativo, danos ao DNA, aberrações cromossômicas e alterações epigenéticas. Telômeros extremamente curtos e longos têm sido associados a doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares (CVD) e risco de câncer.

[170] A telomerase é uma ribonucleoproteína que catalisa a adição de repetições teloméricas às extremidades dos telômeros. Os telômeros são longas seções de sequências repetidas que cobrem as extremidades dos cromossomos e têm o papel de estabilizar o cromossomo. Em humanos, os telômeros são geralmente de 7 a 10 kb de comprimento e compreendem várias repetições da sequência -TTAGGG-.

[171] A telomerase não é expressa na maioria das células adultas e o comprimento dos telômeros diminui com os sucessivos ciclos de replicação. Após um certo número de ciclos de replicação, o encurtamento progressivo dos telômeros faz com que as células entrem em uma fase de crise dos telômeros, que por sua vez leva à senescência celular. Certas doenças estão associadas à perda rápida de telômeros, resultando em senescência celular prematura. Expressão do gene que codifica a proteína telomerase humana em células humanas (Blasco M., 2007, Telomere Length, Stem Cells and Aging, Nature Chemical Biology 3, pages 640-649) demonstrou conferir um fenótipo imortal, provavelmente contornando a via de senescência natural das células. Além disso, a expressão do gene da telomerase em células envelhecidas com telômeros curtos demonstrou produzir um aumento no comprimento dos telômeros e restaurar um fenótipo que geralmente está associado a células mais jovens.

[172] O objetivo deste estudo é avaliar o efeito do composto conhecido como “hidrolisado de peptídeos de peregrina” no encurtamento de telômeros em um modelo composto de fibroblastos humanos normais em cultura de monocamada. Sabe-se que o telômero corresponde a um relógio biológico. O comprimento dos telômeros diminui gradualmente com as divisões celulares, levando, em última análise, à incapacidade da célula de sofrer replicação. A medição do comprimento dos telômeros foi realizada por meio de PCR quantitativa e comparação com o comprimento dos telômeros entre as células nas passagens 2 e 5.

[173] Protocolo: As células de fibroblastos humanos foram obtidas a partir de um doador de 44 anos. Para realizar os experimentos, as células foram usadas na passagem 2 e 5. Os fibroblastos foram cultivados por três passagens consecutivas na ausência (controle) ou presença de uma concentração de teste crescente do hidrolisado de peptídeo de peregrina: 0,01%; 0,1% e 0,5% (v/v).

[174] Preparação do composto de teste: O composto de teste “hidrolisado de peptídeos de peregrina” foi diluído diretamente no meio de incubação de modo a atingir as várias concentrações descritas acima.

[175] Ao final da incubação, as células foram tripsinizadas. O DNA foi extraído a partir das células por meio de um kit de extração de DNA dedicado. O DNA foi quantificado por NanoDrop.

[176] O comprimento dos telômeros foi medido por PCR quantitativa (q- PCR). Para cada amostra, a variação no comprimento dos telômeros foi medida por quantificação relativa usando o gene SCR (referência de cópia única) como o gene de referência. Para cada amostra, uma q-PCR é realizada usando um conjunto de iniciadores de telômeros que reconhece e amplifica as sequências de telômeros e uma segunda q-PCR é realizada usando o conjunto de iniciadores de SCR que reconhece e amplifica uma região de 100 pb no cromossomo 17 humano e serve como uma referência para normalização de dados.

[177] Os resultados são expressos em unidades relativas correspondentes ao comprimento dos telômeros em relação às células na passagem 2 (média ± S.D.). O nível de significância entre “controle” nas passagens 2 e 5 foi avaliado por meio do teste t de Student (*p < 0,05). O nível de significância entre “controle” e “composto de teste” foi avaliado independentemente para cada produto por uma análise de variância de uma via (ANOVA de uma via) seguida de um teste de Holm-Sidak (*: p < 0,05).

[178] Resultados: Em nossas condições experimentais, o hidrolisado de peptídeos de peregrina testado a 0,05%, 0,1% e 0,5% (v/v) diminuiu significativamente o encurtamento dos telômeros em fibroblastos humanos normais.

[179] Encurtamento dos telômeros: inibição (em comparação com o controle) a 0,05% (v/v) + 8,9% (p < 0,05) e a 0,1% (v/v) + 15,1% (p < 0,01) e a 0,5% (v/v) + 16,6% (p < 0,01).

[180] [Tabela 14]:

[181] Conclusão: Em um contexto de multiplicação ou divisão normal de células humanas, o hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção demonstra uma capacidade para aumentar significativamente o comprimento dos telômeros. Os telômeros são as tampas envolvidas na proteção do material de DNA; aumentar o tamanho dos telômeros preserva a integridade do material de DNA ao longo do tempo. O aumento do comprimento dos telômeros está correlacionado com a capacidade de preservar o material de DNA. Desde o hidrolisado de peptídeo de peregrina pode aumentar esse comprimento, portanto, está envolvido na preservação do material genético humano (DNA).

Exemplo 12: Testes comparativos de vários produtos na hidratação da superfície da pele

[182] O estudo da corneometria permite medir o efeito hidratante de um produto na superfície da pele. A máquina usada é um corneômetro equipado com uma sonda que mede notavelmente a umidade da pele por impedanciometria. Um painel composto por seis pessoas (dois homens e quatro mulheres) testados em condições semelhantes de hidrometria e temperatura nas faces internas de seus antebraços. A face interna do antebraço esquerdo apresenta as zonas 1 e 2, e a face interna do antebraço direito apresenta as zonas 3 e 4.

[183] A zona 1 corresponde à zona de aplicação do gel hidratante de referência; a zona 2 corresponde à zona de aplicação do gel de referência + 2% do hidrolisado de peptídeos de acordo com a invenção; a zona 3 corresponde à zona de aplicação do gel de referência + 2% do hidrolisado de peptídeos com Moringa oleifera; a zona 4 corresponde à zona de aplicação do gel de referência + 2% de Purisoft® de acordo com a patente FR 3 076 460 da BASF Beauty Care Solutions.

[184] A quantidade de produto aplicado em cada zona é a mesma e os tempos de medição são os mesmos para cada uma das zonas. Um primeiro valor é obtido antes de aplicar o produto em cada zona de modo a determinar o estado de umidade zero da pele. A seguir, para cada zona e cada produto, uma primeira medição é feita 5 minutos após a aplicação do produto na zona, sempre pelo mesmo operador. Para concluir, uma medição final é feita 30 minutos após a segunda medição acima, novamente pelo mesmo operador.

[185] A combinação das diferenças observadas antes e após a aplicação não segue uma lei normal estudada em ANOVA (análise de variância). O valor obtido pela diferença entre as medidas antes e depois é, portanto, o parâmetro estudado. Os resultados obtidos constituem uma tendência qualitativa e não quantitativa dos valores obtidos.

[186] [Tabela 15]:

[187] Conclusão: A zona 2 apresenta um valor hidratante da pele positivo entre antes e depois da aplicação do produto contendo o extrato de acordo com a invenção, enquanto as zonas 3 e 4 contendo o extrato de Moringa oleifera de acordo com 2 modos de extração, apresentam valores negativos, ou seja, a pele fica menos hidratada após a aplicação dos produtos do que antes. O hidrolisado de peptídeos de acordo com a invenção possibilita manter o benefício da hidratação em um produto de aplicação tópica, que distingue o hidrolisado de peptídeos de peregrina de acordo com a invenção a partir dos outros extratos testados. A Figura 1 mostra os resultados obtidos.

Exemplo 13: Formulação de produtos de maquiagem

[188] [Tabela 16]:

Exemplo 14: Formulação do produto de lavagem

[189] [Tabela 17]:

Exemplo 15 - formulação de produto de cuidados

[190] [Tabela 18]:

Exemplo 16:

[191] Comprimido relaxante ou emagrecedor de 1g: 2% de extrato seco de acordo com a invenção (contendo 60% de hidrolisado de peptídeos em um suporte de inulina) + 47% de carbonato de cálcio contendo 200 UI de vitamina D + 25% de gluconato de magnésio + 23% de inulina + 3% de estearato de magnésio).

Exemplo 17:

[192] Pó de emagrecimento em uma cápsula de gel de 750 mg contendo 200 mg de cafeína, 200 mg de extrato seco de acordo com a invenção (contendo 60% de hidrolisado de peptídeos em um suporte de inulina), 200 mg de quitosana e 150 mg de carbonato de cálcio.)

Exemplo 18:

[193] Supressor de apetite & pó de emagrecimento em uma cápsula de gel de 750 mg contendo 200 mg de cafeína, 200 mg de extrato seco de acordo com a invenção (contendo 60% de hidrolisado de peptídeos em um suporte de inulina), 200 mg de quitosana e 150 mg de konjac (glucomannan).

Exemplo 19:

[194] Spray relaxante sublingual contendo 2% de extrato de acordo com o exemplo 1. Tintura-mãe Rhodiola a 1%, tintura-mãe de erva-cidreira a 1%, tintura-mãe de valeriana a 1%, tintura-mãe de espinheiro-alvar a 1%, extrato de cavalinha a 2%, ácido salicílico a 0,15%, sorbitol a 7% e água qs.

Exemplo 20:

[195] Creme antirrugas contendo 2% de extrato hidrolisado de acordo com o exemplo 1.

[196] [Tabela 19]:

Exemplo 21: Testes toxicológicos do hidrolisado de acordo com a invenção

[197] Preparação do hidrolisado de peptídeos de acordo com o exemplo 1: Sementes sem casca de Moringa peregrina (Forssk.) Fiori colhidos quando o fruto estava maduro foram secos para obter um teor de umidade interna inferior a 8% e preferencialmente cerca de 6%, e então prensados com uma prensa mecânica sem fim, de modo a separar o óleo do restante da semente a fim de obter, por um lado, o óleo virgem e, por outro lado, uma torta. A torta é então isolado na forma de rolos pré-cortados em pedaços de 1 a 2 cm. Seguindo o protocolo descrito no exemplo 1, o extrato líquido é obtido, que é usado na forma pura nos testes seguintes. 1. Determinação da atividade mutagênica na cepa bacteriana de Salmonella typhimurium (TA 100) - Teste de mutação reversa bacteriana

[198] O teste foi conduzido em três fases principais: - um experimento preliminar é realizado a fim de avaliar a citotoxicidade do elemento a ser testado e selecionar a faixa de dose para os experimentos subsequentes, - um primeiro experimento de genotoxicidade (Teste 1), com e sem ativação metabólica, com incorporação direta do sistema de teste e do teste (ou dos controles) em ágar mínimo, na faixa de dose definida pelo estudo preliminar, - um segundo experimento (Teste 2), com pré-incubação do sistema de teste e do elemento de teste (ou dos controles), com e sem ativação metabólica, com níveis de dose definidos pelo diretor do estudo após análise dos resultados do primeiro experimento. Esta segunda experiência foi realizada a fim de confirmar ou completar os resultados da primeira, em particular quando foram obtidos resultados equívocos ou negativos.

[199] As diluições do extrato de acordo com o exemplo 1 foram preparadas em água para realizar o teste de citotoxicidade.

[200] O referido teste foi realizado na cepa Salmonella typhimurium TA100 nas concentrações de 5000, 1600, 500, 160 e 50 µg/placa, com e sem S9-Mix.

[201] Os reagentes usados para preparar o S9-Mix foram preparados de acordo com as seguintes instruções.

[202] [Tabela 20]:

[203] As bactérias foram expostas ao extrato teste com e sem o sistema de ativação metabólica. O sistema metabólico usado é uma fração pós-mitocondrial suplementada com cofator (S9). Esta fração S9, uma fração microssomal de homogenato de fígado de rato Sprague-Dawley tratado com um indutor enzimático, é preparada de acordo com Maron, D.M. e Ames, B. N. (1983) e foi fornecido por Moltox TM. É armazenado a uma temperatura inferior a -70 °C. A fração microssomal S9 foi usada a uma concentração de 10% em S9-Mix. O protocolo aplicado foi conforme segue: • os seguintes foram introduzidos em três tubos de hemólise: • ensaio sem ativação metabólica: • 0,1 mL das várias concentrações dos elementos de teste; • 0,5 mL de tampão de fosfato estéril a 0,2 M, pH 7,4; • 2 mL de ágar superior para S. typhimurium; • 0,1 mL de inóculo bacteriano (TA100); • ensaio com ativação metabólica: • 0,1 mL das várias concentrações dos elementos de teste; • 2 mL de ágar superior para S. typhimurium; • 0,1 mL de inóculo bacteriano (TA100); • 0,5 mL de S9-Mix; • misture e despeje sobre a superfície do ágar de fundo previamente espalhado em placas de Petri; • incubar a 37 °C ± 2 °C por 48 a 72 horas.

[204] Esses ensaios foram realizados para cada teste: teste preliminar de citotoxicidade, teste 1 e teste 2. O controle não tratado, os controles negativos e os controles positivos produzidos durante o método de pré-incubação foram incubados por 20 a 30 minutos a 37 °C ± 2 °C antes de verter o ágar superior.

[205] O protocolo aplicado foi conforme segue: - introduzir o seguinte em quatro frações de 2 mL de ágar superior para S. typhimurium: 0,1 mL de tampão fosfato a 0,2 M, pH 7,4; 0,1 mL de solvente; 0,1 mL de S9-Mix; - ,1 mL da preparação do elemento de teste na concentração mais alta; - uma fração de 2 mL de ágar superior para S. typhimuriumé usado para verificar sua esterilidade; - misture e despeje sobre a superfície do ágar de fundo previamente espalhado em placas de Petri; - incubar a 37 °C ± 2 °C por 48 a 72 horas; - o teste é realizado em triplicata; - nenhum crescimento bacteriano deve ser observado.

[206] Para pelo menos cinco concentrações do extrato de teste, um teste sem ativação metabólica e um teste com ativação metabólica foi realizado.

Expressando e interpretando os resultados

[207] Muitos critérios possibilitam determinar se um resultado é positivo, notavelmente um aumento no número de revertentes correlacionado com a dose do item de teste ou um aumento reprodutível no número de revertentes em uma ou mais concentrações, com ou sem ativação metabólica.

[208] O elemento de teste é considerado mutagênico se, na conclusão das etapas de verificação, uma relação dose-efeito foi obtida de forma reprodutível em uma ou mais das cinco cepas com e/ou sem ativação metabólica. A mutagenicidade só é considerada para uma dada concentração quando o número de revertentes é pelo menos igual a duas vezes a taxa de reversão espontânea para as cepas TA98, TA100 e TA102 (R >2) e três vezes a taxa de reversão espontânea para as cepas TA1535 e TA1537 (R >3).

[209] O elemento de teste é considerado não mutagênico se, na conclusão do teste 1 e teste 2, a frequência de revertentes sempre permaneceu menor que o dobro da taxa de reversão espontânea para todas as concentrações do elemento de teste, para as cepas TA98, TA100 , e TA102 (R < 2) e menos de três vezes a taxa de reversão espontânea para as cepas TA1535 e TA1537 (R < 3), com e sem ativação metabólica, e desde que tenha sido verificado que a ausência do efeito mutagênico não foi relacionado com a toxicidade das concentrações testadas.

[210] O estudo preliminar não mostrou citotoxicidade do elemento de teste; consequentemente, essa faixa de concentração foi usada para o teste de genotoxicidade 1.

[211] Com base no resultado obtido para o teste 1, decidiu-se por usar a mesma faixa de diluição para o teste 2. A análise dos revertentes mostra que: - nenhum efeito citotóxico foi observado; - nenhuma concentração do extrato de teste apresentou razão R maior ou igual a pelo menos duas vezes a taxa de reversão espontânea para TA98, TA100 e TA102 ou três vezes a taxa de reversão espontânea para TA1535 e TA1537, com e sem ativação metabólica; - nenhuma resposta à dose foi observada, independentemente do sistema de teste ou das condições de teste.

[212] À luz dos resultados obtidos neste estudo, o hidrolisado de peptídeos de acordo com o exemplo 1 pode ser considerado como não tendo atividade mutagênica ou pró-mutagênica. 2. Teste in vitro de fototoxicidade 3T3 NRU

[213] O princípio do teste é baseado na comparação da citotoxicidade do hidrolisado de peptídeos de acordo com o exemplo 1 na presença e ausência de uma dose não citotóxica de UVA, em células em cultura. A citotoxicidade é avaliada ao determinar a viabilidade celular usando uma cepa vital: vermelho neutro, 24 horas após o tratamento com os elementos de referência e o extrato de M. peregrina de acordo com a invenção com ou sem irradiação UVA. As células usadas são fibroblastos de embrião de camundongo da linhagem Balb/c 3T3 clone 31 (ATCC - CCL163). O controle positivo é uma solução de cloropromazina (CAS No.: 69-09-0). O controle negativo é um diluente para o extrato de teste e para a referência (solução salina tamponada ± 1% de solvente). O hidrolisado de peptídeos foi testado em oito concentrações em pelo menos quatro poços de cultura por concentração estudada, na presença ou ausência de UVA. Os fibroblastos foram tripsinizados e duas placas de cultura de 96 poços foram semeadas com 100 µL de uma suspensão celular contendo 2x105 células/mL (ou seja, 2x106 células por poço) em meio de cultura completo.

[214] As placas semeadas foram incubadas por 24 horas a 37 °C e 5% de CO2. Ao final da incubação, a semiconfluência do gramado celular foi verificada. As diluições foram preparadas imediatamente antes de serem depositadas nas células. O pH da concentração mais alta foi medido; estava entre 6,5 e 7,8. O meio de cultura foi removido, cada poço foi pré-enxaguado cuidadosamente com 150 µL de PBS mantido à temperatura ambiente e depois tratado com 100 µL de cada extrato ou diluição de referência. As placas de cultura foram incubadas no escuro por 1 h ± 5 min a 37 °C e 5% de CO2. A irradiação foi realizada usando um irradiador solar Bio Sun (Vilber Lourmat RMX3W). A máquina Bio Sun é um sistema que controla a irradiação UV por meio de um microprocessador programável. O sistema segue continuamente a emissão de luz UV. A irradiação para automaticamente quando a energia distribuída é igual à energia programada. A irradiância espectral do dispositivo de teste foi medida na faixa de comprimento de onda a partir de 250 a 700 nanômetros com um espectrorradiômetro calibrado.

[215] Uma das duas placas foi irradiada com sua tampa a temperatura ambiente, e a outra placa foi protegida de UVA e foi mantida a temperatura ambiente durante a irradiação. Após a irradiação, o meio de tratamento foi aspirado e as células foram enxaguadas. 100 µL de meio de cultura completo foram então adicionados com cautela e as placas foram incubadas por 18 a 22h a 37 °C e 5% de CO2. No dia seguinte, a viabilidade celular (crescimento, morfologia, integridade da monocamada) foi avaliada por observações usando um microscópio de contraste de fase. O meio de cultura foi removido e cada poço foi pré-enxaguado e mantido à temperatura ambiente antes de ser tratado com 100 µL da solução de coloração. As placas foram devolvidas à incubadora por 3 horas sob as mesmas condições. A solução de coloração foi removida e as células foram enxaguadas, a solução de enxágue foi então removida e 150 µL de solução de dessorção foram adicionados a cada poço. As placas foram agitadas até que os cristais estivessem completamente dissolvidos. Os valores de absorbância foram medidos a 450 nm.

Validação de teste

[216] A sensibilidade de UVA das células é verificada aproximadamente a cada 10 passagens por avaliação de sua viabilidade após serem expostas a doses crescentes de irradiação. As células são cultivadas na densidade usada no teste. São irradiados no dia seguinte na dose de 2,5 e 9 J/cm2e a viabilidade celular é determinada um dia depois por meio do teste NRU. As células atendem aos critérios de qualidade se sua viabilidade após irradiação a 5 J/cm2de UVA é maior ou igual a 80% da viabilidade dos controles mantidos no escuro; na dose mais alta de 9 J/cm2de UVA, a viabilidade deve ser pelo menos igual a 50% da dos controles mantidos no escuro.

Resultados

[217] O controle negativo tem uma absorbância maior ou igual a 0,4. A cloropromazina, o controle positivo, tem um CI50 valor entre 0,1 e 2 µg/mL na presença de UVA e entre 7 e 90 µg/mL na ausência de UVA. Esses resultados possibilita validar o teste. A concentração do hidrolisado de peptídeos de torta de peregrina dando 50% de morte celular na presença ou ausência de UVA não pode ser estimado. A mortalidade nunca chegou a 50%. A concentração do hidrolisado de peptídeos de torta de peregrina dando 50% de viabilidade celular na presença ou ausência de UVA não pode ser estimado. A viabilidade é sempre superior a 50%.

[218] Conclusão: Sob as condições experimentais adotadas, o hidrolisado de peptídeos de torta de peregrina pode ser considerado como não fototóxico. 3. Avaliação do potencial irritante ocular pelo estudo da citotoxicidade in vitrousando o método de liberação de vermelho neutro na linhagem celular SIRC

[219] Este estudo in vitro é baseado na avaliação da citotoxicidade do hidrolisado de peptídeos de torta de peregrina determinando a concentração que resulta em 50% de morte celular (IC50) em uma monocamada de células por meio da técnica de liberação de vermelho neutro. As células usadas são fibroblastos de córnea de coelho SIRC livres de micoplasma (ATCC - CCL60).

[220] O hidrolisado de peptídeos foi diluído a 25% e 50% em soro fisiológico. Os fibroblastos foram tripsinizados e duas placas de cultura de 24 poços foram semeadas a uma taxa de 1 mL de uma suspensão de células contendo 2 x 105 células/mL em meio de cultura completo. As placas semeadas foram incubadas durante a noite a 37 °C e 5% de CO2. Ao final da incubação, a confluência do gramado celular foi verificada. A solução de coloração foi preparada a 0,5 mg/mL em meio de cultura completo. O meio de cultura foi removido; 1 mL da solução de coloração foi colocado em cada poço. As placas foram retornadas para a incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 3 horas ± 15 minutos. Após esse tempo de contato, a solução de coloração foi removida e substituída por 1 mL de meio de cultura completo por poço. As placas foram mantidas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos a fim de estabilizar o sistema antes do contato com o extrato ou a referência. Cada poço foi enxaguado com 2 mL de PBS, mantido em temperatura ambiente, e 500 µL de cada diluição de hidrolisado de peptídeos ou de referência onde foram então colocados em contato com o gramado celular. O tempo de contato foi de 60 segundos (30 segundos para o controle positivo). O tratamento foi realizado poço a poço com o cronômetro iniciado no momento em que o hidrolisado de peptídeos ou a referência foi depositado. A placa foi agitada manualmente durante todo o tratamento. Após 55 segundos (ou 25 segundos para o controle positivo), a diluição foi aspirada. Precisamente em 60 ou 30 segundos, cinco enxágues sucessivos foram realizados (5 x 2 mL de PBS mantido à temperatura ambiente). O sobrenadante foi aspirado após cada enxágue e após o enxágue final os poços permaneceram livres de meio enquanto aguardavam a fase de revelação. Após o tratamento completo da placa de cultura, 1 mL da solução de dessorção foi depositado em cada poço. A placa foi agitada por cerca de 15 minutos até que a coloração homogênea foi obtida. As soluções obtidas para cada poço de cultura foram recolhidas e divididas em dois poços de uma placa de 96 poços, ou seja, 150 µL/poço.

Resultados

[221] A concentração do hidrolisado de peptídeos levando a 50% de morte celular foi avaliada como >50%. A porcentagem de morte celular a 50% de hidrolisado de peptídeos foi avaliada como 17%.

[222] Conclusão: Sob as condições experimentais adotadas, a citotoxicidade do hidrolisado de peptídeos de torta de peregrina pode ser considerado como sendo de citotoxicidade insignificante. 4. Avaliação da compatibilidade cutânea de hidrolisado de peptídeos após aplicação única sob um curativo oclusivo por 48 horas sob controle dermatológico

[223] O objetivo deste estudo é avaliar o grau de compatibilidade cutânea do hidrolisado de peptídeos pelo teste epicutâneo, realizado na face ântero- externa do braço por 48 horas; e em geral avaliar a capacidade do hidrolisado de peptídeos em manter a pele em boas condições. 10 voluntários homens ou mulheres saudáveis, de 18 a 65 anos, sem pele seca ou sensível e livres de quaisquer lesões dermatológicas na área de tratamento foram incluídos no estudo. A compatibilidade cutânea do hidrolisado de peptídeo, preparado na forma de uma loção contendo 5% do extrato de peregrina de acordo com o exemplo 1 e 95% de uma mistura propanodiol/sorbitol, foi avaliada 48 horas após a aplicação inicial entre 30 e 40 minutos após a remoção do curativo. As reações cutâneas (eritema e edema) foram pontuadas de 0 a 3 de acordo com as seguintes escalas.

[224] [Tabela 21]:

[225] Quaisquer outras reações cutâneas (bolhas, pápulas, vesículas, ressecamento, descamação, aspereza, efeito sabão, etc.) foram avaliadas de acordo com a seguinte escala e relatadas descritivamente: - 0: nenhuma reação; - 0,5: muito leve; - 1: leve; - 2: moderado; - 3: pronunciado.

[226] No final do estudo, uma pontuação de irritação média (M.I.S.) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: [Fórmula 4] M.I.S. = Soma das reações cutâneas (Er + Oe + bolhas + pápulas + vesículas) / Número de voluntários analisados.

[227] O M.I.S. obtido possibilitou classificar o extrato de teste de acordo com a escala apresentada na tabela abaixo:

[228] Resultados: A Pontuação de Irritação Média (M.I.S) para o hidrolisado de peptídeos de torta de peregrina é igual a: 0.

[229] Conclusão: O hidrolisado de peptídeos de torta de peregrina pode ser considerado não irritante após 48 horas consecutivas de aplicação em 12 voluntários.

Conclusão geral dos testes

[230] Os resultados dos testes realizados acima são conclusivos e demonstram, para o hidrolisado de peptídeos de acordo com o exemplo 1: 1) os testes de irritação ocular e cutânea são negativos; 2) os testes de fototoxicidade são negativos; 3) os testes de mutagenicidade são negativos.

[231] A segurança do hidrolisado de peptídeos de acordo com a invenção é demonstrada e ideal para uso cosmético tópico em larga escala sem restrição em relação à população alvo.

Exemplo 22: Atividade despigmentante da pele do extrato de torta hidrolisado

[232] O objetivo do teste é de avaliar o potencial despigmentante e a aceitabilidade de um produto cosmético de acordo com a invenção após 28 dias de aplicação. O produto de teste é o creme antirrugas descrito no exemplo 20.

[233] População analisada: -número de voluntários incluídos e analisados: 23; -mulheres com uma idade média de 64 anos, entre 44 e 70 anos, com lentigos na face, pescoço, colo e/ou mãos.

[234] Procedimento adotado para o estudo: duas vezes ao dia, durante 28 dias, aplicar uma quantidade do tamanho de uma ervilha do produto na pele limpa do rosto, pescoço, decote e mãos e massagear até que o produto penetre completamente; evitar contato com os olhos; aplicar o produto anti-sol fornecido antes de qualquer exposição à luz solar.

[235] Critério de avaliação: - avaliação do potencial despigmentante: medições mexamétricas em três sítios (zona pigmentada tratada, zona não pigmentada tratada, zona de controle não pigmentada não tratada), em D1 e D28; - retorno dos voluntários em relação as sensações de desconforto; - fotografias para fins ilustrativos de um lentigo com o videodermoscópio C- Cube (Pixience SAS, Toulouse, França) em D1 e D28 (transmitidas na forma de folhas de contato por WeTransfer quando o relatório final foi disponibilizado); - aceitabilidade cosmética: questionário preenchido pelo voluntário em D28.

Resultados do estudo

[236] [Tabela 22]: *Teste de Wilcoxon para dados pareados: **S: Significativo (p < 0,05) NS: Não significativo (p > 0,05)

[237] A análise das medidas mexamétricas revelou uma diminuição estatisticamente significativa no índice de melanina nas duas zonas tratadas (áreas pigmentadas e não pigmentadas) no D28 em relação ao D1. As variações registradas entre D28 e D1 na zona não tratada foram verificados como estatisticamente insignificantes.

[238] Conclusão: Sob as condições do estudo, o produto de teste mostrou eficácia despigmentante significativa após 28 dias de uso.

Claims (6)

1. Extrato de torta de sementes de Moringa peregrina, caracterizado pelo fato de que compreende predominantemente um hidrolisado de peptídeo compreendendo derivados de aminoácidos, aminoácidos, peptídeos e glicopeptídeos com um peso molecular entre 100 Da e 6000 Da, preferencialmente entre 1500 Da e 5000 Da, mais preferencialmente entre 3000 Da e 4500 Da, em que o extrato é obtido a partir das sementes sem casca, quando o fruto da Moringa peregrina está maduro, por proteólise química a um pH superior a 13 por um tempo de 2 horas, com uma margem de mais ou menos 20%, a uma temperatura entre 16 e 25 °C.

2. Extrato de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda entre 0,3% a 3% de compostos voláteis, dos quais 50% destes compostos, ou seja, entre 0,15% a 1,5% do extrato, é constituído por compostos nitrílicos leves, principalmente isobutironitrila e metilbutanonitrila; dos quais 5% a 10% destes compostos, ou seja, entre 0,015% a 0,3% do extrato, é constituído por derivados de isotiocianato, principalmente isotiocianato de isopropila e isotiocianato de isobutila; dos quais 1% a 5% desses compostos, ou seja, entre 0,003% a 0,15%, é constituído de óleo essencial, principalmente de eucaliptol, mentol e benzaldeído.

3. Composição cosmética, caracterizada pelo fato de que compreende, como agente ativo, uma quantidade eficaz de um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina definido na reivindicação 1 ou 2, e um excipiente fisiologicamente aceitável, em que as quantidades do extrato de torta de sementes de Moringa peregrina variam em proporções a partir de 0,002% a 40% em peso em relação ao peso total da composição.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ser formulada para aplicação tópica na pele, e o extrato de torta de sementes de Moringa peregrina estar presente na composição a uma concentração de 0,002% a 20% em peso, preferencialmente de 0,01% a 10%, em relação ao peso total da composição.

5. Composição nutricosmética, caracterizada pelo fato de que compreende, como agente ativo, uma quantidade eficaz de um extrato de torta de sementes de Moringa peregrina definido na reivindicação 1 ou 2, e um excipiente fisiologicamente aceitável, em que a referida composição é formulada para ingestão, e o extrato de torta de sementes de Moringa peregrinaestá presente na composição a uma concentração de 0,01% a 100% em peso em relação ao peso total da composição.

6. Uso cosmético ou nutricosmético de uma composição definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de ser para melhorar a aparência da pele, membranas mucosas ou dos tegumentos, para prevenir e/ou combater o ressecamento da pele e das membranas mucosas, para prevenir e/ou combater os sinais de envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele, para promover o clareamento da pele e para promover o emagrecimento.