BR122024003219A2

BR122024003219A2 - Extrato de semente de moringa peregrina, composição cosmética ou nutricosmética compreendendo o mesmo e seu uso

Info

Publication number: BR122024003219A2
Application number: BR122024003219-8A
Authority: BR
Inventors: Elizabeth Dodinet; Vincent Bourgeteau
Original assignee: Agence Francaise Pour Le Developpement D'al Ula
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2024-03-19

Abstract

A invenção está relacionada a um extrato de sementes de Moringa peregrina rico no composto 2,5-diformilfurano, mais especificamente a um extrato da torta das referidas sementes, e a um processo de extração do extrato. A invenção também está relacionada a composições cosméticas ou nutricosméticas compreendendo o referido extrato e o uso das referidas composições para melhorar a aparência da pele, das membranas mucosas ou dos tegumentos, para relaxar, suavizar e desestressar a pele e para prevenir e/ou combater os sinais do envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele, e para prevenir manchas da idade.

Description

Campo técnico

[001] A invenção está relacionada ao campo cosmético e nutricosmético e, mais particularmente, ao campo de ingredientes ativos incluídos na formulação de composições para cuidados com a pele. A invenção está relacionada a um extrato de sementes de Moringa peregrina rico no composto 2,5-diformilfurano (DFF). A invenção também está relacionada ao processo para obtenção de um determinado extrato de sementes de Moringa peregrina, a composições cosméticas compreendendo tais extratos e, por fim, ao uso cosmético ou nutricosmético dessas composições para o cuidado da pele, do couro cabeludo e dos tegumentos.

Antecedentes técnicos

[002] As Moringaceae são uma família monogenérica (apenas um gênero, Moringa adans), um elemento da flora saharo-sindiana, constituída de 12 a 14 espécies segundo os autores, distribuídas da África Oriental até a Ásia. O gênero é convencionalmente dividido em três seções que, no entanto, não são confirmadas como monofiléticas pelas análises filogenéticas. As referidas análises revelaram, em vez disso, clados centrados em determinados caracteres morfológicos: paquicaules (“árvores-garrafa”); “árvores tuberosas” e aquelas que não são árvores-garrafa nem árvores tuberosas (“árvores delgadas”). A espécie Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, pertence ao terceiro grupo. Os escassos estudos genéticos sobre o gênero ou a família confirmam a realidade da espécie em relação às demais espécies do gênero, notavelmente no que diz respeito à Moringa indiana, Moringa oleifera Lam. (vide notavelmente os artigos: Oslon, M.E. 2002, Combining Data from DNA Sequences and Morphology for a Phylogeny of Moringaceae (Brassicales), Systematic Botany 27 (1): 55-73; Hassanein, AMA e Al-Soqee, AA, 2018, Morphological and genetic diversity of Moringa oleifera and Moringa peregrina genotypes, Horticulture, Environment and Biotechnology 59(2): 251-261). Um artigo recente sobre Moringa peregrina amostrada em vários locais da Arábia Saudita concluíram, usando marcadores ITS, que havia estabilidade genética da espécie (Alaklabi, A., 2015, Genetic diversity of Moringa peregrina species in Saudi Arabia with ITS sequences, Saudi Journal of Biological Sciences 22: 186-190) com, no entanto, um alto nível de variação genética intrapopulacional.

[003] A espécie Moringa peregrinaé encontrada nos ambientes rochosos do Iêmen, Omã, Arábia Saudita, África Oriental, Sudão, Etiópia, Eritreia, Somália e Djibuti. Sua presença no Irã parece limitada às províncias do sudeste, mas isso requer confirmação (PROTA14 = Munyanziza E. e Yongabi K.A., Vegetable oils/Oleaginous plants, Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, http://database.prota.org/protahtmL/moringa peregrina_fr.htm, acessado em 23/10/2019). No Oriente Médio e no Egito, a espécie é agora representada apenas por raras estações relictas dispersas (com exceção de algumas populações em altitude), principalmente nos setores da área do Sudão. Hoje a Moringa peregrinatambém é considerada rara e sob perigo no Sudão e no Iêmen. Em relação às outras espécies de seu clado, a Moringa peregrina ocupa os habitats mais áridos e inóspitos. Ela é aparentemente mais resistente à seca do que a Moringa oleifera, que é plantada comercialmente em larga escala nas zonas tropicais e subtropicais. Estudos recentes mostraram que o tamanho e a circunferência das sementes tiveram um impacto favorável no tempo de germinação e na taxa e velocidade de crescimento dos indivíduos jovens (Gomaa N.H. e Picó F.X., 2011, Seed germination, seedling traits, and seed bank of the tree Moringa peregrina (Moringaceae) in a hyper-arid environment, American Journal of Botany 98(6): 1024-1030), indicando um ajuste na alocação de recursos com relação à qualidade da semente e não à quantidade da mesma, o que permite que a Moringa peregrina reproduza eficientemente em ambientes abióticos extremos (hiperáridos). As sementes de Moringa peregrinatêm uma mesotesta central mais espessa, em termos de camada celular, do que as da Moringa oleifera.

[004] Existem alguns relatos históricos que tendem a indicar que o óleo de Moringa peregrina foi ativamente comercializado no alvorecer do Islã na região de Alula (Naseef, A.A.S.,1995, Al-'Ula, A study of Cultural and Social Heritage). O óleo produzido localmente a partir da Moringa peregrinaé hoje principalmente destinado ao consumo pessoal ou aos mercados locais. Na Arábia Saudita, as folhas eram tradicionalmente usadas como decocção para uso interno no tratamento de diabetes, doenças intestinais, doenças oculares e anemias (Abdel- Kader, M.S., Hazazi A.M. A., Elmakki O.A. E Alqasoumi S.I., 2018, A survey on the traditional plants used in Al Kobah village, Saudi Pharmaceutical Journal 26(6): 817-821) e como diurético, rubefaciente e adstringente (Aqeel A.A.M., Tariq M., Mossa J.S., Al-Yahya M.A. e Al-Said M.S., 1984, “Plants used in Arabian Folk medicine”, Report submitted to Saudi Arabian National Centre for Science and Technology, Riyadh, Saudi Arabia). Em Omã, o óleo, extraído pelas mulheres no final do verão, é usado para combater enxaquecas, febres, queimaduras, lacerações e fraturas, prisão de ventre e dores de estômago, e para combater dores musculares, ressecamento dos cabelos e dores de parto (Ghazanfar S.A., 1994, Handbook of Arabian Medicinal Plants, 1st ed., CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, EUA; Ghazanfar S.A., 1998, Plants of Economic Importance, cap. 15, em Ghazanfar, S.A. e Fisher, M. (ed.) Vegetation of the Arabian Peninsula. Geobotany 25, pages 241-264, Kluwer Academic Publishers, table 11.1, page 247 and 11.7 page 251). Ele também foi usado em composições perfumadas (Ghazanfar SA, 1998, page 259) e no Omã e no Iêmen como loção facial (Ghazanfar SA e Rechinger B., 1996, Two multi-purpose seed oils from Oman. Plants for Food and Medicine. Paper presented at the joint meeting of the Society for Economic Botany and International Society for Ethnopharmacology, July 1-7, 1996, London).

[005] Extratos provenientes de sementes de Moringa oleiferasão conhecidos no campo cosmético. Por exemplo, FR 296 879 revela um extrato de sementes inteiras (com tegumentos) de Moringa oleifera que contém óleo (incluindo triglicerídeos, ácidos graxos e lipídios polares) e polifenóis, e o uso do mesmo em composições cosméticas para combater o envelhecimento da pele. No referido documento, é a parte apolar da semente de Moringa oleifera que parece ser ativa, e mais particularmente a parte oleosa. A partir do FR 2 776 519, sabe-se também que os extratos proteicos das sementes de Moringa oleifera, conhecidas por seus efeitos clarificadores em águas turvas, têm efeito suavizante, condicionador fisiológico, hidratante, reestruturante e reparador, e atuam como agentes ativos antipoluição na pele e nas membranas mucosas. No referido documento, os princípios ativos são proteínas com pesos moleculares entre 6.500 e 8.800 Da, que são obtidas por extração aquosa da torta de Moringa oleifera. Também é conhecido o FR 3 076 460, que está relacionado ao uso de um extrato proteico de sementes de Moringa oleifera para o tratamento de pele e/ou membranas mucosas sensíveis, sensibilizadas, reativas, frágeis e/ou fragilizadas e/ou no tratamento e/ou prevenção de eritema, em particular assaduras causadas por fraldas infantis. No referido documento, o processo de extração permite a produção da maior fração de proteínas com pesos moleculares de cerca de 8800 Da. O KR2013/0088224 também revela o uso de um extrato de sementes inteiras germinadas de Moringa oleifera em cosméticos, em particular obtidas por extração usando um fluido supercrítico. O referido processo permite isolar aminoácidos apolares e carotenoides, que são descritos como agentes ativos para uso cosmético clareador. Todos os documentos citados acima estão relacionados ao uso da espécie Moringa oleifera; nenhum deles descreve o uso da espécie Moringa peregrina no campo cosmético. O XP055753955, 2011, por Kolheil et al., revela a extração com etanol, a partir das sementes inteiras de Moringa peregrina, de compostos polifenólicos bioativos, taninos, flavonoides, saponinas, esteróis insaturados e/ou triterpenos. O extrato obtido é armazenado a 4°C e tem efeito antioxidante. O XP055753970, 2018, por Abbas Alba et al., revela uma extração etanólica realizada por três ou mais dias em sementes inteiras de Moringa peregrina. Os filtrados são concentrados sob pressão reduzida a uma temperatura entre 45 e 50°C. O XP055754018, 2019, de Abou-Hashem et al.,revela uma extração etanólica realizada por 3x72 horas em sementes inteiras de Moringa peregrina. O extrato obtido é então filtrado e concentrado em um evaporador rotativo a uma temperatura de cerca de 45°C. O XP055754048, 2015, de Majali Ibrahim et al., revela uma extração com etanol com agitação por 30 minutos, nas sementes inteiras de Moringa peregrina, seguida de precipitação ao longo de 72 horas. Nenhum dos documentos citados acima revela a extração etanólica na torta de sementes de Moringa peregrina.

[006] Mais especificamente, para a espécie Moringa peregrina, sabe-se que certos compostos fenólicos e flavonoides obtidos das folhas ou da semente inteira de Moringa peregrina tem atividade antioxidante (Al-Dabbas M., 2017, Antioxidant activity of different extracts from the aerial part of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, from Jordan, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 30(6): 2151-2157). Esses compostos são extraídos com solventes como metanol, acetato de etila ou hexano das folhas ou das sementes inteiras. Parece que são as folhas que contêm a maior quantidade de compostos ativos.

[007] Assim, dependendo da espécie usada no gênero Moringa, pode ser observado que, dependendo da parte da planta (folha ou semente), da parte da semente (semente inteira ou não, com ou sem casca) e do processo de extração realizado, notavelmente da escolha do solvente, as moléculas extraídas demonstram ser diferentes. Já a composição do extrato condiciona a atividade biológica e consequentemente a eficácia cosmética.

[008] Diante do exposto, um problema que a invenção se propõe a solucionar é o de desenvolvimento de novos produtos baseados em um extrato da espécie M. peregrina do gênero Moringa que possam ser usados em cosméticos e que sejam fáceis de usar.

[009] Assim, a requerente revelou um novo extrato obtido a partir das sementes e mais especificamente da torta das sementes da espécie Moringa peregrina, que apresenta notavelmente atividade relaxante e antiestresse na pele, atividade antienvelhecimento e também atividade preventiva para manchas da idade. O extrato de acordo com a invenção é rico em 2,5- diformilfurano (DFF), também conhecido como 2,5-furanodicarboxaldeído. O extrato é obtido especificamente a partir das sementes ou, mais especificamente, da torta das sementes sem casca de Moringa peregrina, principalmente por extração alcoólica. O extrato de acordo com a invenção apresenta novidade em dois aspectos no campo cosmético em relação aos extratos do estado da técnica, em primeiro lugar devido às espécies de origem específicas usadas e em segundo lugar devido ao seu conteúdo composto específico.

[010] Pelo acordo intergovernamental de 10 de abril de 2018 entre o governo da República Francesa e o Reino da Arábia Saudita, a requerente, Agence Française Pour Le Développement d'AIUla (AFALULA) e a Comission Royale pour AlUlA (RCU) têm notavelmente o projeto conjunto de desenvolvimento da agricultura sustentável e da economia local, notavelmente para a produção local de produtos naturais derivados de plantas indígenas e de proteção da biodiversidade e dos direitos da região de Alula, no Reino da Arábia Saudita. O Reino da Arábia Saudita é membro do Protocolo de Nagoya desde 8 de outubro de 2020. No momento da redação da presente patente, os regulamentos de implementação em relação aos quais o Protocolo de Nagoya será integrado aos aspectos relevantes da lei local estão sendo examinados. Consequentemente, nesta fase, o Reino da Arábia Saudita não tem requisitos específicos no que diz respeito ao presente pedido de patente e ao Protocolo de Nagoya. Assim, na data do depósito do pedido de patente, não há exigência de atestado de conformidade quanto ao acesso a recursos genéticos.

Sumário

[011] Um primeiro objetivo da invenção é um extrato de sementes de Moringa peregrina que é rico no composto 2,5-diformilfurano. O composto 2,5- diformilfurano é um composto de natureza sacarídica raro no reino vegetal e que é sintetizado a partir do furfural através da síntese intermediária do 5- hidroximetilfurfural.

[012] Pela sua particularidade de possuir uma elevada concentração de 2,5- diformilfurano, o extrato de acordo com a invenção é único no gênero Moringa. Será demonstrado que a espécie Moringa peregrina tem um determinado perfil molecular diferente daqueles conhecidos das outras espécies do gênero, notavelmente da espécie Moringa oleifera, que a requerente pôde revelar.

[013] Um segundo objetivo da invenção é um processo para obter um extrato de sementes de Moringa peregrina de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas, nas quais: a) as sementes sem casca de Moringa peregrinasão coletadas e secas para se obter um teor de umidade interna inferior a 8%, b) as sementes secas são prensadas de modo a separar o óleo do restante da semente, para se obter a torta, c) a torta obtida na etapa b) é moída, d) o material moído obtido na etapa c) é disperso, em uma proporção de cerca de 25% em peso de material sólido em relação ao peso total usado, em um solvente predominantemente alcoólico, sendo o álcool escolhido a partir de etanol ou metanol opcionalmente com um cossolvente tal como um poliol ou água subcrítica, em uma proporção de 80% a 100% em peso de álcool em relação ao peso total do solvente; e) é realizada uma extração sólido-líquido, com agitação, a uma temperatura entre 16 e 30°C ao longo de um período de cerca de 2 horas, f) as fases líquida e sólida são separadas para remover a fase sólida e recuperar um extrato líquido da torta de Moringa peregrina, e g) opcionalmente, o extrato líquido de Moringa peregrina obtido é seco de modo a obter um extrato sólido de Moringa peregrina.

[014] Um terceiro objeto da invenção é uma composição cosmética ou nutricosmética compreendendo, como agente ativo, uma quantidade eficaz de um extrato de sementes de Moringa peregrina de acordo com a invenção e um excipiente fisiologicamente aceitável.

[015] Por fim, um quarto objeto da invenção é o uso cosmético ou nutricosmético de uma composição de acordo com a invenção, para melhorar a aparência da pele, das membranas mucosas ou dos tegumentos, para relaxar, suavizar e desestressar a pele e para prevenir e/ou combater os sinais de envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele e prevenir manchas da idade.

Breve descrição das figuras

[016] A invenção será mais bem compreendida e outros objetivos, detalhes, características e vantagens da mesma se tornarão mais evidentes a partir da seguinte descrição de várias modalidades particulares da invenção, fornecidas meramente para ilustração e sem limitação.

Descrição das modalidades

[017] Nesta descrição, salvo especificação em contrário, entende-se que quando uma faixa é dada, ela inclui os limites superior e inferior da referida faixa.

[018] Na presente invenção, as seguintes abreviaturas têm os significados dados abaixo: - MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (o teste MTT é um método rápido para contar células vivas); - SDS: Dodecil sulfato de sódio; - PBS: Solução Salina Tamponada com Fosfato; - ELISA: Ensaio de imunoabsorção enzimática; - PCR: Reação em cadeia da polimerase; - ANOVA: Análise de variação; e - MSH: Hormônio Estimulante de Melanócitos.

[019] Na presente invenção, aplicam-se as seguintes definições: - “extrato rico no composto 2,5-diformilfurano”: um extrato que contém uma quantidade do composto 2,5-diformilfurano superior à dos outros ingredientes identificados, ou seja, uma quantidade superior a 50% em relação à matéria seca do extrato total; - “quantidade eficaz”: a quantidade necessária de moléculas ativas para se obter o resultado desejado, a saber, permitindo obter nomeadamente a proteção da matriz extracelular da pele; - “aplicação tópica”: aplicar ou espalhar o princípio ativo de acordo com a invenção, ou uma composição que o contenha, sobre a superfície da pele, uma membrana mucosa ou os tegumentos; - “fisiologicamente aceitável”: adequado para uso tópico, em contato com a pele humana, ou para uso por outras vias de administração, por exemplo, por via oral ou por injeção na pele, sem qualquer risco de toxicidade, incompatibilidade, instabilidade ou resposta alérgica; - “torta”: a parte não oleosa da semente após a prensagem. Ela é o resíduo sólido da extração do óleo das sementes. É um coproduto da operação de moagem, o processo de fabricação do óleo. Geralmente representa de 50% a 75% da massa das sementes; - “sementes sem casca”: significa que a casca, ou pericarpo, das sementes colhidas é mantida ao redor das sementes; - “quando o fruto está maduro”: significa que o fruto está maduro, preferencialmente quando a vagem está no início da deiscência e passa de bege escuro a marrom e quando uma torção de 180° do quarto inferior da vagem provoca a abertura das válvulas; - “solvente predominantemente alcoólico”: significa que o solvente do tipo alcoólico pode compreender um cossolvente com características suficientes para extrair o princípio ativo, uma vez que o etanol puro 96° parece ser o solvente alcoólico mais adequado; - “cerca de”: uma margem de mais ou menos 10% a 20% em relação à dada informação (duração, porcentagem etc.); - “molécula ativa”, também referida como “princípio ativo”: a molécula de 2,5-diformilfurano extraída de acordo com o processo da invenção a partir das sementes de Moringa peregrina. Esta molécula é responsável pelas atividades biológicas descritas na presente invenção; - “agente ativo”: uma quantidade suficiente de um extrato de acordo com a invenção para se obter as atividades biológicas descritas. Dependendo se o extrato é líquido ou seco, e concentrado ou não, as quantidades do agente ativo podem variar em proporções de 0,002% a 20% em peso em relação ao peso total da composição; e - “sinais de envelhecimento da pele”: qualquer modificação na aparência externa da pele e dos tegumentos devido ao envelhecimento, por exemplo, rugas e linhas finas, pele enrugada, flacidez da pele, afinamento da pele, falta de elasticidade e/ou tonicidade da pele, pele opaca e sem brilho ou manchas de pigmentação na pele, descoloração do cabelo ou manchas nas unhas, mas também qualquer modificação interna da pele que não seja sistematicamente refletida por uma aparência externa modificada, por exemplo, qualquer degradação interna da pele após exposição à radiação ultravioleta (UV).

[020] Um primeiro objeto da invenção é um extrato de sementes de Moringa peregrina que seja rico no composto 2,5-diformilfurano. A molécula de 2,5-diformilfurano, também conhecida como 2,5-furanodicarboxaldeído, nunca foi caracterizada em um extrato de sementes de espécies do gênero Moringa. A espécie Moringa peregrina cresce em climas muito áridos. Assim, a sua capacidade de resistir à seca permitiu-lhe adquirir características únicas, que a requerente foi capaz de identificar através da utilização de um processo de extração adaptado às sementes inteiras ou, preferencialmente, à torta de sementes.

[021] No contexto da presente invenção, a parte da planta escolhida é a semente de Moringa peregrina. Sabe-se que sementes de Moringa peregrinasão usadas para a extração do óleo conhecido como óleo de peregrina (nome INCI: Moringa peregrina seed oil), que é usado regionalmente para consumo pessoal ou em diversas indicações medicinais tradicionais. A torta obtida após a remoção do óleo da semente é um resíduo que atualmente é usado principalmente para ração animal.

[022] De acordo com o primeiro objetivo da invenção, o extrato de Moringa peregrinaé obtido por extração sólido-líquido da torta de semente sem casca, com agitação, em uma proporção de cerca de 25% em peso de matéria sólida em relação ao peso total usado em um solvente predominantemente alcoólico, sendo o álcool escolhido a partir de etanol ou metanol opcionalmente com um cossolvente tal como um poliol ou água subcrítica, em uma proporção de 70% a 100% em peso de álcool em relação ao peso total do solvente, a uma temperatura entre 16 e 30°C por um período de cerca de 2 horas, e por separação das fases líquida e sólida para remover a fase sólida e recuperar um extrato líquido de semente de Moringa peregrina, sendo o referido extrato rico no composto 2,5-diformilfurano. Preferencialmente, o extrato de acordo com a invenção é obtido a partir da torta das sementes colhidas, quando o fruto da Moringa peregrinaestá maduro, após a extração do óleo de peregrina (nome INCI: Moringa peregrina seed oil).

[023] Vale salientar que o princípio ativo do extrato de acordo com a invenção, a saber o 2,5-diformilfurano, é uma molécula de polaridade mista que tem uma certa fragilidade. Assim, o extrato obtido da semente inteira sem casca deve passar por extração seletiva para obtenção de alta concentração de princípios ativos, usando solventes e cossolventes adequados e temperatura não superior a 30°C.

[024] Os cossolventes podem ser, por exemplo, éteres glicólicos (monopropileno ou dipropilenoglicol, propanodiol e outros derivados de propilenoglicol, derivados de etileno ou dietilenoglicol) glicerol, éter dimetílico isossorbida, ésteres metílicos ou etílicos ou propílicos de ácidos graxos; carbonato de dicaprilil, éter de dicaprilil, acetato ou propionato de alquila, acetona, metil ou etil cetona e monoterpenos, tais como α-pineno ou limoneno. Esses cossolventes podem ser misturados com o solvente primário (por exemplo, etanol ou metanol) em proporções de 0 a 30% (V/V).

[025] As condições de extração podem ser sob pressão atmosférica ou sob vácuo ou sob atmosfera inerte, mas preferencialmente no escuro a uma temperatura entre 16 e 30°C.

[026] Em uma modalidade preferencial de acordo com a invenção, o extrato é obtido a partir da torta de semente sem casca por extração sólido- líquido, com um solvente alcoólico, etanol 96°.

[027] Em ainda outra modalidade, o extrato líquido obtido é seco de modo a obter um extrato seco da torta de sementes de Moringa peregrina que contém mais de 50% em peso de 2,5-diformilfurano em relação ao peso total da matéria seca.

[028] O extrato seco da torta de sementes de Moringa peregrinacontém mais precisamente cerca de 55% em peso de 2,5-diformilfurano, 2,5% furfural, 1,2% miristato de isopropila, 4,7% ácido palmítico, 11,1% ácido oleico e 25,8% triglicerídeos em relação ao peso total da matéria seca.

[029] Um segundo objeto da invenção é um processo para obter um extrato de sementes de Moringa peregrina de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas, nas quais: a) as sementes sem casca de Moringa peregrinasão coletadas e secas para se obter um teor de umidade interna inferior a 8%, b) as sementes secas são prensadas de modo a separar o óleo do restante da semente, para se obter a torta, c) a torta obtida na etapa b) é moída, d) o material moído obtido na etapa c) é disperso, em uma proporção de cerca de 25% em peso de material sólido em relação ao peso total usado, em um solvente predominantemente alcoólico, sendo o álcool escolhido a partir de etanol ou metanol opcionalmente com um cossolvente tal como um poliol ou água subcrítica, em uma proporção de 70% a 100% em peso de álcool em relação ao peso total do solvente; e) é realizada uma extração sólido-líquido, com agitação, a uma temperatura entre 16 e 30°C ao longo de um período de cerca de 2 horas, f) as fases líquida e sólida são separadas para remover a fase sólida e recuperar um extrato líquido da torta de Moringa peregrina, e g) opcionalmente, quando o álcool é etanol, o extrato líquido de Moringa peregrina obtido é seco de modo a obter um extrato sólido de Moringa peregrina.

[030] Em uma modalidade preferencial, as sementes sem casca são coletadas, ou seja, as sementes cuja casca é mantida, quando o fruto está maduro e preferencialmente quando a vagem está no início da deiscência.

[031] Em uma modalidade preferencial, as sementes são secas para se obter um teor de umidade interna de cerca de 6%, sendo a secagem realizada preferencialmente em uma prateleira ventilada ao abrigo da luz solar, preferencialmente à sombra e ao ar livre.

[032] As sementes secas são então moídas extemporaneamente sendo prensadas a frio, o que permite que o óleo de peregrina (nome INCI: Moringa peregrina seed oil) seja separado mecanicamente do restante da semente comprimida, ou seja, da torta.

[033] A torta é então moída mecanicamente com qualquer tipo de moinho mecânico, como moinho de martelos, moinho de mangual, moinho de facas ou moinho de esmagamento/trituração.

[034] A extração é vantajosamente realizada sempre com agitação, permitindo assim a dispersão e homogeneização do sólido no líquido, melhorando a difusão do soluto no solvente.

[035] Para extrair predominantemente o composto de interesse, 2,5- diformilfurano, será preferencial um solvente alcoólico tal como etanol 96°, mas também pode ser usado metanol, com um cossolvente tal como um poliol ou água subcrítica. No final da extração, o material vegetal residual, deletado do composto de interesse, é vantajosamente separado da fase líquida por filtração de clarificação. De forma ainda mais preferencial, o solvente é etanol 96°. Um extrato líquido compreendendo entre 0,5% e 1,6% de matéria seca será vantajosamente obtido a partir da torta de sementes de Moringa peregrina, sendo esta matéria seca composta por pelo menos 50% de 2,5-diformilfurano, o que corresponde aproximadamente entre 0,25% e 0,8% em peso do peso total do extrato líquido.

[036] Em uma modalidade do processo de produção de acordo com a invenção, o extrato líquido de Moringa peregrina obtido é purificado por destilação, microfiltração, ultrafiltração e/ou nanofiltração para concentrar o composto de interesse do extrato, 2,5-diformilfurano, em relação aos materiais orgânicos também extraídos, notavelmente em relação ao restante do material extraído, tal como as substâncias graxas e derivados também extraídos. Essas etapas de purificação permitem concentrar o composto de interesse em detrimento de outros compostos extraídos como mencionado e também do solvente.

[037] Em outra modalidade do processo de produção de acordo com a invenção, o extrato líquido obtido é seco de modo a obter um extrato seco da torta de sementes de Moringa peregrina que contém mais de 50% em peso do composto de interesse, 2,5-diformilfurano, em relação ao peso total da matéria seca extraída.

[038] De acordo com uma modalidade vantajosa da invenção, quando o solvente é etanol, o extrato líquido de sementes de Moringa peregrina obtido é preferencialmente seco, por exemplo, por atomização, liofilização ou zeodration de modo a obter um extrato sólido da torta de sementes de Moringa peregrina, com o etanol tendo sido evaporado. A secagem pode ser realizada na presença de um suporte orgânico tal como maltodextrina, ciclodextrina ou inulina, ou na presença de um suporte mineral tal como filossilicato, silicato ou carbonato de magnésio e dais dos mesmos.

[039] A invenção também se refere ao extrato das sementes de Moringa peregrina que podem ser obtidas através do processo de produção de acordo com a invenção.

[040] Um terceiro objetivo da invenção é uma composição cosmética ou nutricosmética compreendendo, como agente ativo, uma quantidade eficaz de um extrato de sementes de Moringa peregrina de acordo com a invenção e um excipiente fisiologicamente aceitável.

[041] A composição de acordo com a invenção pode ser formulada na forma de várias preparações adequadas para administração tópica ou para administração oral.

[042] De acordo com uma primeira variante, as várias preparações são adequadas para administração tópica e incluem cremes, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, leites, pomadas, loções, óleos, bálsamos, soluções aquosas ou aquosas-alcoólicas ou glicólicas, soros, pós, adesivos, sprays ou qualquer outro produto para aplicação externa, por exemplo, dispositivos médicos ou produtos cosméticos têxteis.

[043] De acordo com uma segunda variante, as várias preparações são adequadas para administração oral; o extrato vegetal compreendendo o composto ativo 2,5-diformilfurano que pode ser incluído em uma composição alimentar ou em um suplemento alimentar. O suplemento alimentar pode ser na forma de cápsulas duras de gelatina ou cápsulas moles de gelatina ou vegetais no contexto da presente invenção. O referido suplemento alimentar pode, então, conter de 0,01% a 100% em peso do extrato vegetal. Mais preferencialmente, a quantidade de extrato vegetal é de 0,02% a 40% em peso e em particular de 0,2% a 20% em peso em relação ao peso total da composição.

[044] No contexto de um uso alimentar, para fins nutritivos ou cosméticos (cosmetoalimentares ou nutricosméticos), a composição será vantajosamente formulada na forma de uma preparação adequada para administração oral. Ela não pode conter nenhum excipiente e pode ser constituída, na sua totalidade, pelo extrato vegetal compreendendo o composto ativo 2,5-diformilfurano.

[045] De acordo com uma modalidade preferencial, as composições de acordo com a invenção são mais particularmente destinadas à administração tópica. Estas composições devem, assim, conter um meio cosmeticamente aceitável, ou seja, um meio compatível com a pele e os tegumentos, e abranger todas as formas cosméticas. Estas composições podem ser notavelmente na forma de cremes, emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo ou emulsões múltiplas, soros, soluções, suspensões, géis, leites, loções, sticks ou mesmo pós, e podem ser adequadas para aplicação na pele, nos lábios e/ou nos tegumentos. Essas composições compreendem os excipientes necessários para sua formulação, como solventes, emolientes, espessantes, diluentes, tensoativos, antioxidantes, agentes bioativos, corantes, conservantes e fragrâncias. Eles podem ser usados como produtos de cuidados com a pele e/ou como produtos de maquiagem para a pele.

[046] A composição de acordo com a invenção pode, em particular, consistir em uma composição de tratamento capilar, e notavelmente um xampu, um condicionador de cabelo, uma loção de tratamento, um creme ou gel para pentear, uma loção de reestruturação capilar, uma máscara etc. A composição cosmética de acordo com a invenção pode ser usada principalmente em tratamentos envolvendo uma aplicação que pode ou não ser seguida de enxágue, ou alternativamente na forma de um xampu. A composição de acordo com a invenção pode ser vantajosamente usada em tratamentos anticaspa. Também pode ser na forma de um corante ou rímel para ser aplicado com pincel ou pente, em particular nos cílios, nas sobrancelhas ou no cabelo.

[047] As composições de acordo com a invenção também compreendem quaisquer aditivos comumente usados no campo de aplicação previsto e também os adjuvantes necessários para sua formulação, tais como solventes, espessantes, diluentes, antioxidantes, corantes, protetores solares, agentes autobronzeadores, pigmentos, cargas, conservantes, fragrâncias, absorventes de odores, ativos cosméticos ou farmacêuticos, óleos essenciais, vitaminas, ácidos graxos essenciais, tensoativos, polímeros formadores de filme etc.

[048] O INCI Dictionary & Handbook (“International Nomenclature of Cosmetic Ingredients" (13gedição, 2010) 13th edition, 2010) published by The Personal Care Products Council Inc., Washington, D.C.) descreve uma ampla variedade, sem limitação, de ingredientes cosméticos e farmacêuticos comumente usados na indústria de cuidados com a pele, que são adequados para uso como ingredientes adicionais nas composições de acordo com a presente invenção.

[049] Em qualquer caso, um técnico no assunto terá o cuidado de garantir que esses adjuvantes e suas proporções sejam escolhidos de tal modo que as propriedades vantajosas desejadas da composição de acordo com a invenção não sejam adversamente afetadas.

[050] De acordo com uma modalidade vantajosa da invenção, a quantidade de extrato vegetal na composição de acordo com a invenção é de 0,002% a 20% em peso e, em particular, de 0,001% a 10% em peso em relação ao peso total da composição.

[051] Por fim, um quarto objetivo da invenção é o uso cosmético ou nutricosmético de uma composição de acordo com a invenção, para melhorar a aparência da pele, das membranas mucosas e dos tegumentos, para relaxar, suavizar e desestressar a pele e para prevenir e/ou combater os sinais de envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele e prevenir manchas da idade.

[052] De acordo com uma modalidade, o propósito do uso de acordo com a invenção é mais particularmente relaxar, acalmar e desestressar a pele e combater os sinais de envelhecimento da pele.

[053] De acordo com outra modalidade, o propósito do uso de acordo com a invenção é evitar o aparecimento de manchas da idade.

[054] Embora a invenção tenha sido descrita em relação a várias modalidades particulares, é bastante óbvio que ela não se limita de forma alguma às mesmas e engloba todos os equivalentes técnicos dos meios descritos e também combinações dos mesmos, se estiverem dentro do contexto da invenção.

[055] O uso do verbo “conter”, “compreender” ou “incluir” e suas formas conjugadas não exclui a presença de elementos ou etapas diferentes daquelas indicadas em uma reivindicação.

[056] Nas reivindicações, qualquer sinal de referência entre parênteses não deve ser interpretado como uma limitação da reivindicação.

Exemplos Exemplo 1: Preparação de um extrato vegetal a partir da torta de Moringa peregrina

[057] Sementes sem casca de Moringa peregrina (Forssk.) Fiori colhidas quando os frutos estavam maduros foram secas para se obter um teor de umidade interna inferior a 8% e preferencialmente cerca de 6%, e depois prensadas com uma prensa mecânica de parafuso sem fim, de modo a separar o óleo do restante da semente para se obter, por um lado, o óleo virgem e, por outro, uma torta. A torta é então isolada na forma de rolos pré-cortados em pedaços de 1 a 2 cm. Na torta pré-aquecida por 10 minutos a 55°C, é realizada uma maceração e extração com etanol 96° pré-aquecido por 10 minutos a 55°C em uma proporção de 25%/75% (m/m), a mistura é cisalhada com um misturador por 15 minutos e depois deixada agitar com o impulsor por 2 horas a uma temperatura entre 16°C e 30°C. O produto é então filtrado através de um funil de Büchner sob vácuo para se obter um filtrado amarelo-claro que contém 1,15% de matéria seca. O extrato líquido obtido é referido a seguir como o “extrato de peregrina de acordo com a invenção"ou o “extrato de peregrina” ou o “extrato de torta de peregrina”. Esse extrato líquido é posteriormente usado nos vários testes de eficiência.

[058] Esse extrato de peregrina de acordo com a invenção contém 1,15% de matéria seca, incluindo (resultados expressos em relação à matéria seca (MS)): [Tabela 1]:

[059] O extrato seco descrito acima é obtido através da um método gravimétrico baseado na massa antes da e depois da evaporação presente no extrato líquido.

[060] O 2,5-Furandicarboxaldeído ou 2,5-diformilfurano é o princípio ativo deste extrato. Ele foi analisado por um método cromatográfico, e mais precisamente por cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização de chama.

[061] O furfural foi analisado por um método idêntico.

[062] O miristato de isopropila foi analisado por um método idêntico.

[063] Os ácidos palmítico e oleico foram analisados por um método idêntico.

[064] Os triglicerídeos foram isolados por ultracentrifugação.

Exemplo 2: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção como um antioxidante

[065] O objetivo deste estudo é avaliar a modulação da atividade antioxidante pelo extrato de peregrina em um modelo colorimétrico acelular in vitro usando o radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e também o antioxidante de referência, o ácido ascórbico. O método usado é conhecido como inibição. Ele se baseia na degradação do radical oxidante DPPH de cor violeta, que absorve a 540 nm, tendo como antioxidante de referência o ácido ascórbico. Esta reação serve como controle positivo e leva à formação do composto DPPH que é incolor ou mesmo amarelo-claro. O extrato de peregrina de acordo com a invenção e o produto de referência “ácido ascórbico” são colocados em contato com a solução de DPPH por 30 minutos a 40°C. A atividade antioxidante é então avaliada medindo-se a absorbância a 540 nm. A modulação dessa atividade é expressa como uma porcentagem de estimulação da atividade antioxidante pelo agente ativo de teste, tendo como referência a atividade antioxidante máxima obtida na presença de ácido ascórbico (T+).

[066] Protocolo: Uma solução de DPPH é incubada por 30 minutos a 40°C, na ausência (controle) ou na presença do extrato de peregrina de acordo com a invenção (T+) e em concentrações decrescentes da amostra de teste. Ao final do período de incubação, a atividade antioxidante na presença do produto de referência e na presença ou ausência do extrato de peregrina foi revelada por coloração após 30 minutos a 40°C. Ela foi assim avaliada medindo-se a absorbância do meio reacional a 540 nm. Para cada concentração testada, a modulação da atividade antioxidante com o produto de teste é calculada de acordo com a fórmula a seguir: [Fórmula 1]: Modulação percentual da atividade antioxidante = 100 x [(OD540 Controle - OD540 Produto de teste)/OD540 Produto de referência].

[067] Se o resultado for negativo, o produto de teste será considerado oxidante; se o resultado for positivo, a porcentagem será expressa como estimulação da atividade de eliminação de radicais livres. Os resultados obtidos são dados abaixo: [Tabela 2]:

[068] Conclusão: o extrato de peregrina de acordo com a invenção é capaz de proteger contra os radicais livres: ele possui propriedades antioxidantes significativas a e acima de uma concentração de 1%.

Exemplo 3: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção como um inibidor de metaloprotease

[069] O objetivo deste estudo é avaliar a modulação da atividade inibidora de metaloproteases pelo extrato de peregrina de acordo com a invenção em um modelo acelular in vitro usando uma colagenase tipo I e uma hialuronidase, um complexo de substrato e um cromóforo, a ninidrina. Uma solução tamponada de colagenase tipo I e hialuronidase reage com um complexo de substrato específico e o transforma para formar um composto capaz de ativar um cromóforo por incubação a 80°C por 15 minutos. As atividades da colagenase e da hialuronidase podem assim ser avaliadas medindo-se a absorbância a 565 nm. A amostra é colocada em contato com a solução de colagenase e hialuronidase juntamente com o complexo de substrato enzimático a 37°C por 5 minutos. O substrato transformado com as enzimas é capaz de ativar o cromóforo por incubação a 80°C por 15 minutos. As atividades da colagenase e da hialuronidase na presença/ausência da amostra são então avaliadas medindo-se a absorbância a 565 nm. A modulação dessa atividade é expressa como uma porcentagem de inibição ou de ativação da atividade da colagenase e da hialuronidase na ausência do agente ativo, ou seja, apenas na presença do substrato enzimático.

[070] Protocolo: Uma solução das enzimas colagenase tipo I e hialuronidase é incubada em seu substrato por 5 minutos, na ausência ou presença do extrato de peregrina testado de acordo com a invenção. As soluções são então colocadas em contato com o cromogênio ninidrina, seguido de incubação por 15 minutos a 80°C. Ao final do período de incubação, a atividade das enzimas colagenase e hialuronidase com e sem o produto de teste ou de referência foi avaliada medindo-se a absorbância do meio de reação a 565 nm. Para cada concentração testada, a modulação das atividades enzimáticas da colagenase e da hialuronidase com o produto de teste é calculada de acordo com a fórmula a seguir: [Fórmula 2]: Modulação percentual da atividade enzimática da colagenase/hialuronidase = 100 x [(OD produto de teste ou de referência - OD colagenase/hialuronidase sozinha)/OD colagenase/hialuronidase sozinha].

[071] Se o resultado for negativo, a porcentagem é expressa como inibição enzimática; se o resultado for positivo, a porcentagem é expressa como ativação enzimática. Os resultados da inibição da metaloprotease com o extrato de peregrina de acordo com a invenção são dados abaixo: [Tabela 3]:

[072] Conclusão: O extrato de peregrina de acordo com a invenção dá origem a uma forte inibição da metaloprotease (colagenase/hialuronidase) de 62% a níveis muito baixos de 0,01%. O extrato de peregrina de acordo com a invenção é capaz de inibir fortemente essas metaloproteases e tem um bom potencial para proteger a matriz extracelular da pele com grande eficácia e, através desta inibição, revela um efeito antienvelhecimento.

Exemplo 4: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção na inibição das enzimas histona desacetilase (HDAC) e sirtuína I

[073] O objetivo deste estudo é demonstrar a atividade inibitória do extrato de peregrina de acordo com a invenção nas enzimas HDACs e sirtuína I. Uma solução tamponada de HDACs e sirtuína I reage com um substrato por 20 minutos a 37°C e o transforma para formar um composto que fica corado na presença de um revelador após incubação a 37°C por 10 minutos. A atividade de desacetilação máxima das sirtuínas pode assim ser avaliada medindo-se a absorbância a 405 nm. O extrato de peregrina de acordo com a invenção ou o produto de referência “inibidor de tricostatina A (STA) 1 μM” são colocados em contato com a solução de sirtuínas juntamente com o substrato enzimático por 20 minutos a 37°C, e o substrato transformado com a enzima é corado adicionando-se um revelador. A atividade de desacetilação das HDACs e sirtuína I na presença do agente ativo é então avaliada medindo-se a absorbância a 405 nm. A modulação dessa atividade é expressa como uma porcentagem de inibição ou ativação da atividade máxima das HDACs e da sirtuína I na ausência do agente ativo, ou seja, apenas na presença do substrato para as enzimas HDAC e sirtuína I.

[074] Protocolo: Uma solução de enzimas sirtuínas é incubada em seu substrato por 20 minutos na ausência (controle) ou presença do produto de referência, ou de concentrações crescentes dos produtos teste. O extrato de peregrina de acordo com a invenção é testado nas seguintes concentrações: 2%; 1%; 0.1% (V/V). Ao final do período de incubação, a atividade das enzimas sirtuínas com e sem o produto de teste ou de referência foi revelada por coloração com uma solução reveladora (10 minutos a 37°C) e avaliada medindo se a absorbância do meio reacional a 405 nm. Para cada concentração testada, a modulação da atividade desacetilante das enzimas histona desacetilase e sirtuína I com o produto de teste é calculada de acordo com a fórmula a seguir: [Fórmula 3]: Modulação percentual da atividade enzimática da sirtuína = 100 x [(OD405 produto de teste ou de referência) - (OD405 HDACs e sirtuína I sozinha)]/OD405 sirtuínas sozinhas.

[075] Se o resultado for negativo, a porcentagem é expressa como inibição da reação enzimática; se o resultado for positivo, a porcentagem é expressa como ativação da reação enzimática. Os resultados para a inibição das enzimas histona desacetilase (HDAC) são dados abaixo: [Tabela 4]:

[076] Conclusão: A 2%, o extrato de peregrina de acordo com a invenção mostra inibição significativa de HDAC; essa inibição reflete a capacidade de promover a autoproteção das células da pele contra a oscilação genética, notavelmente associada ao processo de envelhecimento. Assim, o extrato parece ser útil contra uma das oscilações genéticas mais comuns na superfície da pele, a fibrose, que se manifesta pelo aparecimento de “marcas na pele” (protuberâncias fibróticas). O extrato pode interferir vantajosamente na fibrose na superfície da pele e, assim, prevenir o envelhecimento da pele.

Exemplo 5: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção para modular a atividade anti-inflamatória da enzima fosfolipase-A2

[077] O objetivo deste estudo é avaliar a modulação da atividade anti- inflamatória da enzima fosfolipase-A2 por uma ou mais amostras em um modelo acelular in vitro por meio do “Kit de Ensaio de Triagem de Inibidor de SPLA2 (tipo V)”. A fosfolipase-A2 é uma enzima chave a montante do processo inflamatório que é desencadeado pela cascata araquidônica. Uma solução tamponada de fosfolipase-A2 reage com um substrato específico, diheptanol tio-PC, e o transforma em um composto que se liga a um cromógeno, DTNB, com agitação à temperatura ambiente. A atividade da fosfolipase-A2 pode assim ser avaliada medindo-se a absorbância a 413 nm. O extrato de peregrina de acordo com a invenção ou o produto inibidor de referência “tioeteramida-PC” são colocados em contato com a solução de fosfolipase-A2 ao mesmo tempo que o substrato enzimático. O substrato transformado pela enzima é corado por meio do cromógeno DTNB por agitação à temperatura ambiente. A atividade do extrato de peregrina de acordo com a invenção ou do produto de referência é então avaliada medindo-se a absorbância a 413 nm. A modulação dessa atividade é expressa como uma porcentagem de inibição ou de ativação da atividade da fosfolipase-A2 na ausência do agente ativo, ou seja, apenas na presença do substrato enzimático (diheptanol tio-PC).

[078] Protocolo: Uma solução da enzima fosfolipase-A2 é incubada em seu substrato, diheptanol tio-PC, na ausência ou presença do inibidor de referência e do extrato de peregrina de acordo com a invenção, testado nas seguintes condições: 2%; 1%; 0,1% (V/V), e o cromogênio DTNB é então incorporado, seguido de incubação por 15 minutos a 25°C. Ao final do período de incubação, a atividade da enzima fosfolipase-A2 com e sem o produto de teste ou o produto de referência é avaliada medindo-se a absorbância do meio de reação a 413 nm. Para cada concentração testada, a modulação da atividade enzimática da fosfolipase-A2 com o produto de teste é calculada de acordo com a fórmula a seguir: [Fórmula. 4]: Modulação percentual da atividade enzimática da fosfolipase- A2 = 100 x [(OD405 produto de teste ou produto de referência - OD405 sPLA2 sozinho)/OD405 sPLA2 sozinho].

[079] Se o resultado for negativo, a porcentagem é expressa como inibição enzimática; se o resultado for positivo, a porcentagem é expressa como ativação enzimática. Os resultados para a modulação da atividade anti-inflamatória da enzima fosfolipase-A2 são dados abaixo: [Tabela 5]:

[080] Conclusão: O extrato de peregrina de acordo com a invenção gera uma inibição leve e estável de PLA2 a e acima de uma dose de 0,1%, mas mais preferencialmente a 1% ou 2%. Isso significa que o extrato de peregrina de acordo com a invenção tem a capacidade de provocar uma redução muito precoce da cascata araquidônica/cascata da inflamação; este extrato tem assim um bom potencial calmante ou relaxante para a pele.

Exemplo 6: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção na inibição da ação da endotelina-1

[081] A endotelina é o vasoconstritor mais potente conhecido no corpo humano. Além disso, a depleção de endotelina também é conhecida por criar um efeito vasodilatador [Hirata, Y. et al., 1988, Cellular mechanism of action by a novel vasoconstrictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 154: 3, pages 868-875] [Shalinkumar P. et al., 2018, H2S Mediates the Vasodilator Effect of Endothelin- 1 in the Cerebral Circulation. American Journal of Physiology. Heart Circulatory Physiology, 315, pages 1759-1764].

[082] O objetivo é testar a endotelina tipo 1 em células endoteliais microvasculares humanas após exposição por 24 horas ao extrato de peregrina de acordo com a invenção.

[083] Protocolo: As células endoteliais microvasculares humanas foram fornecidas pela empresa PELOBiotech e cultivadas em placas de 96 poços de acordo com os procedimentos de produção do fornecedor. Os extratos são deixados para atuar em várias concentrações nas células endoteliais a 80% de confluência por 24 horas, e a endotelina-1 nos sobrenadantes das células é então quantificada usando o kit PicoKine de ELISA (EDN1). Um teste de viabilidade é realizado previamente para definir as doses não tóxicas a serem usadas no ensaio de endotelina-1. O controle negativo é realizado usando células em meio de cultura sem tratamento. O controle positivo no teste de viabilidade é SDS a 0,5%. Todas as condições são preparadas em meio de cultura e as células são subsequentemente incubadas a 36,5°C/CO2 a 5% por 24 horas. h) Aplicação das soluções de teste nas células endoteliais

[084] Os produtos de teste são colocados em contato com células endoteliais à subconfluência em placas de 96 poços. Para cada concentração, o teste é realizado em três poços. As placas são incubadas por 24 horas ± 1 hora a 36,5°C/CO2 a 5%. i) Teste de viabilidade

[085] A viabilidade celular é avaliada com o método MTT nas células após incubação com os produtos. Após incubação por 24 horas, os sobrenadantes são recuperados e armazenados a -20°C para os ensaios. Os poços são então enxaguados uma vez com 200 μL de PBS. 50 μL de uma solução de MTT de 0,5 mg/mL são adicionados em cada poço: incubação por 3 horas a 36,5°C/CO2 a 5%. 100 μL de isopropanol são adicionados em cada poço. Após homogeneização, é feita uma leitura de absorbância a 550 nm. Para cada condição, a razão dos valores médios de densidade óptica das células para os valores médios de densidade óptica dos controles negativos determina a razão de viabilidade. j) Ensaio de endotelina-1

[086] O ensaio é realizado usando o kit ELISA: [Tabela 6]:

[087] Conclusão: O teste de viabilidade realizado ao final do tratamento não apresentou efeitos tóxicos para as concentrações analisadas. O ensaio de endotelina-1 é realizado nos sobrenadantes celulares em concentrações não tóxicas. A quantidade de endotelina-1 para cada condição é analisada usando o kit ELISA. Para as células de controle negativo, os valores são da ordem de 134,94 pg/mL. Para as células tratadas com várias concentrações de extratos, os valores são de 63,14 pg/mL (com 5% do extrato de acordo com a invenção) a 101,06 pg/mL (com 0,1% do extrato de acordo com a invenção), o que mostra inibições muito significativas a e acima de 0,1% do extrato de acordo com a invenção com cerca de 25% de inibição da produção de endotelina tipo 1 e até 53% de inibição com 5% do extrato de acordo com a invenção.

Exemplo 7: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção na estimulação da atividade da telomerase

[088] Os telômeros são complexos que protegem o DNA, localizados nas extremidades dos cromossomos lineares, promovendo a estabilidade cromossômica. A falta de telômeros em humanos está se tornando um marcador prognóstico do risco e progressão da doença e da mortalidade prematura em muitos tipos de câncer, notavelmente de mama, próstata, cólon, bexiga, cabeça e pescoço, pulmão e células renais [Ornish D., 2008, Increased Telomerase Activity and Comprehensive Lifestyle Changes: a Pilot Study, Lancet Oncology 9, pages 1048-1057]. O encurtamento dos telômeros é neutralizado pela enzima celular telomerase.

[089] O objetivo do estudo é avaliar o efeito do composto conhecido como “extrato de peregrina de acordo com a invenção” sobre a atividade da telomerase em um modelo composto por queratinócitos humanos adultos em um baixo nível de passagem em cultura de monocamada.

[090] Protocolo: Os queratinócitos humanos foram obtidos de um doador de 49 anos. Para realizar os experimentos, os queratinócitos foram usados em um nível de passagem baixo (isto é, passagem de isolamento celular número 2). As células foram cultivadas como uma monocamada até atingirem cerca de 75% de confluência antes de serem usadas no experimento.

[091] Produto de referência: FK228 a 100 ng/mL foi usado como um indutor de referência da atividade da telomerase 1.

[092] Protocolo de incubação: As células foram incubadas por 24 horas na ausência (controle) ou presença do produto de referência ou de concentrações crescentes de compostos de teste, como o extrato de peregrina de acordo com a invenção a: 0,5; 1%; e 5% (v/v).

[093] O extrato de peregrina de acordo com a invenção é diluído diretamente no meio de incubação para atingir as várias concentrações descritas acima.

Avaliação dos efeitos Medição de proteínas

[094] Ao final do período de incubação, as proteínas totais das células foram extraídas das células e medidas por meio de um método espectrocolorimétrico (método de Bradford). Esta medição é usada para determinar o volume exato de extrato a ser usado na medição da atividade da telomerase, de modo a manter a mesma quantidade de proteína (que contém telomerase) para todas as condições analisadas na etapa de PCR.

Medição da atividade da telomerase

[095] Ao final do período de incubação, a telomerase foi extraída das células e sua atividade foi determinada por meio de um kit sensível específico. O princípio do kit de telomerase é medir a atividade da telomerase ao acoplar uma etapa de PCR (na qual a telomerase funciona em termos de sua atividade de alongamento) com uma etapa de ELISA para determinação semiquantitativa de quantidades de produto de alongamento da telomerase.

Estatísticas

[096] Os resultados são expressos em unidades arbitrárias para o nível de atividade da telomerase (média ± S.D.). O nível de significância entre o “veículo” e o “produto de referência” foi avaliado por meio do teste t de Student (*: p < 0,05). O nível de significância entre o “controle” e o “composto de teste” foi avaliado independentemente para cada produto por uma análise de variância de uma via (ANOVA de uma via) seguida de um teste de Holm-Sidak (*: p < 0,05).

[097] O extrato de peregrina de acordo com a invenção, testado a 0,5% e 1% (v/v), não modulou significativamente a atividade da telomerase em relação ao “controle”. Quando testado a 5% (v/v), o extrato de peregrina de acordo com a invenção aumentou significativamente a atividade da telomerase, em 18,9% (p < 0,001), em comparação com o “controle”.

[098] O produto de referência, denominado “FK228”, testado a 100 ng/mL, aumentou significativamente a atividade da telomerase, em 28,0% (p < 0,01). Este resultado era esperado e valida o experimento. Os resultados para a estimulação da atividade da telomerase são dados abaixo: [Tabela 7]:

[099] Conclusão: o extrato de peregrina de acordo com a invenção, testado a 0,5% e 1% (v/v), não modulou significativamente a atividade da telomerase em relação ao “controle”. Quando testado a 5% (v/v), o extrato de peregrina de acordo com a invenção aumentou significativamente a atividade da telomerase, em 18,9% (p < 0,001), em comparação com o “controle”. O extrato de acordo com a invenção atua diretamente nessa via enzimática que constrói os telômeros protetores nas extremidades dos cromossomos e retarda o envelhecimento natural do material genético. O extrato de acordo com a invenção pode assim produzir um efeito antienvelhecimento nos cromossomos.

[100] Os exemplos 2 a 7 demonstram que o extrato de peregrina de acordo com a invenção tem propriedades antienvelhecimento, antiestresse e relaxantes, o que demonstra o perfil de um bom protetor para a pele.

Exemplo 8: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção na estimulação da atividade da tirosinase

[101] O objetivo deste estudo é avaliar a atividade sobre a enzima tirosinase do extrato de peregrina de acordo com a invenção em um modelo acelular in vitro usando uma enzima tirosinase de origem fúngica (Sigma-Aldrich ref. T3824), seu substrato, a L-tirosina (Sigma-Aldrich ref. T3754), e um inibidor de referência, a hidroquinona (Sigma-Aldrich ref.H17902, inibidor = hidroquinona 2,5 mM). Uma solução tamponada de tirosinase reage com um substrato, L-tirosina 2,5 mM, por 60 minutos a 23°C e o transforma para formar um composto corado. A atividade máxima da tirosinase pode assim ser avaliada medindo-se a absorbância a 475 nm. O extrato de peregrina de acordo com a invenção ou o produto de referência “hidroquinona” são colocados em contato com a solução de tirosinase juntamente com o substrato enzimático por 60 minutos a 23°C; o substrato transformado com a enzima é corado naturalmente. A atividade da tirosinase na presença do agente ativo é então avaliada medindo se a absorbância a 475 nm. A modulação dessa atividade é expressa como uma porcentagem de inibição ou de ativação da atividade máxima da tirosinase na ausência do agente ativo, ou seja, apenas na presença do substrato enzimático (L-tirosina).

[102] Protocolo: Uma solução da enzima tirosinase é incubada em seu substrato L-tirosina por 60 minutos na ausência (controle) ou na presença do produto de referência, ou de concentrações crescentes do extrato de peregrina de acordo com a invenção/ concentrações; 2%; 1%; 0,1% (V/V). Ao final do período de incubação, a atividade da enzima tirosinase com e sem o produto de teste ou de referência foi avaliada medindo-se a absorbância do meio de reação a 475 nm. Para cada concentração testada, a modulação da atividade enzimática da tirosinase com o produto de teste é calculada de acordo com a fórmula a seguir: [Fórmula. 5]: Percentual de modulação da atividade enzimática da tirosinase = 100 x [(OD475 produto de teste ou produto de referência) - (OD475 tirosinase sozinha)]/OD475 tirosinase sozinha.

[103] Se o resultado for negativo, a porcentagem é expressa como inibição enzimática; se o resultado for positivo, a porcentagem é expressa como ativação enzimática. Os resultados para a estimulação da atividade da tirosinase são dados abaixo: [Tabela 8]:

[104] Conclusão: O extrato de peregrina de acordo com a invenção é capaz de diminuir a atividade da tirosinase basal, o que permite indicar que este extrato tem a capacidade de aumentar uma das formas naturais de proteção da pele: a proteção contra os raios ultravioletas.

Exemplo 9: Efeito do extrato de peregrina de acordo com a invenção na inibição da produção de melanina

[105] O objetivo deste estudo em culturas de células humanas é reunir todos os dados usados, e também os resultados obtidos, para realizar o teste de modulação da melanina em melanócitos humanos após exposição ao extrato de peregrina de acordo com a invenção por 5 dias.

[106] Protocolo: Os melanócitos humanos são cultivados em placas de 96 e 24 poços.

[107] O extrato de peregrina de acordo com a invenção atua nos melanócitos confluentes a concentrações de 5%, 2%, 1% e 0,1% por 5 dias. Um pré-teste de viabilidade com MTT após 24 horas permite avaliar a citotoxicidade e escolher as concentrações para o teste de modulação da melanina. Esta modulação é avaliada pela dosagem de melanina nos lisados celulares após 5 dias de exposição aos extratos. O controle negativo é realizado usando células em meio de cultura sem tratamento. O controle positivo para o teste de viabilidade é SDS a 0,5%. Para o teste de modulação da melanina, meios com e sem α-MSH são usados como controles negativos.

[108] Todas as condições são preparadas em meio de cultura e as células são subsequentemente incubadas a 36,5°C/CO2 a 5% por 24 horas para o teste de citotoxicidade e 5 dias para o teste de melanina.

a) Aplicação das soluções de teste nos melanócitos

[109] As concentrações de teste são colocadas em contato com os melanócitos confluentes em placas de 96 poços (teste de citotoxicidade) e placas de 24 poços (ensaio de melanina). Para cada concentração, o teste é realizado em três poços. As placas são incubadas por 24 horas ± 1 hora e 5 dias a 36,5°C/CO2 a 5%.

b) Teste de viabilidade

[110] A viabilidade celular é avaliada com o método MTT nas células após incubação por 24 horas com os produtos. Após incubação por 24 horas, os poços pretendidos são lavados uma vez com 200 μL de PBS. 50 μL de uma solução de MTT a 0,5 mg/mL são adicionados em cada poço e a incubação é realizada por 3 horas a 36,5°C/CO2 a 5%. 150 μL de isopropanol são adicionados em cada poço. Após homogeneização, é feita uma leitura de absorbância a 550 nm. Para cada condição, a razão dos valores médios de densidade óptica das células para os valores médios de densidade óptica dos controles negativos determina a razão de viabilidade.

[111] Um valor de corte de viabilidade de 70% em relação ao valor de controle negativo é usado para classificar as substâncias de teste como citotóxicas ou não citotóxicas. Uma classificação “não citotóxica” é dada nos resultados in vitro para uma viabilidade > 70% e uma classificação “citotóxica” é dada para uma viabilidade < 70%.

[112] A concentração de 5% do extrato de acordo com a invenção provou ser citotóxica a 5% nas condições de teste. As concentrações de 2%, 1% e 0,1% são assim usadas para o teste de modulação da melanina. A quantidade de melanina presente nas células é avaliada após a lise celular. Os resultados para a inibição da produção de melanina são dados abaixo: [Tabela 9]:

[113] Conclusão: o extrato de peregrina de acordo com a invenção inibe a produção de melanina in cellulo, o que lhe confere uma propriedade de proteção da pele. Esta inibição também apresenta um efeito relaxante nos melanócitos uma vez que a taxa basal é inferior à do controle (ausência do extrato de acordo com a invenção no meio de cultura); vale lembrar que a produção de melanina é uma resposta a um estresse celular. Assim, o extrato de peregrina de acordo com a invenção demonstra que é capaz de prevenir manchas da idade. Exemplo 10: Caracterização analítica do extrato de peregrina de acordo com a invenção versus o extrato de oleifera com um processo de extração idêntico

[114] Com base na torta de Moringa peregrina e na torta de Moringa oleifera, aplicou-se o processo de extração de acordo com a invenção descrito no exemplo 1. A composição comparativa dos ingredientes extraídos é dada abaixo com base na matéria seca: [Tabela 10]:

[115] Como pode ser visto, os dois extratos têm um perfil molecular muito diferente. O extrato de Moringa oleiferacontém menos de 1% de DFF, enquanto o extrato de Moringa peregrinacontém mais de 50% do mesmo.

Exemplo 11: Teste comparativo com Moringa oleifera para um teste de colagenase in tubo

[116] O objetivo deste estudo é avaliar a modulação da atividade inibidora de metaloproteases pelo extrato de peregrina de acordo com a invenção em um modelo acelular in vitro usando uma colagenase tipo I e uma hialuronidase, um complexo de substrato e um cromóforo, a ninidrina. Uma solução tamponada de colagenase tipo I e hialuronidase reage com um complexo de substrato específico e o transforma para formar um composto capaz de ativar um cromóforo por incubação a 80°C por 15 minutos. As atividades da colagenase e da hialuronidase podem assim ser avaliadas medindo-se a absorbância a 565 nm. A amostra é colocada em contato com a solução de colagenase e hialuronidase juntamente com o complexo de substrato enzimático a 37°C por 5 minutos. O substrato transformado com as enzimas é capaz de ativar o cromóforo por incubação a 80°C por 15 minutos. As atividades da colagenase e da hialuronidase na presença/ausência da amostra são então avaliadas medindo-se a absorbância a 565 nm. A modulação desta atividade é expressa em percentagem de inibição ou de ativação da atividade da colagenase e da hialuronidase na ausência do agente ativo, ou seja, apenas na presença do substrato enzimático.

[117] Protocolo: Uma solução das enzimas colagenase tipo I e hialuronidase é incubada em seu substrato por 5 minutos, na ausência ou presença do extrato de peregrina testado de acordo com a invenção. As soluções são então colocadas em contato com o cromogênio ninidrina, seguido de incubação por 15 minutos a 80°C. Ao final do período de incubação, a atividade das enzimas colagenase e hialuronidase com e sem o produto de teste ou de referência foi avaliada medindo-se a absorbância do meio de reação a 565 nm. Para cada concentração testada, a modulação das atividades enzimáticas da colagenase e da hialuronidase com o produto de teste é calculada de acordo com a fórmula a seguir: [Fórmula 6]: Modulação percentual da atividade enzimática da colagenase/hialuronidase = 100 x [(OD produto de teste ou de referência - OD colagenase/hialuronidase sozinha)/OD colagenase/hialuronidase sozinha].

[118] Se o resultado for negativo, a porcentagem é expressa como inibição enzimática; se o resultado for positivo, a porcentagem é expressa como ativação enzimática. O resultado para a inibição da metaloprotease é dado abaixo: [Tabela 11]:

[119] Conclusão: O extrato de peregrina de acordo com a invenção dá origem a uma forte inibição das metaloproteases (colagenase/hialuronidase). Ele é capaz de exercer 88% de inibição sobre essas metaloproteases a partir de uma concentração de 0,1% e tem bom potencial para proteger a matriz extracelular da pele com grande eficiência e, através dessa inibição, ele revela um efeito antienvelhecimento.

[120] Este será comparado com o extrato de acordo com a patente da Pierre Fabre, FR 2 946 879, cujos resultados são dados abaixo de acordo com o mesmo teste: [Tabela 12]:

[121] Conclusão: o extrato de acordo com a patente da Pierre Fabre apresenta uma leve ação inibitória dependente da dose inversa sobre a atividade da colagenase com um pico de inibição de 42%, todas as concentrações combinadas, em oposição a um pico de inibição de 100% para o extrato de peregrina de acordo com a invenção.

[122] A atividade antienvelhecimento em relação a este parâmetro parece ser diferente e inovadora em comparação com os efeitos observados com o extrato de acordo com a patente da Pierre Fabre. Exemplo 12: Testes comparativos para a atividade antiestresse (por inibição da PLA2).

[123] Para a atividade antiestresse por inibição da PLA2 na pele, que confere uma orientação calmante/antiestresse com efeito antienvelhecimento, foram realizados dois testes in tubo de PLA2: um através do processo de acordo com a invenção realizado em torta de oleifera (extrato preparado de forma idêntica ao da peregrina no processo de acordo com a invenção), um com o extrato correspondente à patente da Pierre Fabre, FR 2 946 879, outro correspondente à patente da BASF Beauty Care Solutions, FR 3 076 460, com o produto Purisoft®, e finalmente um último com o Patente de Chuun & Thurot, FR2825267.

[124] O objetivo deste estudo é avaliar a modulação da atividade anti- inflamatória da enzima fosfolipase-A2 por uma ou mais amostras em um modelo acelular in vitro por meio do “Kit de Ensaio de Triagem de Inibidor de SPLA2 (tipo V)”.

[125] Uma solução tamponada de fosfolipase-A2 reage com um substrato específico, diheptanol tio-PC, e o transforma em um composto que se liga a um cromógeno, DTNB, com agitação à temperatura ambiente. A atividade da fosfolipase-A2 pode assim ser avaliada medindo-se a absorbância a 413 nm.

[126] Os produtos “extrato de peregrina de acordo com a invenção” ou o produto inibidor de referência “tioeteramida-PC” são colocados em contato com a solução de fosfolipase-A2 ao mesmo tempo que o substrato enzimático. O substrato transformado pela enzima é corado por meio do cromógeno DTNB por agitação à temperatura ambiente. A atividade da fosfolipase-A2 na presença/ausência do produto “extrato de peregrina de acordo com a invenção” ou do produto de referência é então avaliada medindo-se a absorbância a 413 nm.

[127] A modulação dessa atividade é expressa como uma porcentagem de inibição ou de ativação da atividade da fosfolipase-A2 na ausência do agente ativo, ou seja, apenas na presença do substrato enzimático (diheptanol tio-PC).

[128] O inibidor “tioeteramida-PC” a uma concentração de 1 mg em 100 μL é o produto de referência (controle ativo) neste estudo; o referido produto inibe a atividade da PLA2 em 93%, validando assim o teste.

[129] Uma solução da enzima fosfolipase-A2 é incubada em seu substrato, diheptanol tio-PC, na ausência ou presença do inibidor de referência e do produto de teste “extrato de peregrina de acordo com a invenção”, e o cromógeno DTNB é então incorporado, seguido de incubação por 15 minutos a 25°C.

[130] Ao final do período de incubação, a atividade da enzima fosfolipase- A2 com e sem o produto de teste ou de referência foi revelada medindo-se a absorbância do meio de reação a 413 nm. Para cada concentração testada, a modulação da atividade enzimática da fosfolipase-A2 com o produto de teste é calculada de acordo com a fórmula a seguir: [Fórmula 7]: Modulação percentual da atividade enzimática da fosfolipase- A2 = 100 x [(OD405 produto de teste ou produto de referência - OD405 sPLA2 sozinho)/OD405 sPLA2 sozinho].

[131] Se o resultado for negativo, a porcentagem é expressa como inibição enzimática; se o resultado for positivo, a porcentagem é expressa como ativação enzimática: [Tabela 13]:

[132] A consistência e a atividade substancialmente dependente da dose deste extrato de peregrina de acordo com a invenção na inibição da PLA2 revelam uma atividade calmante, reduzindo a intensidade a montante da cascata araquidônica. Tal ação calmante a montante da cascata araquidônica reduz o impacto do estresse fisiológico basal. O extrato de peregrina de acordo com a invenção é consequentemente um agente antiestresse.

[133] Com o extrato do protocolo da patente da Pierre Fabre, FR 2 946 879, obtém-se os seguintes resultados: [Tabela 14]:

[134] A 1%, que corresponde à sua dosagem mínima de trabalho, o extrato não apresenta atividade. Na diluição, a atividade aparece, mas a ausência de um efeito dose-dependente não permite validar uma ação específica e confiável do extrato na inibição dessa enzima.

[135] Com o extrato do protocolo da patente da BASF Beauty Care Solutions, FR 3 076 460, com o produto Purisoft® LS9726, são obtidos os seguintes resultados: [Tabela 15]:

[136] Este extrato apresenta uma leve ação inibitória que não atinge a quantidade máxima observada a 1% com o extrato de peregrina de acordo com a invenção, ou seja, 19% de inibição para o extrato de acordo com a invenção em oposição a 10% de inibição a 1% para este extrato.

[137] Com o extrato do protocolo da patente de Chuun & Thurot, FR 2 825 267, observa-se os seguintes resultados: [Tabela 16]:

[138] Este extrato não apresenta ação inibitória sobre esta enzima.

[139] Com o extrato do protocolo do processo de acordo com a presente invenção, mas aplicado à torta de Moringa oleifera em vez da torta de Moringa peregrina, observa-se os seguintes resultados: [Tabela 17]:

[140] Este extrato não apresenta ação inibitória significativa ou estável sobre esta enzima.

[141] Conclusão: apenas o extrato de peregrina de acordo com a invenção demonstra atividade inibidora significativa sobre a enzima PLA2. Exemplo 13: Formulação de produtos de maquiagem

[142] [Tabela 18]:

Exemplo 14: Formulação do produto de lavagem

[143] [Tabela 19]:

Exemplo 15: formulação de um produto de cuidado (creme antienvelhecimento e antiestresse)

[144] [Tabela 20]:

Exemplo 16: formulação de via oral nutricosmética

[145] Um comprimido de 1 g para atividade calmante/antiestresse compreende: 3% de extrato seco de acordo com a invenção (que contém 0,6% de 2,5-diformilfurano em um suporte de inulina) + 47% de carbonato de cálcio que contém 200 UI de vitamina D + 25% de gluconato de magnésio + 22% de inulina + 3% de estearato de magnésio. Exemplo 17: Exames toxicológicos no extrato de peregrina de acordo com a invenção

Preparação do extrato de peregrina de acordo com o exemplo 1

[146] Sementes de Moringa peregrina (Forssk.) Fiori colhidas quando os frutos estavam maduros foram secas para se obter um teor de umidade interna de cerca de 6%, e depois prensadas com uma prensa mecânica de parafuso sem fim, de modo a separar o óleo do restante da semente para se obter, por um lado, o óleo virgem e, por outro, uma torta. A torta é então isolada na forma de rolos pré-cortados em pedaços de 1 a 2 cm. A maceração e a extração são realizadas na torta com etanol 96° pré-aquecido por 10 minutos a 55°C em uma proporção de 25%/75% (m/m). A mistura é cisalhada com um misturador por 15 minutos e depois deixada agitar com um impulsor por 2 horas a 20°C. O produto é então filtrado através de um funil de Büchner sob vácuo para se obter um filtrado amarelo-claro que contém 1,15% de matéria seca. Esse filtrado é usado nos testes seguintes.

Determinação da atividade mutagênica na cepa bacteriana Salmonella typhimurium (TA 100) - Teste de mutação bacteriana reversa

[147] O teste foi realizado em três fases principais: - um experimento preliminar é realizado para avaliar a citotoxicidade do elemento a ser testado e selecionar a faixa de dose para os experimentos subsequentes; - um primeiro experimento de genotoxicidade (Teste 1), com e sem ativação metabólica, com incorporação direta do sistema de teste e do teste (ou dos controles) em ágar mínimo, na faixa de dose definida pelo estudo preliminar; - um segundo experimento (Teste 2), com pré-incubação do sistema de teste e do elemento de teste (ou dos controles), com e sem ativação metabólica, com níveis de dose definidos pelo diretor do estudo após análise dos resultados do primeiro experimento. Este segundo experimento foi realizado para confirmar ou completar os resultados do primeiro, em particular quando foram obtidos resultados equivocados ou negativos.

[148] As diluições dos elementos de teste foram preparadas em água de grau analítico.

[149] O teste de citotoxicidade foi realizado na cepa TA100 de Salmonella typhimurium nas concentrações de 5000, 1600, 500, 160 e 50 μg/placa, com e sem S9-Mix.

[150] Os reagentes usados para preparar o S9-Mix foram preparados de acordo com as seguintes instruções: [Tabela 21]:

[151] As bactérias foram expostas ao extrato de teste com e sem o sistema de ativação metabólica. O sistema metabólico usado é uma fração pós- mitocondrial suplementada com cofator (S9). Essa fração S9, uma fração microssomal de homogenato de fígado de rato Sprague-Dawley tratado com um indutor enzimático, é preparada de acordo com Maron, D.M. e Ames, B. N. (1983) e foi fornecido pela Moltox TM. Ela é armazenada a uma temperatura inferior a -70°C. A fração microssomal S9 foi usada a uma concentração de 10% em S9-Mix. O protocolo aplicado foi como segue: [1] os seguintes foram introduzidos em três tubos de hemólise: o ensaio sem ativação metabólica: [2] 0,1 mL das várias concentrações dos elementos de teste, [3] 0,5 mL de tampão de fosfato estéril 0,2 M, pH 7,4, [4] 2 mL de ágar superior para S. typhimurium, [5] 0,1 mL de inóculo bacteriano (TA100); o ensaio com ativação metabólica: [6] 0,1 mL das várias concentrações dos elementos de teste, [7] 2 mL de ágar superior para S. typhimurium, [8] 0,1 mL de inóculo bacteriano (TA100), [9] 0,5 mL de S9-Mix; [10] misturar e despejar sobre a superfície do ágar de fundo previamente espalhado em placas de Petri; o incubar a 37°C ± 2°C por 48 a 72 horas.

[152] Estes ensaios foram realizados para cada teste: teste preliminar de citotoxicidade, teste 1 e teste 2. O controle não tratado, os controles negativos e os controles positivos produzidos durante o método de pré-incubação foram incubados por 20 a 30 minutos a 37°C ± 2°C antes de verter o ágar superior.

[153] O protocolo aplicado foi como segue: • introduzir os seguintes em quatro frações de 2 mL de ágar superior para S. typhimurium: o 0,1 mL de tampão fosfato a 0,2 M, pH 7,4, o 0,1 mL de solvente, o 0,1 mL de S9-Mix, o 0,1 mL da preparação do elemento de teste na concentração mais alta; • uma fração de 2 mL de ágar superior para S. typhimuriumé usada para verificar sua esterilidade; • misturar e despejar sobre a superfície do ágar de fundo previamente espalhado em placas de Petri; • incubar a 37°C ± 2°C por 48 a 72 horas; • o teste é realizado em triplicata; • nenhum crescimento bacteriano deve ser observado.

[154] Para pelo menos cinco concentrações do extrato de teste, realizou-se um teste sem ativação metabólica e um teste com ativação metabólica.

Expressando e interpretando os resultados

[155] Muitos critérios permitem determinar se um resultado é positivo, notavelmente um aumento no número de revertentes correlacionado com a dose do item de teste ou um aumento reproduzível no número de revertentes em uma ou mais concentrações, com ou sem ativação metabólica: - o elemento de teste é considerado mutagênico se, na conclusão das etapas de verificação, uma relação dose-efeito foi obtida de forma reproduzível em uma ou mais das cinco cepas com e/ou sem ativação metabólica. A mutagenicidade só é considerada para uma determinada concentração quando o número de revertentes for pelo menos igual a duas vezes a taxa de reversão espontânea para as cepas TA98, TA100 e TA102 (R > 2) e três vezes a taxa de reversão espontânea para as cepas TA1535 e TA1537 (R > 3); - o elemento de teste é considerado não mutagênico se, na conclusão do teste 1 e do teste 2, a frequência de revertentes sempre permaneceu menor que o dobro da taxa de reversão espontânea para todas as concentrações do elemento de teste, para as cepas TA98, TA100, e TA102 (R < 2) e menos de três vezes a taxa de reversão espontânea para as cepas TA1535 e TA1537 (R < 3), com e sem ativação metabólica, e desde que tenha sido verificado que a ausência do efeito mutagênico não estava relacionada com a toxicidade das concentrações testadas.

[156] O estudo preliminar não mostrou citotoxicidade do elemento de teste; consequentemente, essa faixa de concentração foi usada para o teste de genotoxicidade 1.

[157] Com base no resultado obtido para o teste 1, optou-se por usar a mesma faixa de diluição para o teste 2. A análise dos revertentes mostra que: -nenhum efeito citotóxico foi observado, -nenhuma concentração do extrato de teste mostrou uma razão R maior ou igual a pelo menos duas vezes a taxa de reversão espontânea para TA98, TA100 e TA102 ou três vezes a taxa de reversão espontânea para TA1535 e TA1537, com e sem ativação metabólica, -nenhuma resposta à dose foi observada, independentemente do sistema de teste ou das condições de teste.

[158] Diante dos resultados obtidos neste estudo, a extrato de peregrina de acordo com o exemplo 1 pode ser considerado como não tendo atividade mutagênica ou pró-mutagênica.

Teste de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU

[159] O princípio do teste se baseia na comparação da citotoxicidade do extrato de peregrina de acordo com o exemplo 1 na presença e ausência de uma dose não citotóxica de UVA, em células em cultura. A citotoxicidade é avaliada determinando-se a viabilidade celular por meio de um corante vital: vermelho neutro, 24 horas após o tratamento com os elementos de referência e o extrato de M. peregrina com ou sem irradiação UVA. As células usadas são fibroblastos de embrião de camundongo da linhagem Balb/c 3T3 clone 31 (ATCC - CCL163). O controle positivo é uma solução de clorpromazina (N° CAS: 69-09-0). O controle negativo é um diluente para o extrato de teste e para a referência (solução salina tamponada ± 1% solvente). O extrato de peregrina foi testado em oito concentrações em pelo menos quatro poços de cultura por concentração estudada, na presença ou ausência de UVA. Os fibroblastos foram tripsinizados e duas placas de cultura de 96 poços foram semeadas com 100 μL de uma suspensão celular que contém 2x105 células/mL (ou seja, 2x106 células por poço) em meio de cultura completo.

[160] As placas semeadas foram incubadas por 24 horas a 37°C e CO2 a 5%. Ao final da incubação, verificou-se a semiconfluência do gramado celular. As diluições foram preparadas imediatamente antes de serem depositadas nas células. Mediu-se o pH da concentração mais alta; estava entre 6,5 e 8. O meio de cultura foi removido, cada poço foi pré-lavado cuidadosamente com 150 μL de PBS mantido à temperatura ambiente e depois tratado com 100 μL de cada extrato ou diluição de referência. As placas de cultura foram incubadas no escuro por 1 h ± 5 minutos a 37°C e CO2 a 5%. A irradiação foi realizada com um irradiador solar Bio-Sun (Vilber Lourmat RMX3W). A máquina Bio-Sun é um sistema que controla a irradiação UV por meio de um microprocessador programável. O sistema segue continuamente a emissão de luz UV. A irradiação para automaticamente quando a energia entregue é igual à energia programada. A irradiância espectral do dispositivo de teste foi medida na faixa de comprimento de onda de 250 a 700 nanômetros com um espectrorradiômetro calibrado. Uma das duas placas foi irradiada com sua tampa à temperatura ambiente, e a outra placa foi protegida de UVA e foi mantida à temperatura ambiente durante a irradiação. Após a irradiação, o meio de tratamento foi aspirado e as células foram lavadas. 100 μL de meio de cultura completo foram então adicionados cautelosamente e as placas foram incubadas por 18 a 22h a 37°C e CO2 a 5%. No dia seguinte, a viabilidade celular (crescimento, morfologia, integridade da monocamada) foi avaliada por observações usando um microscópio de contraste de fase. O meio de cultura foi removido e cada poço foi pré-lavado e mantido à temperatura ambiente antes de ser tratado com 100 μL da solução de coloração. As placas foram devolvidas à incubadora por 3 horas nas mesmas condições. A solução de coloração foi removida e as células foram lavadas, a solução de lavagem foi então removida e 150 μL de solução de dessorção foram adicionados em cada poço. As placas foram agitadas até que os cristais estivessem completamente dissolvidos. Os valores de absorbância foram medidos a 450 nm.

Validação do teste

[161] A sensibilidade UVA das células é verificada aproximadamente a cada 10 passagens por avaliação de sua viabilidade após expô-las a doses crescentes de irradiação. As células são cultivadas na densidade usada no teste. Elas são irradiadas no dia seguinte na dose de 2,5 e 9 J/cm2 e a viabilidade celular é determinada um dia depois por meio do teste NRU. As células atendem aos critérios de qualidade se sua viabilidade depois que a irradiação a 5 J/cm2 de UVA é maior ou igual a 80% da viabilidade dos controles mantidos no escuro; na dose mais alta de 9 J/cm2 de UVA, a viabilidade deve ser pelo menos igual a 50% daquela dos controles mantidos no escuro.

Resultados

[162] O controle negativo tem uma absorbância maior ou igual a 0,4. A clorpromazina, o controle positivo, tem um valor CI50 entre 0,1 e 2 μg/mL na presença de UVA e entre 7 e 90 μg/mL na ausência de UVA. Esses resultados permitem validar o teste. A concentração do extrato de torta de peregrina dando 50% de morte celular na presença ou ausência de UVA não pode ser estimada. A mortalidade nunca chegou a 50%. A concentração do extrato de torta de peregrina dando 50% de viabilidade celular na presença ou ausência de UVA não pode ser estimada. A viabilidade é sempre superior a 50%.

[163] Conclusão: Nas condições experimentais adotadas, o extrato de torta de peregrina pode ser considerado não fototóxico.

Avaliação do potencial irritante ocular pelo estudo da citotoxicidade in vitro usando o método de liberação de vermelho neutro na linhagem celular SIRC

[164] Este estudo in vitro se baseia na avaliação da citotoxicidade do extrato de torta de peregrina determinando-se a concentração que resulta em 50% de morte celular (IC50) em uma monocamada de células por meio da técnica de liberação de vermelho neutro. As células usadas são fibroblastos de córnea de coelho SIRC isentos de micoplasma (ATCC - CCL60).

[165] O extrato de peregrina foi diluído a 25% e 50% em soro fisiológico. Os fibroblastos foram tripsinizados e duas placas de cultura de 24 poços foram semeadas a uma taxa de 1 mL de uma suspensão de células que contém 2 x 105 células/mL em meio de cultura completo. Essas placas foram incubadas durante a noite a 37°C e CO2 a 5%. Ao final da incubação, verificou-se a confluência do gramado celular. A solução de coloração foi preparada a 0,5 mg/mL em meio de cultura completo. O meio de cultura foi removido e 1 mL da solução de coloração foi colocado em cada poço. As células foram incubadas a 37°C e CO2 a 5% por 3 horas ± 15 minutos. Após esse tempo de contato, a solução de coloração foi removida e substituída por 1 mL de meio de cultura completo por poço. As placas foram mantidas à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos para estabilizar o sistema antes do contato com o extrato ou a referência. Cada poço foi lavado com 2 mL de PBS, mantido à temperatura ambiente e 500 μL de cada diluição de extrato de peregrina ou de referência foram então colocados em contato com o gramado celular. O tempo de contato foi de 60 segundos (30 segundos para o controle positivo). O tratamento foi realizado poço por poço com o cronômetro iniciado no momento em que se depositou o extrato de peregrina ou a referência. A placa foi agitada manualmente durante todo o tratamento. Após 55 segundos (ou 25 segundos para o controle positivo), a diluição foi aspirada. Em precisamente 60 ou 30 segundos, foram realizadas cinco lavagens sucessivas (5 x 2 mL de PBS mantido à temperatura ambiente). O sobrenadante foi aspirado após cada enxágue e após o enxágue final os poços permaneceram livres de meio enquanto se aguardava a fase de revelação. Após o tratamento completo da placa de cultura, 1 mL da solução de dessorção foi depositado em cada poço. A placa foi agitada por cerca de 15 minutos até que uma coloração homogênea fosse obtida. As soluções obtidas para cada poço de cultura foram recolhidas e divididas em dois poços de uma placa de 96 poços, ou seja, 150 μL/poço.

Resultados

[166] A concentração do extrato de peregrina que leva a 50% de morte celular foi avaliado como > 50%. A porcentagem de morte celular a 50% de extrato de peregrina foi avaliada como 17%.

[167] Conclusão: Nas condições experimentais adotadas, a citotoxicidade do extrato de torta de peregrina pode ser considerada como sendo insignificante.

Avaliação da compatibilidade cutânea de um extrato de peregrina após uma única aplicação sob um curativo oclusivo por 48 horas sob controle dermatológico

[168] O objetivo deste estudo é avaliar o grau de compatibilidade cutânea do extrato de peregrina por teste epicutâneo, realizado na face ântero-externa do braço por 48 horas; e no geral para avaliar a capacidade do extrato de peregrina de manter a pele em boas condições. Foram incluídos no estudo 10 voluntários saudáveis do sexo feminino ou masculino, de 18 a 65 anos, sem pele seca ou sensível e livres de lesões dermatológicas na área de tratamento. A compatibilidade com a pele do extrato de peregrina, preparado na forma de uma loção que contém 5% do extrato de peregrina de acordo com o exemplo 1 e 95% de uma mistura propanodiol/sorbitol, foi avaliada 48 horas após a aplicação inicial entre 30 e 40 minutos após a remoção do curativo. As reações cutâneas (eritema e edema) foram pontuadas de 0 a 3 de acordo com as seguintes escalas: [Tabela 22]:

[169] Quaisquer outras reações cutâneas (bolhas, pápulas, vesículas, ressecamento, descamação, aspereza, efeito sabão etc.) foram avaliadas de acordo com a seguinte escala e relatadas descritivamente: - 0: nenhuma reação; - 0,5: muito leve; - 1: leve; - 2: moderada; - 3: acentuada.

[170] No final do estudo, uma pontuação média de irritação (M.I.S.) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: [Fórmula 8]: M.I.S. = soma das reações cutâneas (Er + Oe + bolhas + pápulas + vesículas) / Número de voluntários analisados.

[171] O M.I.S. obtido possibilitou classificar o extrato de teste de acordo com a escala apresentada na tabela abaixo:

[172] Resultados: A Pontuação Média de Irritação (MIS) para o extrato de torta de peregrinaé igual a: 0.

[173] Conclusão: O extrato de torta de peregrina pode ser considerado não irritante após 48 horas consecutivas de aplicação em 12 voluntários.

Conclusão geral dos testes

[174] Os resultados dos testes realizados acima são conclusivos e demonstram que, para a extrato de peregrina de acordo com o exemplo 1: 1) os testes de irritação ocular e cutânea são negativos; 2) os testes de fototoxicidade são negativos; 3) os testes de mutagenicidade são negativos.

[175] A segurança do extrato de peregrina de acordo com a invenção é demonstrada e ideal para uso cosmético tópico em larga escala sem restrição em relação à população alvo. Exemplo 18: Avaliação pela medição da perda transepidérmica de água (TEWL) na barreira cutânea e sua aceitabilidade após o uso por um período de 21 dias

[176] O produto estudado neste estudo é o produto de cuidado na forma de creme do exemplo 15. Este produto é aplicado de manhã e à noite no rosto limpo, massageando suavemente, evitando a área ao redor dos olhos. As medições são feitas nas bochechas.

[177] Os critérios de avaliação são: - avaliação do efeito na barreira cutânea: comparação dos valores de TEWL antes de qualquer aplicação do produto (D1) e após 21 dias de aplicação (D21); - comentário no D21 quanto às sensações de desconforto; - aceitabilidade cosmética: questionário preenchido pela voluntária no D21.

[178] Foram testadas 22 voluntárias com idade média de 50 anos (entre 20 e 70 anos) com todos os tipos de pele. O produto avaliado na barreira cutânea apresentou os seguintes resultados (* = % de variação de D21 em relação a D1, ** = teste de Wilcoxon para dados pareados com S = significativo (p < 0,05 e NS = não significativo (p > 0,05): [Tabela 23]:

[179] A análise dos resultados mostra que a TEWL se manteve estável no D21 em comparação com D1: o produto apresentou efeito “dermoprotetor” após 21 dias de aplicação. Dada a ausência de uma redução significativa nos valores de TEWL no D21 em comparação com D1, o efeito “nutritivo” do produto de teste não pôde ser revelado por medições instrumentais. 81% das voluntárias responderam positivamente à pergunta “a pele está nutrida” no questionário de aceitabilidade no D21.

[180] Conclusão: Nas condições do estudo, o creme apresentou efeito “dermoprotetor”, revelado pela medição de TEWL, e boa aceitabilidade cosmética, com 86% de opiniões favoráveis.

Claims

1. Extrato de semente de Moringa peregrina, caracterizado pelo fato de ser obtido por extração sólido-líquido da torta de semente sem casca, com agitação, em uma proporção de cerca de 25% em peso de matéria sólida em relação ao peso total usado em um solvente predominantemente alcoólico, sendo o álcool escolhido a partir de etanol ou metanol opcionalmente com um cossolvente tal como um poliol ou água subcrítica, em uma proporção de 70% a 100% em peso de álcool em relação ao peso total do solvente, a uma temperatura entre 16 e 30°C por um período de cerca de 2 horas, e por separação das fases líquida e sólida para remover a fase sólida e recuperar um extrato líquido de semente de Moringa peregrina, sendo o referido extrato rico no composto 2,5- diformilfurano.

2. Extrato de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extrato líquido obtido é seco de modo a obter um extrato seco da torta de sementes de Moringa peregrina contendo mais de 50% em peso de 2,5- diformilfurano em relação ao peso total da matéria seca.

3. Composição cosmética ou nutricosmética, caracterizada pelo fato de que compreende, como agente ativo, uma quantidade eficaz de um extrato de sementes de Moringa peregrina definido na reivindicação 1 ou 2, e um excipiente fisiologicamente aceitável.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ser uma composição cosmética formulada para aplicação tópica na pele, e o extrato de sementes de Moringa peregrina estar presente na composição a uma concentração de 0,002% a 20% em peso, preferencialmente de 0,01% a 10%, em relação ao peso total da composição.

5. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ser uma composição nutricosmética formulada para ingestão, e o extrato de sementes de Moringa peregrinaestá presente na composição a uma concentração de 0,01% a 100% em peso em relação ao peso total da composição.

6. Uso cosmético ou nutricosmético de uma composição definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de ser para melhorar a aparência da pele, das membranas mucosas ou dos tegumentos, para relaxar, suavizar e desestressar a pele e para prevenir e/ou combater os sinais de envelhecimento e/ou fotoenvelhecimento da pele e para prevenir manchas da idade.