KR102667277B1 - 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물, 이의 제조 방법 및 화장품 또는 뉴트리코스메틱 조성물에서의 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주로 펩티드 가수분해물(hydrolyzate)을 우세하게 포함하는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물 및 상기 추출물을 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 추출물을 포함하는 화장료 또는 뉴트리코스메틱 조성물, 및 피부, 점막 또는 외피의 외양의 개선, 피부 및 점막의 건조 예방 및/또는 퇴치, 피부의 노화 및/또는 광노화의 신호 예방 및/또는 퇴치, 피부 미백 촉진 및 슬리밍 촉진을 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 화장품 및 뉴트리코스메틱 분야, 보다 구체적으로 스킨케어 조성물의 제형에 포함되는 활성 성분 분야에 관한 것이다. 본 발명은 주로 펩티드 가수분해물(hydrolyzate)을 우세하게 포함하는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정 모링가 페레그리나 종자 추출물을 수득하는 방법, 이러한 추출물을 포함하는 화장료 또는 뉴트리코스메틱 조성물, 및 마지막으로 피부, 두피(scalp) 및 외피(integument)를 관리하기 위한 이러한 조성물의 화장용 또는 뉴트리코스메틱 용도에 관한 것이다.
모링가과(Moringaceae)는 동아프리카로부터 아시아에 분포하는, 저자에 따르면 12 내지 14종으로 구성되는 사하라-신디안 식물상(Saharo-Sindian flora)의 요소인 단일-속 패밀리(모링가 아단스(Moringa adans), 1속만 존재)이다. 상기 속은 전통적으로 세 부분으로 나뉘지만 계통발생학적 분석에 의해 단일계통으로 확인되지는 않는다. 상기 분석은 오히려 특정 형태학적 특성을 중심으로 한 클레드(clade)을 밝혀냈다: 파키콜(pachycaul) ("병나무(bottle tree)"); "덩이 나무(tuberous tree)" 및 병나무나 덩이 나무가 아닌 나무("슬렌더 나무(slender tree)"). 모링가 페레그리나 (Forssk.) 피오리(Moringa peregrina (Forssk.) Fiori) 종은 세 번째 그룹에 속한다. 속이나 과에 대한 드문 유전 연구는 특히 인도 모링가(Indian Moringa), 모링가 올레이페라 램(Moringa oleifera Lam)과 관련하여 속의 다른 종에 비해 종의 실체를 확인시켜 준다. (특히 다음 기사 참조: Olson, M.E. 2002, Combining Data from DNA Sequences and Morphology for a Phylogeny of Moringaceae (Brassicales), Systematic Botany 27(1): 55-73; Hassanein, A.M.A. and Al-Soqee, A.A., 2018, Morphological and genetic diversity of Moringa oleifera and Moringa peregrina genotypes, Horticulture, Environment and Biotechnology 59(2): 251-261). 사우디 아라비아의 다양한 위치에서 샘플링된 모링가 페레그리나에 대한 최근 기사는 ITS 마커를 사용하여 종의 유전적 안정성이 있으나 (Alaklabi, A., 2015, Journal of Biological Sciences 22: 186-190), 높은 수준의 집단-내 유전적 변이가 존재한다고 결론지었다.
모링가 페레그리나 종은 예멘, 오만, 사우디 아라비아, 동부 아프리카, 수단, 에티오피아, 에리트레아, 소말리아 및 지부티의 암석 환경에서 발견된다. 이란에서의 존재는 남-동부 지역에 국한된 것으로 보이지만 확인이 필요하다 (PROTA14 = Munyanziza E. and Yongabi K.A., Vegetable oils/Oleaginous plants, Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, http://database.prota.org/protahtml/moringa peregrina_fr.htm, accessed on 10/23/2019). 중동 및 이집트에서, 이 종은 이제 주로 수단 지역의 일부 지역에서 드물게 분산된 잔존생물 서식지 (relicit station)(특정 고도에 있는 소수의 집단 제외)에서만 나타난다. 모링가 페레그리나는 오늘날 수단과 예멘에서도 희귀하고 위험에 처한 것으로 여겨진다. 이의 클레드의 다른 종들에 비해, 모링가 페레그리나는 가장 건조하고 척박한 서식지에 거주한다. 열대 및 아열대 지역에서 상업적으로 대규모로 재배되는 모링가 올레이페라보다 명백히 더 내건성(drought-resistant)이다. 최근 연구에 따르면 종자의 크기와 둘레는 발아 시간 및 어린 개체의 성장률 및 성장 속도에 유리한 영향을 미치는 것으로 나타났으며 (Gomaa N.H. and Picσ F.X., 2011, Seed germination, seedling traits, and seed bank of the tree Moringa peregrina (Moringaceae) in a hyper-arid environment, American Journal of Botany 98(6): 1024-1030), 이는 수보다는 종자 품질에 관한 자원 할당의 조정을 나타내며, 이는 모링가 페레그리나가 극도의(과-건조) 비생물적 환경에서 효율적으로 번식할 수 있도록 한다. 모링가 페레그리나 종자는 모링가 올레이페라 종자보다 세포층 측면에서 더 두꺼운 중앙 메소종피(mesotesta)를 갖는다.
모링가 페레그리나 오일이 이슬람 초기에 알-울라(Al-Ula) 지역에서 활발하게 거래되었음을 나타내는 몇 가지 역사적 보고가 존재한다(Naseef, A.A.S.,1995, Al-'Ula, A study of Cultural and Social Heritage). 모링가 페레그리나에서 생산된 오일은 오늘날 주로 개인 소비 또는 현지 시장으로 향한다. 사우디 아라비아에서 잎은 전통적으로 당뇨병, 장 질환, 안과 질환 및 빈혈 치료를 위한 내복용 탕약(decoction) (Abdel-Kader, M.S., Hazazi A.M. A., Elmakki O.A. and Alqasoumi S.I., 2018, A survey on the traditional plants used in Al Kobah village, Saudi Pharmaceutical Journal 26(6): 817-821) 및 이뇨제, 발적제(rubefacient), 및 수축제(astringent) (Aqeel A.A.M., Tariq M., Mossa J.S., Al-Yahya M.A. and Al-Said M.S., 1984, "Plants used in Arabian Folk medicine", Report submitted to Saudi Arabian National Centre for Science and Technology, Riyadh, Saudi Arabia)로서 사용되었다. 오만에서는 여름 말에 여성이 추출한 오일을 편두통, 발열, 화상, 열상 및 골절, 변비 및 복통을 퇴치하고 근육통 및 모발 건조를 퇴치하는 데 사용한다 (Ghazanfar S.A., 1994, Handbook of Arabian Medicinal Plants, 1st ed., CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, U.S.; Ghazanfar S.A., 1998, Plants of Economic Importance, cap. 15, in Ghazanfar, S.A. and Fisher, M. (ed.) Vegetation of the Arabian Peninsula. Geobotany 25, pages 241-264, Kluwer Academic Publishers, table 11.1, page 247 and 11.7 page 251). 이것은 또한 향이 나는 조성물 내에서(Ghazanfar S.A., 1998, page 259) 및 오만 및 예멘에서 얼굴 로션으로 사용되었다(Ghazanfar S.A. and Rechinger B., 1996, Two multi-purpose seed oils from Oman. Plants for Food and Medicine. Paper presented at the joint meeting of the Society for Economic Botany and International Society for Ethnopharmacology, July 1-7, 1996, London).
모링가 올레이페라 종자에서 유래한 추출물은 화장품 분야에 알려져 있다. 예를 들어, FR 296 879는 건조 추출물 100g 당 5% 내지 50%의 오일(트리글리세라이드, 지방산 및 극성 지질 포함) 및 0.01% 내지 5%의 폴리페놀을 함유하는 모링가 올레이페라의 전체 종자(whole seed)(표피 포함) 추출물, 및 이의 피부 노화 퇴치용 화장료 조성물에서의 그의 용도를 개시한다. 상기 문헌에서, 중간 극성(moderately polar) 용매를 사용한 추출이 모링가 올레이페라의 전체 종자에 대해 수행되었다.
FR 2 776 519로부터 탁한 물에 대한 정화 효과로 알려진 모링가 올레이페라 종자 유래 단백질 추출물이 피부와 점막에 대한 연화, 생리학적 조절, 보습, 재구성 및 복구 효과가 있으며 오염방지 효과가 있음을 알 수 있다. 상기 문헌에서, 활성 성분(active principle)은 pH 7.5에서 1시간 동안 4N 수산화나트륨을 사용하여 모링가 올레이페라 케이크의 수성 추출을 통해 얻은 6500 내지 8800 Da의 분자량을 갖는 단백질이다.
또한 FR 2 825 267을 통해 전체 또는 분쇄, 껍질이 있거나 껍질이 벗겨지지 않은 모링가 종자, 또는 밀링이 수행된 종자의 추출물 또는 탈지 또는 비-탈지 단백질 추출물이 탈취 및 불쾌한 냄새의 억제, 청결, 인티밋 위생(intimate hygiene), 구강 위생 및 덴탈 케어, 및 또한 피부의 연화, 보습, 진정 및 항피로 화장용 특성의 분야에서 효과가 있음을 알 수 있다. 상기 문헌에서, 전체 단백질 추출물은 종자가 오일을 제거하지 않을 때 증가된 활성을 갖는다는 것이 입증되었다.
FR 3 076 460은 민감한, 민감화된, 반응성이 있는, 취약한, 및/또는 무른 피부 및/또는 점막의 치료 및/또는 홍반, 특히 유아의 기저귀 발진의 치료 및/또는 예방을 위한 비-발아 및 오일-제거한 모링가 올레이페라 종자의 단백질 추출물의 용도에 관한 것이다. 상기 문헌에서, 추출 방법은 약 8800 Da의 분자량을 갖는 단백질의 주요 분획의 생산을 가능하게 한다.
마지막으로, KR2013/0088224는 특히 초임계 유체를 사용하여 추출하여 얻은 발아된 전체 모링가 올레이페라 종자의 추출물을 화장품에서 사용하는 것을 개시한다. 상기 방법은 미백 화장용 용도의 활성제로 기술되는 비극성 아미노산 및 카로티노이드를 분리하는 것을 가능하게 한다.
상기 언급된 모든 문헌은 모링가 올레이페라종의 사용과 관련이 있으며; 그들 중 누구도 화장품 분야에서 모링가 페레그리나 종으로부터 얻은 추출물의 사용에 대해 기술하지 않는다.
보다 구체적으로, 모링가 페레그리나 종의 경우 모링가 페레그리나의 잎 또는 전체 종자로부터 얻은 특정 페놀 및 플라보노이드 화합물은 항산화 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Al-Dabbas M., 2017, Antioxidant activity of different extracts from the aerial part of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, from Jordan, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 30(6): 2151-2157). 이러한 화합물은 잎 또는 전체 종자로부터 메탄올, 에틸 아세테이트 또는 헥산과 같은 용매로 추출된다. 가장 많은 양의 활성 화합물을 구성하는 것은 잎인 것으로 나타난다. Abu Tarboush et al. 의 XP055753092, 2005은 또한 또한 10시간 동안 효소 가수분해에 의해 생산된 껍질을 벗긴 모링가 페레그리나 종자 유래 가수분해물의 추출을 개시한다. 이 추출의 목적은 오일과 물을 흡수하는 능력이 우수한 제품을 얻는 것이다. 마지막으로, Nashef et al., XP0010830, 1977은 일반적으로 주로 순수한 단백질에 대한 알칼리 가수분해의 결과를 개시하며, 이는 단백질의 물리적 및 화학적 특성, 및 또한 영양적 가치의 변형을 초래할 수 있다. 0.1M 수산화나트륨과 함께 사용된 가수분해 조건은 24시간 동안 50℃의 온도이다. 상기 문헌은 이러한 조건에서 염기로 처리된 단백질을 먹인 래트의 신장 병변에 대해 언급한다.
따라서 모링가 속 중 사용되는 종에 따라, 식물 부분(잎 또는 종자), 종자 부분(전체 종자 또는 기타, 껍질이 있거나 없는) 및 수행되는 추출 공정, 특히 용매의 선택에 따라 추출되는 분자가 다른 것으로 관찰된다. 이제, 추출물의 구성은 생물학적 활성 및 결과적으로 화장용 효능에 영향을 미친다.
상기를 감안할 때, 본 발명이 해결하고자 하는 한 가지 문제는 화장품에 사용될 수 있고 사용하기 쉬운 모링가 속 및 모링가 과(family Moringaceae)의 모링가 페레그리나 종의 추출물을 기반으로 하는 신규한 제품을 개발하는 것이다.
따라서, 본 출원인은 피부, 점막 및 외피의 외양을 개선하고 특히 피부 및/또는 점막의 건조 예방 및/또는 퇴치, 피부의 노화 및/또는 광노화의 신호 예방 및/또는 퇴치, 피부 미백 촉진 및 노화 마크 예방, 및 또한 슬리밍 촉진 및 붉은 피부 예방 또는 완화용 모링가 페레그리나 종의 종자 케이크로부터 얻은 신규한 추출물을 밝혀냈다. 본 발명에 따른 추출물은 주로 모링가 페레그리나 종자 케이크의 펩티드 가수분해물을 포함한다. 구체적으로 껍질을 벗기지 않은 모링가 페레그리나 종자의 케이크로부터 얻은 추출물은 첫째로 사용된 특정 종의 기원 및 둘째로 이의 특정 분자적 프로파일로 인해 선행 기술의 추출물에 비해 화장품 분야에서 두 가지 측면에서 신규하다.
프랑스 공화국 정부와 사우디 아라비아 왕국 간의 2018년 4월 10일 정부 간 협정에 따라, 본 출원인, Agence Francaise Pour Le Developpement d'Al Ula (AFALULA) 및 Commission Royale pour AlUlA (RCU)가 특히 토착 식물 유래 천연 제품의 지역적 생산(local production)을 위한 지속 가능한 농업 및 지역 경제를 발전시키고, 및 사우디 아라비아 왕국의 알울라(AlUla) 지역의 생물 다양성 및 권리를 보호하는 프로젝트를 공동으로 한다. 사우디아라비아 왕국은 2020년 10월 8일부터 나고야 의정서의 멤버이다. 본 특허의 초안을 작성할 당시, 나고야 의정서가 현지법의 관련 측면에 통합될 것인지 관한 시행중인 규제가 검토 중이다. 결과적으로, 이 단계에서 사우디아라비아 왕국은 현재 특허 출원 및 나고야 의정서와 관련하여 특정 자격 요건이 없다. 따라서 특허출원일 현재 유전자원(genetic resource)에 대한 접근에 관한 준수요건에 대한 증명서는 존재하지 않는다.
본 발명의 제1 주제는 분자량이 100 Da 내지 6000 Da, 바람직하게는 1500 Da 내지 5000 Da, 보다 바람직하게는 3000 Da 내지 4500 Da인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드 및 글리코펩티드를 포함하는 펩티드 가수분해물을 주로 포함하고, 모링가 페레그리나의 열매가 익었을 때, 껍질을 벗기지 않은 종자로부터 16 내지 25℃의 온도에서 약 2시간 동안 pH 13 초과에서 화학적 단백질 분해에 의해 얻어지는 것인 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물이다.
이의 특정 특징으로 인해, 본 발명에 따른 추출물은 모링가 속 및 모링가 과에서 독특하다. 모링가 페레그리나 종의 추출물은 다른 종, 특히 출원인이 공개한 모링가 올레이페라 종과 다른 펩티드 가수분해물을 가지고 있음이 입증될 것이다.
본 발명의 제2 주제는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물을 얻기 위한 방법으로서:
a) 모링가 페레그리나의 과실이 익었을 때 수확한 껍질을 벗기지 않은 종자를 수집하고 건조시켜 내부 수분 함량이 8% 미만이 되도록 하는 단계,
b) 상기 건조된 종자를 압착하여 나머지 종자로부터 오일을 분리하여 잔류 오일을 6중량% 미만으로 포함하는 케이크를 얻는 단계,
c) 상기 b)단계에서 얻은 케이크를 밀링(mill)하는 단계,
d) 상기 c)단계에서 얻은 밀링된 케이크를 수성 상에 분산시키는 단계,
e) 상기 d)단계에서 얻은 수성 분산액의 화학적 단백질분해를 13 초과의 pH 및 16 내지 25℃의 온도에서 약 2시간 동안 수행하는 단계,
f) 단백질 분해를 중화시켜 얻은 펩티드 가수분해물을 안정화시키는 단계;
g) 펩티드 가수분해물을 고체/액체 분리에 의해 회수하는 단계,
h) 상기 펩티드 가수분해물을 한외여과에 의해 정제하는 단계, 및 선택적으로,
i) 상기 h)단계에서 얻은 펩티드 가수분해물의 동결건조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제3 주제는 활성제로서 유효량의 본 발명에 따른 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 화장료 또는 뉴트리코스메틱 조성물이다.
마지막으로, 본 발명의 제4 주제는 피부, 점막 또는 외피의 외양의 개선, 피부 및 점막의 건조 예방 및/또는 퇴치, 피부의 노화 및/또는 광노화의 신호 예방 및/또는 퇴치, 피부 미백 촉진 및 슬리밍 촉진을 위한 본 발명에 따른 조성물의 화장용 또는 뉴트리코스메틱 용도이다.
첨부된 도면을 참조로 하여, 단지 예시를 위해 그리고 제한 없이 제공되는 본 발명의 몇몇의 특정 구체예의 하기 기술로부터 본 발명은 더 잘 이해될 것이고 이의 추가 목적, 세부사항, 특징 및 이점은 더 명확하게 나타날 것이다.
[도 1]은 다양한 제품의 피부 표면에 대한 보습 효과를 비교한 결과를 나타낸다.
[도 1]은 다양한 제품의 피부 표면에 대한 보습 효과를 비교한 결과를 나타낸다.
본 명세서에서, 달리 명시되지 않는 한, 범위가 주어질 때, 그것은 상기 범위의 상한 및 하한을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명에서 하기 약어는 하기에 주어진 의미를 갖는다:
- MTT: 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT 테스트는 생세포 카운팅을 위한 빠른 방법이다)
- SDS: 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate)
- PBS: 인산완충식염수(Phosphate-Buffered Saline)
- ELISA: 효소-결합 면역흡착 분석
- PCR: 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)
- ANOVA: 분산 분석(Analysis Of Variance)
- MSH: 멜라닌 세포 자극 호르몬
본 발명에서는 하기 정의가 적용된다:
- "주로 펩티드 가수분해물": 건조 물질의 양의 10% 초과, 바람직하게는 20% 초과, 보다 바람직하게는 30% 초과 및 최대 약 40%(질량/질량)의 펩티드, 올리고펩티드, 글리코펩티드, 및 아미노산 또는 이의 휘발성 니트릴 유도체의, 보다 바람직하게는 건조 물질의 50중량%.
- "유효량": 원하는 결과, 즉 특히 피부의 외양을 향상시킬 수 있게 하는 활성 분자의 필요한 양.
- "단백질 분해": 화학적 또는 효소적 가수분해를 통한 단백질의 펩티드, 올리고펩티드 및 이의 기본 단편(아미노산)으로의 분할.
- "국소 적용": 본 발명에 따른 활성 성분 또는 이를 함유하는 조성물을 피부 표면, 점막 또는 외피에 적용하거나 펴바르는 것.
- "생리학적으로 허용가능한": 독성, 비적합성, 불안정성 또는 알레르기 반응의 위험 없이 국소 사용, 인간 피부 접촉, 또는 다른 투여 경로, 예를 들어 경구 또는 피부 주사를 통한 사용에 적합한.
- "케이크": 압착 후 종자의 오일을 제거한 부분. 종자에서 오일을 추출한 것으로부터 생기는 고체 잔류물이다. 이는 오일 제조 과정인 그라인딩 작업의 부산물(co-product)이다. 일반적으로 종자 질량의 50% 내지 75%를 나타낸다.
- "껍질을 벗기지 않은 종자": 수확한 종자의 껍질(과피(pericarp)) 및 표피(tegument)가 인(kernel) 주위에 유지되는 것을 의미한다.
- "열매가 익었을 때": 열매가 익은 것을 의미하며, 바람직하게는 꼬투리가 열개하기 시작하여 짙은 베이지색에서 갈색으로 변하고 꼬투리 아래쪽 4분의 1의 180°트위스트가 꼬투리 조각(valve)의 열림을 유발할 때를 의미한다.
- "약": 주어진 정보에 대해 플러스 또는 마이너스 10% 내지 20%의 차이.
- "활성 분자 풀", 또한 "활성 성분(active principle)": 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터 본 발명의 방법에 따라 추출된 펩티드 가수분해물. 이 가수분해물은 본 발명에 기술된 생물학적 활성을 담당한다.
- "활성제(active agent)": 기술된 생물학적 활성을 얻기에 충분한 양의 본 발명에 따른 추출물. 추출물이 액체인지 건조되었는지, 농축되었는지 아닌지 여부에 따라, 활성제의 양은 조성물의 총 중량에 대해 0.002중량% 내지 40중량%의 비율로 가변적일 수 있다.
- "피부 노화의 신호": 노화로 인한 피부 및 외피의 임의의 변형, 예를 들어 주름 및 잔주름, 주름이 쪼글쪼글한 피부, 처진 피부, 얇아지는 피부(thinning skin), 피부의 탄력 및/또는 톤의 부족, 거칠고 광택이 없는 피부 또는 피부의 색소침착, 모발 변색 또는 손톱 얼룩, 뿐만 아니라 자외(UV) 방사선 노출 후 임의의 피부의 내부 악화(degradation)와 같이 변형된 외관에 의해 체계적으로 반영되지 않는 임의의 피부의 내부 변형.
본 발명의 제1 주제는 분자량이 100 Da 내지 6000 Da, 바람직하게는 1500 Da 내지 5000 Da, 보다 바람직하게는 3000 Da 내지 4500 Da인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드 및 글리코펩티드를 포함하는 펩티드 가수분해물을 주로 포함하고, 모링가 페레그리나의 열매가 익었을 때, 껍질을 벗기지 않은 종자로부터 16 내지 25℃의 온도에서 약 2시간 동안 pH 13 초과에서 화학적 단백질 분해에 의해 얻어지는 것인 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물이다.
펩티드, 올리고펩티드, 글리코펩티드 및 아미노산을 포함하는 펩티드 가수분해물은 하기에 정의된 프로파일에서와 같이 모링가 페레그리나 속의 종자 추출물에서 전혀 입증된 바가 없다. 모링가 페레그리나 종은 매우 건조한 기후에서 자란다. 따라서, 이의 가뭄에 적응하고 극한(extremophilic) 환경에서 번식하는 능력으로 인해 독특한 특징을 획득할 수 있으며, 출원인은 이를 모링가 페레그리나 종자 케이크에 특정한 추출 방법의 사용을 통해 알아낼 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 선택된 식물 부분은 모링가 페레그리나 종자의 케이크이다. 모링가 페레그리나 종자는 이들의 오일 추출에 사용되는 것으로 알려져 있으며, 이는 개인의 소비 또는 다양한 전통 의약 치료에 유용하다. 종자에서 오일을 제거한 후 얻은 케이크는 현재 특히 동물 사료로 사용되는 폐기물이다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물은 껍질을 벗기지 않은 모링가 페레그리나 종자의 케이크로부터 얻어진다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물의 펩티드 가수분해물은 100 Da 내지 6000 Da, 보다 구체적으로 1500 Da 내지 5000 Da 및 보다 더 구체적으로 3000 Da 내지 4500 Da의 분자량을 갖는 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드 및 글리코펩티드를 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 추출물은 또한 0.3% 내지 3%의 휘발성 화합물을 포함하며, 이들 화합물의 50%, 즉 본 발명에 따른 추출물의 0.15% 내지 1.5%는 경질 니트릴(light nitrile) 화합물, 주로 이소부티로니트릴(isobutyronitrile) 및 메틸부탄니트릴(methylbutanenitrile)로 구성되며; 이들 화합물 중 5% 내지 10%, 즉 본 발명에 따른 추출물의 0.015% 내지 0.3%가 이소티오시아네이트(isothiocyanate) 유도체, 주로 이소프로필 이소티오시아네이트 및 이소부틸 이소티오시아네이트로 구성되고; 이들 화합물 중 1% 내지 5%, 즉 본 발명에 따른 추출물의 0.003% 내지 0.15%가 에센셜 오일, 주로 유칼립톨(eucalyptol), 멘톨 및 벤즈알데히드로 구성된다.
본 발명의 제2 주제는 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물을 얻기 위한 방법으로서:
a) 모링가 페레그리나의 과실이 익었을 때 수확한 껍질을 벗기지 않은 종자를 수집하고 건조시켜 내부 수분 함량이 8% 미만이 되도록 하는 단계,
b) 상기 건조된 종자를 압착하여 나머지 종자로부터 오일을 분리하여 잔류 오일을 6중량% 미만으로 포함하는 케이크를 얻는 단계,
c) 상기 b)단계에서 얻은 케이크를 밀링(mill)하는 단계,
d) 상기 c)단계에서 얻은 밀링된 케이크를 수성 상에 분산시키는 단계,
e) 상기 d)단계에서 얻은 수성 분산액의 화학적 단백질분해를 13 초과의 pH 및 16 내지 25℃의 온도에서 약 2시간 동안 수행하는 단계,
f) 단백질 분해를 중화시켜 얻은 펩티드 가수분해물을 안정화시키는 단계;
g) 펩티드 가수분해물을 고체/액체 분리에 의해 회수하는 단계,
h) 상기 펩티드 가수분해물을 한외여과에 의해 정제하는 단계, 및 선택적으로,
i) 상기 h)단계에서 얻은 펩티드 가수분해물의 동결건조하는 단계를 포함한다.
껍질을 벗기지 않은 종자, 즉 껍질(과피)이 유지되는 종자는 열매가 익었을 때 및 바람직하게는 꼬투리가 열개하기 시작에 있을 때 수집된다.
상기 종자는 내부 수분 함량이 8% 미만 및 바람직하게는 약 6%가 되도록 건조되며; 상기 건조는 바람직하게는 햇빛으로부터 보호되는 통풍 랙, 바람직하게는 야외(open air) 그늘 아래에서 수행된다.
그런 다음 건조된 종자를 냉압착 방식으로 즉석에서 밀링하여 오일이 압축된 종자, 즉 케이크의 나머지 부분에서 기계적으로 분리되도록 한다.
상기 케이크는 이후 해머 밀(hammer mill), 플레일 밀(flail mill), 나이프 밀(knife mill), 파쇄/분쇄 밀(crushing/shredding mill), 볼 밀(ball mill) 또는 페슬 밀(pestle mill)뿐만 아니라 임의의 유형의 크라이오밀(cryomill)과 같은 임의의 유형의 기계적 밀로 기계적으로 밀링된다.
상기 d)단계에 따른 수상에서의 분산 및 상기 e)단계에 따른 단백질 분해는 유리하게는 항상 교반 하에 수행되며, 따라서 액체 내의 고체의 분산 및 균질화를 가능하게 하여 따라서 전체 교환 표면(exchange surface) 및 결과적으로 단백질 분해를 향상시킨다.
1 초과, 바람직하게는 약 1.1의 밀도를 갖는 액체 펩티드 가수분해물이 얻어지며, 이는 10% 내지 15%, 바람직하게는 약 12.5%의 건조 물질 함량을 포함하고, 이는 1% 내지 6%의 질소 화합물, 특히 0.5% 내지 1.5%, 바람직하게는 약 0.8%의 비율의 휘발성 니트릴 유도체 및 20mg/리터의 폴리페놀(0.0002%)을 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 g)단계의 고체/액체 분리는 원심분리, 탈수 또는 여과와 같은 다양한 방법에 의해 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 h) 단계의 한외여과는 100 Da 내지 6000 Da, 보다 특히 1500 Da 내지 5000 Da, 보다 더 특히 3000 Da 내지 4500 Da의 컷오프 역치(threshold)로 수행된다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 상기 종자 케이크 추출물을 얻는 방법은 껍질을 벗기지 않은 종자 케이크의 단백질분해에 의해 얻어지며, 이는 교반 하에, 수용성 용매 내 사용된 총 중량에 대해 25 중량% 이하 고체 물질의 비율로, 약 2시간 동안 16 내지 25℃의 온도에서 행해진다.
얻어진 액체 모링가 페레그리나 추출물을 얻는 방법의 일 구체예에서, 상기 펩티드 가수분해물을 증류, 미세여과(microfiltration), 한외여과 및/또는 나노여과에 의해 정제시켜 추출물을 또한 추출된 휘발성 니트릴 유도체에 비해 관심 있는 화합물로서 농축시킨다. 이러한 정제 단계는 언급된 바와 같은 다른 추출된 화합물을 희생시키면서 관심 화합물의 풀을 농축하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 추출 방법의 또 다른 구체예에서, 상기 얻어진 액체 추출물을 건조시켜 건조 물질의 양의 10% 초과, 바람직하게는 20% 초과, 보다 바람직하게는 30% 초과 및 최대 약 40%(질량/질량)의 펩티드, 올리고펩티드, 글리코펩티드, 및 아미노산 또는 이의 휘발성 니트릴 유도체, 보다 바람직하게는 건조 물질의 50 중량%로 함유하는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 건조 추출물을 얻는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 얻어진 액체 모링가 페레그리나 종자 케이크 추출물은 바람직하게는 건조되며, 예를 들어 분무화(atomization), 동결건조 또는 지오드레이션(zeodration)에 의해 건조되어 고체 모링가 페레그리나 종자 추출물이 얻어지고, 물은 증발된다. 상기 건조는 말토덱스트린, 시클로덱스트린 또는 이눌린과 같은 유기 지지체(organic support)의 존재 또는 필로실리케이트, 마그네슘 실리케이트 또는 이들의 탄산염 및 염과 같은 건조 지지 첨가제(drying support additive)의 존재하에 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 추출 방법을 통해 얻을 수 있는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 제3 주제는 활성제로서 유효량의 본 발명에 따른 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 화장료 또는 뉴트리코스메틱 조성물이다.
본 발명에 따른 조성물은 국소 투여 또는 경구 투여에 적합한 다양한 제제의 형태로 제형화될 수 있다.
제1 변형에 따르면, 상기 다양한 제제는 국소 투여에 적합하고 크림, 수중유 및 유중수 에멀젼, 밀크(milk), 연고, 로션, 오일, 밤, 수성 또는 수성-알코올성 또는 글리콜산 용액, 세럼, 분말, 패치, 스프레이 또는 임의의 외용 제품(예: 의료 기기 또는 화장품-섬유(cosmetic-textile) 제품)을 포함한다.
제 2 변형에 따르면, 상기 다양한 제제는 경구 투여에 적합하며; 식품 조성물 또는 식품 보충제에 포함될 수 있는 펩티드 가수분해물을 포함하는 식물 추출물이 있다. 상기 식품 보충제는 본 발명의 맥락에서 경질 겔 캡슐 또는 연질 젤라틴 또는 식물성 캡슐의 형태일 수 있다. 또한, 상기 식품 보충제는 0.01 중량% 내지 100 중량%의 식물 추출물을 함유할 수 있다.
식품 용도의 맥락에서, 영양 또는 화장용(코스메토-푸드(cosmeto-food) 또는 뉴트리코스메틱) 목적을 위해, 상기 조성물은 유리하게는 경구 투여에 적합한 제제의 형태로 제형화될 것이다. 이는 부형제를 포함하지 않을 수 있고, 그 전체가 건조 형태의 펩티드 가수분해물을 포함하는 식물 추출물로 구성될 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 더욱 특히 국소 투여용으로 의도된다. 따라서 이러한 조성물은 화장용으로 허용되는 배지, 즉 피부 및 외피에 적합한(compatible) 배지를 함유해야 하고 모든 화장용 형태를 커버해야 한다. 이들 조성물은 특히 크림, 수중유 또는 유중수 에멀젼 또는 복합 에멀젼, 세럼, 용액, 현탁액, 겔, 밀크, 로션, 스틱 또는 고른 분말의 형태일 수 있고 피부, 입술 및/또는 외피 적용에 적합할 수 있다. 이들 조성물은 용매, 연화제(emollient), 증점제(thickener), 희석제, 계면활성제, 항산화제, 생물활성제, 염료, 보존제 및 방향제와 같은 제형화에 필요한 부형제를 포함한다. 스킨케어 제품 및/또는 스킨 메이크업 제품으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 특히 헤어케어 조성물, 특히 샴푸, 헤어 컨디셔너, 트리트먼트 로션(treating lotion), 스타일링 크림 또는 겔, 헤어 재구성 로션, 마스크 등으로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 특히 헹굼(ringing)이 뒤따를 수도 있고 아닐 수도 있는 적용을 포함하는 트리트먼트에 또는 대안적으로 샴푸의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 비듬 방지 치료에 유리하게 사용될 수 있다. 이는 또한 특히 속눈썹, 눈썹 또는 모발에 브러시 또는 빗을 사용하여 적용되는 염료 또는 마스카라 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 예상되는 적용 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 첨가제 및 또한 이들의 제형화에 필요한 아주번트, 예컨대 용매, 증점제, 희석제, 항산화제, 염료, 선스크린, 셀프-태닝제, 안료, 충전제, 방부제, 방향제, 냄새 흡수제, 화장용 또는 약학적 활성제, 에센셜 오일, 비타민, 필수 지방산, 계면 활성제, 필름 형성 폴리머 등을 포함할 수 있다.
INCI 사전 & 핸드북(Personal Care Products Council Inc., Washington, D.C.에서 발행한 International Nomenclature of Cosmetic Ingredients" (13th edition, 2010))은 본 발명에 따른 조성물에서 추가 구성성분으로 사용하기에 적합한, 스킨케어 산업에서 일반적으로 사용되는 다양한 화장용 및 약학적 구성성분을 제한 없이 기재한다.
어떤 경우든, 당업자는 본 발명에 따른 조성물의 원하는 유리한 특성이 불리하게 영향을 받지 않도록 이러한 아주번트 및 이들의 비율이 선택되도록 주의할 것이다.
본 발명의 일 유리한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물 중 식물 추출물의 양은 조성물의 총 중량에 대해 0.002 중량% 내지 20 중량%, 특히 0.01 중량% 내지 10 중량%이다.
본 발명의 또 다른 유리한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물 중 식물 추출물의 양 또는 함량은 조성물의 총 중량에 대해 0.01 중량% 내지 100중량%이다. 보다 바람직하게는, 상기 식물 추출물의 양은 조성물의 총 중량에 대해 0.02 중량% 내지 40 중량%, 특히 0.2 중량% 내지 20 중량%이다.
본 발명의 제4 주제는 피부, 점막 또는 외피의 외양의 개선, 피부 및 점막의 건조 예방 및/또는 퇴치, 피부의 노화 및/또는 광노화의 신호 예방 및/또는 퇴치, 피부 미백 촉진 및 슬리밍 촉진을 위한 본 발명에 따른 조성물의 화장용 또는 뉴트리코스메틱 용도이다.
본 발명이 몇 가지 특정 구체예와 관련하여 설명되었지만, 그것이 어떤 식으로든 이에 제한되지 않고 본 발명의 맥락에 속하는 경우라면 기재된 수단의 모든 기술적 등가물 및 이들의 조합을 포함한다는 것은 매우 명백하다.
동사 "함유하다(contain)", "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(include)"와 그 활용형의 사용은 청구범위에 명시된 것 이외의 요소 또는 단계의 존재를 배제하지 않는다.
실시예
실시예 1:
모링가 페레그리나
케이크 유래 본 발명에 따른 식물 추출물 제조
열매가 익었을 때 얻은 모링가 페레그리나(Forssk.) 피오리의 종자를 내부 수분 함량이 8% 미만, 바람직하게는 약 6%가 되도록 건조시킨 후, 이후 기계식 엔드리스 스크류 프레스(endless screw press)로 압착시켜 한편으로는 버진 페레그리나 오일(virgin peregrina oil) (INCI 명칭: "모링가 페레그리나 종자유(Moringa peregrina seed oil)"을 얻고, 다른 한편으로는 케이크를 얻기 위해 종자의 나머지에서 오일을 분리시킨다. 그런 다음 케이크는 추출이 수행된 1 내지 2cm 조각으로 미리 절단된 롤 형태로 분리된다. 상기 방법에 사용된 원료의 조성은 하기와 같다.
프로토콜:
a) 강알칼리제, 특히 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화칼슘의 1몰 농도의 용액, 또는 1몰 농도의 강알칼리제, 그러나 바람직하게는 수산화나트륨의 수성 혼합물을 제조하는 단계; 상기 강알칼리성 용액은 pH가 13초과이며,
b) 약 1cm 크기의 조각으로 미리 자른 페레그리나 케이크를 알칼리 용액에 [1:10](질량/질량)의 비율로 칭량하는 단계
c) 상기 b)단계에서 얻은 케이크를 밀링(mill)하는 단계,
d) 상기 c)단계에서 얻은 밀링된 케이크를 수성 상에 분산시키는 단계,
e) 상기 d)단계에서 얻은 수성 분산액의 화학적 단백질분해를 20℃의 온도에서 약 2시간 동안 수행하는 단계,
f) 얻은 펩티드 가수분해물을 안정화시키기 위해 용액의 pH를 4.5-5.5 범위로 완충시키도록 약산으로 단백질분해를 중화시키는 단계;
g) 펩티드 가수분해물을 고체/액체 분리에 의해 회수하는 단계,
h) 상기 펩티드 가수분해물을 한외여과에 의해 정제하는 단계.
약 12.48%의 건조 물질을 함유하는 반투명 노락색 여액이 얻어진다. 얻어진 액체 추출물은 이하 "본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물" 또는 "페레그리나 펩티드 가수분해물"로 지칭된다. 이 액체 추출물은 이후 효율성 테스트를 위해 사용된다.
본 발명에 따른 이러한 페레그리나 펩티드 가수분해물은 1 초과 및 바람직하게는 약 1.1의 밀도를 가지며, 10% 내지 15%, 바람직하게는 약 12.5%의 건조 물질 함량을 포함하고, 1% 내지 6%의 질소 화합물, 주로 펩티드 및 글리코펩티드, 및 또한 0.5% 내지 1.5%, 바람직하게는 약 0.8% 비율의 휘발성 니트릴 유도체, 및 20mg/리터의 폴리페놀(0.0002%)을 포함한다. 본 발명에 따른 페레그리나 가수분해물의 휘발성 화합물의 조성은 하기와 같다.
페레그리나 펩타이드 가수분해물은 이소프로필 이소티오시아네이트 및 이소부틸 이소티오시아네이트를 비교적 높은 수준으로 함유하고 있어, 상기 종에 대한 이전 간행물을 확인한다 (Kjaer et al. 1979, Isothiocyanates in Myrosinase-treated seed extracts of Moringa peregrina, Phytochemistry, 18, pages 1485-1487; Afsharypuor et al., 2010, Volatile Constituents of the Seed Kernel and Leaf of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, Agricolt. Cultivated in Chabahar (Iran), Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6(2): 141-144; Dehshahri S. et al., 2012, Determination of volatile glucosinate degradation products in seed coat, stem and in vitro cultures of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, ScienceOpen, Research in Pharmaceutical Sciences 7(1): 51-56). 이소티오시아네이트는 십자화목(order Brassicales)에 속하는 다양한 식물, 특히 배추과(Brassicaceae), 카파리스과(Capparaceae), 파파야과(Caricaceae) 및 모링가과(Moringaceae)에서 병원체의 공격에 대한 방어 시스템으로 생산되는 화합물이다. 모링가 속에서는 M. 올레이페라 및 M. stenopetala (Baker F.) Cufold에서 특히 확인되었다 (Abd Rani N.Z., Kharaina, H. and Kumolosasi, E., 2018, Moringa genus: A Review of Phytochemistry and Pharmacology, Frontiers in Pharmacology, volume 9, art. 108). 이소티오시아네이트는 식물 조직이 손상될 때 효소 미로시나제(myrosinase)에 의한 글루코시놀레이트의 가수분해로부터 유래한다. 이소티오시아네이트는 항진균 활성(Troncoso-Rojas, R. and Tiznado-Hernαndez, M.E., 2007, Natural compounds to control fungal diseases in fruits & vegetables, in Troncoso-Rojas, R., Tiznado-Hernαndez, M.E., Gonzαlez-Leσn, A. (eds) Recent advances in alternative postharvest technologies to control fungal diseases in fruits & vegetables. Editorial. Transworld Research Network, Kerala, India, pages 127-156; Troncoso-Rojas, R. et al., 2005, Analysis of the isothiocyanates present in cabbage leaves extract and their potential application to control Alternaria rot in bell peppers, Food Research International 38:701-708), 항균, 항암, 및 항염증 효과(Park, E.J. et al., 2011, Inhibition of lipopolysaccharide induced cyclooxygenase-2 expression and inducible nitric oxide synthase by 4-[(2'-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy)benzyl]isothiocyanate from M. oleifera, Nutrition and Cancer 63(6): 971-982; Rajan, T.S. et al., 2016, Anticancer activity of glucomoringin isothiocyanate in human malignant astrocytoma cells, Fitoterapa 110: 1-7; Padla E.P. et al., 2012, Antimicrobial isothiocyanates from the seeds of Moringa oleifera Lam, Zeitschrift f 
r Naturforschung C, 67, 557-564; Waterman, C. et al., 2014, Stable, water extractable isothiocyanates from Moringa oleifera leaves attenuate inflammation in vitro. Phytochemistry 103: 114-122)와 같은 다양한 생물학적 효과가 있는 것으로 보고된다. 푸르푸랄은 이러한 종류의 종자 및 수많은 말린 과일에서 매우 표준 농도로 존재하며 발견된다. 이황화탄소, 이소부티로니트릴, 메틸 이소부티레이트, 메틸부탄니트릴 및 헥산니트릴은 아미노산에서 파생된 휘발성 화합물이다. 그들은 단백질 분해 마커이다. 이러한 분해 화합물은 가수분해된 페레그리나 케이크 추출물 내 휘발성 화합물의 약 50%를 나타낸다. 이 결과는 추출물이 주로 단백질 또는 펩타이드로 구성됨을 보여준다. 극소량의 지방 또는 유리당이 가수분해된 모링가 페레그리나 추출물, 및 에센셜 오일에서 검출되었으며, 후자는 약 1%의 멘톨, 1%의 유칼립톨 및 약 2%의 벤즈알데히드의 존재와 함께 4%의 휘발성 화합물을 나타낸다. 건조 물질에서 시트레이트 완충액(당류 화합물)은 나머지의 약 50%를 나타내며 단백질, 올리고펩티드 및 아미노산의 단백질 분해에 의한 분해로 인한 글리코실화(당류) 화합물을 포함한다. 마지막으로, 페레그리나 종자에서 유래된 약 20mg/리터의 폴리페놀(0.0002%)의 존재에 주목해야 한다. 벤조산은 추출물에 첨가되는 안정제이기 때문에 특성화에서 고려하지 않는다. 이 액체 여액은 본 발명에 따른 추출물을 구성하고 하기 시험에서 순수한 형태로 사용된다.
상기 기재된 추출물의 건조 물질은 액체 추출물에 존재하는 증발 전후의 질량을 기준으로 중량법(gravimetric method)을 통해 얻어진다. 이 건조물(dry mass)은 주로 부분적으로 분해되고 수용성인 100 내지 6000 Da의 분자량을 갖는 단백질 및 당단백질로 구성되며, 모링가 페레그리나 케이크의 가수분해로부터 유래되는 올리고펩티드 또는 글리코-올리고펩티드 또는 본 발명에 따른 펩티드 가수분해물로 지칭된다. 상기 건조 추출물은 또한 정적 가수분해 상태에서 이러한 올리고펩티드 및 글리코-올리고펩티드를 안정화시키는 소듐 시트레이트 완충액을 포함한다. 마지막으로, 이 추출물은 소듐 벤조에이트와 같은 수용성 보존제로 미생물학적으로 안정화된다.
실시예 2: 항산화제로서의 본 발명에 따른
페레그리나
펩티드 가수분해물의 효과
이 연구의 목적은 DPPH(2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질) 라디칼 및 참조 항산화제인 아스코르브산을 사용한 무세포 인 비트로 비색 모델(colorimetric model)에서 페레그리나 펩티드 가수분해물에 의한 항산화 활성의 조절을 평가하는 것이다. 사용된 방법은 억제하는 것으로 알려져 있다. 이것은 참조 항산화제인 아스코르브산을 사용할 때, 540nm에서 흡수하는 보라색 산화 라디칼 DPPH의 분해를 기반으로 한다. 이 반응은 양성 대조군으로 작용하며 무색 또는 심지어 옅은 노란색인 DPPH 화합물을 형성한다. 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물 및 참조 생성물 "아스코르브산"을 40℃에서 30분 동안 DPPH 용액과 접촉시키도록 둔다. 이후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 평가한다. 이 활성의 조절은 테스트된 활성제에 의한 항산화 활성 자극의 백분율로서, 참조로 아스코르브산(T+)의 존재 하에 얻은 최대 항산화 활성과 함께 표시된다.
프로토콜: DPPH 용액을 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물의 부재(대조군) 또는 존재(T+) 및 감소하는 농도의 테스트 샘플에서 40℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 마지막에, 40℃에서 30분 후에 염색을 통해 참조 생성물의 존재 및 페레그리나 펩티드 가수분해물의 존재 또는 부재에 따른 항산화 활성을 밝혔다. 따라서 540 nm에서 반응 배지의 흡광도를 측정하여 평가하였다. 테스트된 각 농도에 대해, 테스트 생성물을 통한 항산화 활성 조절은 하기 공식에 따라 계산된다.
[수학 공식. 1] 항산화 활성 조절 백분율 = 100 x [(OD540 대조군 - OD540 테스트 생성물)/OD540 참조 생성물].
결과가 음수인 경우, 테스트 제품은 산화로 여겨지며; 결과가 양수인 경우. 백분율은 자유-라디칼-소거 활성의 자극으로 표시된다. 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물을 통해 얻어진 DPPH 억제 결과는 하기와 같다.
결론: 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 자유 라디칼로부터의 보호가 가능하다: 1% 이상의 농도에서 상당한 항산화 특성을 갖는다.
실시예 3: 메탈로프로테아제 억제제로서의 본 발명에 따른
페레그리나
추출물의 효과
본 연구의 목적은 I형 콜라게나제 및 기질 복합체인 히알루로니다제 및 발색단인 닌히드린을 사용하여 인 비트로 무세포 모델에서 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물에 의한 항-탈로프로테아제 활성의 조절을 평가하는 것이다. I형 콜라게나제 및 히알루로니다제의 완충 용액은 80℃에서 15분 동안 인큐베이션을 통해 특정 기질 복합체와 반응하여 이를 변형시켜 발색단을 활성화할 수 있는 화합물을 형성한다. 따라서 콜라게나제 및 히알루로니다제 활성은 565 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 평가될 수 있다. 샘플을 5분 동안 37℃에서 효소 기질 복합체와 함께 콜라게나제 및 히알루로니다제 용액과 접촉하도록 둔다. 80℃에서 15분 동안 인큐베이션을 통해 효소로 변환된 기질은 발색단을 활성화시킬 수 있다. 샘플의 존재/부재에서의 콜라게나제 및 히알루로니다제 활성은 565 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 평가된다. 이 활성의 조절은 활성제의 부재, 즉 효소 기질만의 존재 하에서 콜라게나제 및 히알루로니다제 활성의 억제 또는 활성화의 백분율로 표현된다.
프로토콜: I형 콜라게나제 및 히알루로니다제 효소의 용액을 본 발명에 따른 시험된 페레그리나 추출물의 부재 또는 존재하에 기질에서 5분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 용액을 발색체인 닌히드린과 접촉시킨 다음 80℃에서 15분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 마지막에, 테스트 또는 참조 생성물의 존재 또는 부재 하 콜라게나제 및 히알루로니다제 효소의 활성을 565 nm에서 반응 배지의 흡광도를 측정하여 평가하였다. 테스트한 각 농도에 대해, 테스트 생성물을 통한 콜라게나제 및 히알루로니다제 효소적 활성의 조절은 하기 공식에 따라 계산된다.
[수학 공식. 2] 콜라게나제/히알루로니다제 효소적 활성 조절 백분율 = 100 x [(OD 테스트 또는 참조 생성물 - OD 콜라게나제/히알루로니다제 단독)/OD 콜라게나제/히알루로니다제 단독].
결과가 음수인 경우, 백분율은 효소 억제로 표시되며; 결과가 양수인 경우, 백분율은 효소 활성으로 표시된다. 메탈로프로테아제 억제 결과는 하기와 같다.
결론: 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 메탈로프로테아제(콜라게나아제/히알루로니다아제)의 강력한 억제를 나타낸다. 이는 0.5% 이상의 농도에서 이러한 메탈로프로테아제를 완전히 억제할 수 있으며, 피부의 세포외 기질을 매우 효과적으로 보호할 수 있는 우수한 잠재력을 가지며 이러한 억제를 통해 항노화 효과를 나타낸다.
Pierre Fabre 특허 FR 2 946 879에 따라 얻은 추출물에 대한 비교 테스트가 아래에 보고되어 있으며, 단순 콜라게나아제와 관련된 동일한 테스트에 따른 결과는 하기와 같다.
결론: Pierre Fabre 특허에 따른 추출물은 콜라게나제 활성에 대한 약간의 역-용량-의존적(inverse-dose-dependent) 억제 작용을 나타냈으며, 최대 억제율은 42%였고, 모든 농도를 합한 경우에도 본 발명에 따른 펩티드 가수분해물의 100% 최대 억제와는 대조된다.
이 파라미터에 대한 항노화 활성은 Pierre Fabre 특허에 따른 추출물에서 관찰된 효과와 비교하여 상이하고 신규한 것으로 보인다.
실시예 4: 히스톤 데아세틸라제(histone deacetylase, HDAC) 및 시르투인 I 효소 억제에 대한 본 발명에 따른
페레그리나
펩티드 가수분해물의 효과
이 연구의 목적은 효소 HDAC 및 시르투인 I에 대한 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물의 억제 활성을 입증하는 것이다. HDAC 및 시르투인 I의 완충 용액은 37℃에서 20분 동안 기질과 반응하여 이를 화합물로 변형시키며, 이는 현색제(developer)의 존재 하 37℃에서 10분 동안 인큐베이션한 뒤 염색된다. 따라서 시르투인의 최대 탈아세틸화 활성은 405 nm에서 흡광도를 측정하여 평가할 수 있다. 본 발명에 따른 페레그리나 추출물 또는 참조 생성물 "트리코스타틴 A(trichostatin A (STA)) 억제제 1μM"을 효소 기질과 함께 시르투인 용액에 37℃에서 20분간 접촉시킨 후, 효소에 의해 변환된 기질에 현색제를 부가하여 염색시켰다. 활성제의 존재 하에 HDAC 및 시르투인 I의 탈아세틸화 활성은 405 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 평가된다. 이 활성의 조절은 활성제의 부재 하에, 즉 HDAC 및 시르투인 I 효소에 대한 기질만 있는 경우에 HDAC 및 시르투인 I의 최대 활성의 억제 또는 활성화의 백분율로 표현된다.
프로토콜: 시르투인 효소 용액을 참조 생성물의 부재(대조군) 또는 존재 또는 시험 제품의 농도를 증가시키면서 기질에서 20분 동안 인큐베이션한다. 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 하기 농도에서 테스트된다: 2%; 1%; 0.1%(V/V). 인큐베이션 기간 마지막에, 테스트 또는 참조 생성물의 존재 또는 부재 하 시르투인 효소의 활성이 현색제 용액을 사용한 염색(37℃에서 10분)으로 밝혀졌고 405nm에서 반응 배지의 흡광도를 측정하여 평가되었다. 테스트된 각 농도에 대해, 테스트 생성물을 통한 히스톤 데아세틸라제 및 시르투인 I 효소의 탈아세틸화 활성의 조절은 하기 공식에 따라 계산된다.
[수학 공식. 3] 시르투인 효소 활성 조절 백분율 = 100 x [(OD405 테스트 또는 참조 생성물) - (OD405 HDAC 및 시르투인 I 단독)]/OD405 시르투인 단독.
결과가 음수인 경우, 백분율은 효소적 반응의 억제로 표시되며; 결과가 양수인 경우, 백분율은 효소적 반응의 활성화로 표시된다. 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 효소의 억제에 대한 결과는 하기와 같다.
결론: 2%에서, 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 상당한 HDAC 억제를 나타내며; 이러한 억제는 특히 노화 과정과 관련된 유전적 부동(genetic drift)으로부터 피부 세포의 자가-보호를 촉진하는 능력을 반영한다. 따라서 추출물은 피부 표면에서 가장 흔한 유전적 부동 중 하나인 섬유증에 대해 유용한 것으로 나타나며, 이는 "쥐젖(skin tag)" (섬유성 돌기, fibrotic protuberance)의 출현으로 나타난다. 상기 추출물은 유리하게는 피부 표면의 섬유화를 방해하여 피부 노화를 예방할 수 있다.
실시예 5: 본 발명에 따른
페레그리나
펩티드 가수분해물의 텐서 효과(tensor effect)
이 연구의 목적은 동결건조된 콜라겐 디스크의 인 비트로 무세포 모델에서 활성 페레그리나 펩티드 가수분해물의 텐서 효과를 평가하는 것이다. 직경 8mm의 동결건조된 콜라겐 디스크를 사용하였다. 다양한 치료에 대한 이러한 디스크의 수축은 이미지 분석에 의해 측정되었다. 콜라겐 디스크의 표면적이 감소할수록 활성제의 텐서 효과가 크다. 이 연구에 사용된 참조 제품은 100mg/ml의 소 혈청 알부민이다.
프로토콜: 직경 8mm의 콜라겐 디스크를 40㎕의 초순수(대조군), 참조 제품, 또는 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물의 증가하는 농도: 0.05; 0.1 및 0.5%(v/v)에 담갔다. 페레그리나 펩티드 가수분해물을 초순수에 직접 용해시켰다. 각 디스크의 디지털 이미지는 담그기 전과 담그기 30분 후에 스캐너로 촬영하였다. 콜라겐 디스크의 표면적은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 상에서 측정하였다. 텐서 효과에 대한 결과는 하기와 같다.
결론: 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 저농도(1% 미만)에서 매우 현저한 텐서 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 "리프팅" 효과 및 결과적으로 단기적인 항노화 효과를 입증한다.
실시예 2 내지 5는 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물이 단기간 또는 장기간에 걸쳐 우수한 항노화 활성제의 프로파일을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 6: 본 발명에 따른
페레그리나
펩티드 가수분해물의 엔도텔린-1(endothelin-1) 작용 억제 효과
엔도텔린은 세포내 신호 전달 시스템을 통해 세포 성장을 촉진하기 위해 표피 멜라닌 세포(melanocyte) (멜라닌 세포, melanin cells)에서 세포내 칼슘 농도의 증가를 촉진하는 것으로 최근에 보고되었다. 이 작용은 멜라닌 합성에 있어서 속도-결정 효소인 티로시나제의 활성을 향상시킨다(Kadono, S. et al., 2001, The Role of the Epidermal Endothelin Cascade in the Hyperpigmentation Mechanism of Lentigo Senilis, Journal of Investigative Dermatology, 116(4): 571-577). 엔도텔린은 표피 각질형성세포에 의해 생성되는 멜라닌 세포 활성화 요소이며(Kawahara N. et al., 2005, About the Component of Snow Tea, Collection of Pharmaceutical, Society of Japan annual convention Subject matter, abstract 30-0823, page 159), 또한 자외선 광-유도 색소침착 또는 노인 기미에 중요한 요소라는 것이 보고되었다 (Pang, Y., Geng, J., Qin, Y. et al. Endothelin-1 increases melanin synthesis in an established sheep skin melanocyte culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 52, 749-756 (2016) or Hachiya, Akira et al. Biochemical Characterization of Endothelin-converting Enzyme-1α in Cultured Skin-derived Cells and Its Postulated Role in the Stimulation of Melanogenesis in Human Epidermis. Journal of Biological Chemistry, volume 277, issue 7, 5395-540). 엔도텔린의 이러한 생물학적 작용은 엔도텔린의 작용을 억제할 수 있는 활성제가 멜라닌 생성 또는 색소 침착을 감소 또는 예방하는데 유용할 수 있음을 시사한다.
엔도텔린은 인체에 알려진 가장 강력한 혈관수축제이다. 또한, 엔도텔린 고갈은 혈관 확장 효과를 생성하는 것으로 알려져 있다(Hirata, Y. et al., 1988, Cellular mechanism of action by a novel vasoconstrictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 154(3): 868-875; Shalinkumar P. et al., 2008, H2S Mediates the Vasodilator Effect of Endothelin-1 in the Cerebral Circulation. American Journal of Physiology. Heart Circulatory Physiology, 315, pages 1759-1764).
목적은 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물에 24시간 동안 노출시킨 후 인간 미세혈관 내피 세포 내 1형 엔도텔린을 분석하는 것이다.
프로토콜: 인간 미세혈관 내피 세포는 PELOBiotech 회사에 의해 공급되었고 공급자의 생산 방법에 따라 96-웰 플레이트에서 배양되었다. 추출물은 내피세포에 대해 24시간 동안 80%의 컨플루언스(confluence)로 다양한 농도로 작용하도록 두고, 세포 상청액의 엔도텔린-1은 PicoKine ELISA kit(EDN1)를 사용하여 정량화한다. 생존률 테스트를 엔도텔린-1 분석에 사용할 무독성 용량을 정의하기 위해 사전에 수행한다. 음성 대조군은 처리하지 않은 배양 배지의 세포를 사용하여 수행한다. 생존률 테스트에서 양성 대조군은 0.5% SDS이다. 모든 조건은 배양 배지에서 준비되었고, 이후 세포를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
a) 내피 세포에 대한 테스트 용액의 적용:
테스트 생성물을 96웰 플레이트 내 서브컨플루언스의 내피 세포와 접촉하도록 둔다. 각 농도에 대해 3개의 웰에서 테스트를 수행한다. 플레이트를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 ± 1시간 동안 인큐베이션한다.
b) 생존율 테스트:
세포 생존율은 세포 상에서 생성물과 함께 인큐베이션 후 MTT 방법으로 평가한다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 상층액을 회수하고 분석을 위해 -20℃에서 보관한다. 이후 웰을 200 μL의 PBS로 1회 헹군다. 50 μL의 0.5 mg/ml MTT 용액을 각 웰에 첨가한다: 36.5℃/5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 100 μL의 이소프로판올을 각 웰에 첨가한다. 균질화 후, 550 nm에서 흡광도 판독값을 취한다. 각 조건에 대해, 음성 대조군의 평균 흡광도(optical density value)에 대한 세포의 평균 흡광도의 비율은 생존율을 결정한다.
c) 엔도텔린-1 분석:
분석은 ELISA 키트를 사용하여 수행한다. 엔도텔린 작용의 억제 결과는 하기와 같다.
결론: 처리 마지막에 수행된 생존률 테스트는 테스트된 농도에 대한 독성 효과를 나타내지 않았다.
엔도텔린-1 분석은 무독성 농도의 세포 상청액에서 수행된다. 각 조건에 대한 엔도텔린-1의 양은 ELISA 키트를 사용하여 분석된다.
음성 대조군 세포의 경우, 값은 134.94pg/ml 정도이다. 다양한 농도의 추출물로 처리한 세포에서, 값은 87.85 pg/ml (2% 의 본 발명에 따른 추출물 사용)에서 118.15 pg/ml(0.1%의 본 발명에 따른 추출물 사용)이며, 이는 본 발명에 따른 추출물의 0.1% 이상에서는 약 12.44%의 1형 엔토텔린 생성 억제 및 본 발명에 따른 추출물의 2%에서는 최대 34.90% 억제를 갖는 현저한 억제를 나타낸다.
엔도텔린 및 이의 특정 용량-의존적 억제에 대한 결과는 본 발명에 따른 펩티드 가수분해물이 강력한 피부-미백제임을 입증한다.
실시예 7: 유리 지방산 방출에 대한 본 발명에 따른
페레그리나
펩티드 가수분해물의 효과
지방 세포의 지방 분해 또는 트리아실글리세롤(TAG)을 가수분해하여 다른 기관에서 사용하기 위해 지방산과 글리세롤을 방출하는 것은 백색 지방 조직의 고유의 기능이다. 지방 세포의 지방 분해는 시토졸 지질 방울(lipid droplet)의 표면에서 발생하며, 이는 최근 지질 대사의 필수적인 부분인 동적 소기관으로 많은 관심을 받고 있다. 주요 지방질의 포스포리파제 A(2)로서 AdPLA의 최근 식별은 PGE(2)에 의한 지방분해의 지배적인 자가분비/주변분비 조절의 발견을 유도했다. 상기 메커니즘은 지방 분해 및 조절의 핵심 요소이다. 최근 발견은 지방분해를 유전적 손상 또는 돌연변이와 연결시키고 가능성 있는 치료 표적으로서 지방세포에서의 지방분해의 활성화를 예측한다 (Ahmadjan M. et al., 2010, Lipolysis in Adipocytes, International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 42(5): 555-559).
본 연구의 목적은 인간 세포 배양(지방세포)에서 글리세롤 방출을 증가시키는 본 발명에 따른 펩티드 가수분해물의 능력을 평가하는 것이다. 글리세롤 함량은 지방분해와 관련이 있다. 글리세롤 함량의 증가는 지방분해 효과를 의미한다. 미용적 슬리밍 효과는 지방 분해 효과와 관련이 있다.
프로토콜: 인간 지방세포는 인-하우스 절차에 따라 24- 및 12-웰 플레이트에서 배양한다. 이를 위해 샘플은 24시간 동안 포화된(confluent) 지방세포에서 정의된 농도로 작용하도록 둔다. 24시간 후 MTT을 사용한 예비 생존률 테스트는 세포 독성을 평가하고 "지방분해 효과" 테스트를 위한 농도를 선택할 수 있도록 한다. 이 "지방분해 효과"는 샘플에 24시간 노출된 후 상등액의 글리세롤을 분석하여 평가한다.
음성 대조군은 처리하지 않은 배양 배지의 세포를 사용하여 수행한다. 생존률 테스트을 위한 양성 대조군은 0.5% SDS이다. "지방분해 효과" 테스트을 위한 양성 대조군은 0.05% 카페인이다. 모든 조건은 배양 배지에서 준비되었고, 이후 세포를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 ± 1 시간 동안 인큐베이션한다.
● 지방세포에 대한 테스트 용액의 적용:
- 테스트 제품은 24-웰 플레이트(세포독성 테스트) 및 12-웰 플레이트("지방분해 효과" 테스트)에서 포화된 지방세포와 접촉하도록 둔다.
- 각 농도에 대해 3개의 웰에서 테스트를 수행한다.
- 플레이트를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 ± 1시간 동안 인큐베이션한다.
● 생존율 테스트:
- 세포 생존율은 세포 상에서 생성물과 함께 인큐베이션 후 MTT 방법으로 평가한다.
- 24시간 동안 인큐베이션한 후, 목적하는 웰을 200 μL의 PBS로 한 번 헹군다.
- 300 μl의 0.5 mg/ml MTT 용액을 각 웰에 첨가한다: 36.5℃/5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
- 800 μl의 이소프로판올을 각 웰에 첨가한다.
- 균질화 후, 550 nm에서 흡광도 판독값을 취한다.
- 각 조건에 대해, 음성 대조군의 평균 흡광도(optical density value)에 대한 세포의 평균 흡광도의 비율은 생존율을 결정한다.
- 음성 대조군 값에 비해 70%의 생존율 컷오프 값은 시험 물질을 세포독성 또는 비세포독성으로 분류하는 데 사용된다.
● " 지방분해 효과" 테스트:
- 지방분해 효과는 제품과 인큐베이션 24시간 ± 1시간 후 배양 배지의 글리세롤을 분석하여 평가한다.
- 배양 배지는 공급자의 프로토콜에 따라 "유리 글리세롤 시약"과 혼합시킨다.
- 글리세롤 용액을 0 내지 6250 μM 농도의 표준 범위를 만드는 데 사용한다.
- OD 판독값은 550nm에서 취한다. 유리 지방산 방출에 대한 결과는 하기와 같다.
결론: 본 발명에 따른 펩티드 가수분해물은 인간 지방세포로부터 글리세롤의 방출을 촉진하여 슬리밍 효과를 유도함을 나타냈다.
실시예 8: 단백질 ZAG 자극에 대한 본 발명에 따른
페레그리나
추출물의 효과
징크 α-2-당단백질(Zinc α-2-glycoprotein, ZAG)은 이의 전기영동 이동성 및 이의 Zn 염으로 침전되는 능력에서 이름을 따온 혈장 당단백질이다. ZAG는 면역글로불린 유전자의 슈퍼패밀리의 멤버이며 MHC 분자 클래스 I 및 II와 매우 상동성인 3차원 구조를 갖는다. ZAG는 유방, 전립선 및 간의 정상 분비 상피 세포 내에서, 침샘, 기관지샘, 위장샘 및 땀샘 내에서, 및 표피를 포함한 정상 중층 상피 내에서 면역조직화학적으로 검출되었다. ZAG mRNA는 다양한 세포 유형에 균일하게 분포되어 있다[Za7]. ZAG는 분비 상피에서 생성되기 때문에 대부분의 신체 분비물에 존재하며 각각 타액 단백질의 2.5%, 정액 단백질의 30%를 구성한다.
ZAG의 표준 기능은 불분명하다. 그러나 ZAG는 카켁시아(cachexia)를 겪는 인간 암 환자의 소변에서 분리되었으며 지질-동원 인자로 작용할 수 있다. 인간 또는 쥐의 혈청에서 추출하거나 인간 암 환자의 소변에서 추출한 정제된 ZAG는 지방분해를 유도하여 글리세롤의 방출을 유발한다. 이는 또한 인간 및 쥐의 지방세포에서 지질의 사용을 증가시킨다 (Hirai K. et al., 1998, Biological Evaluation of a Lipid-Mobilizing Factor Isolated from the Urine of Cancer Patients, Cancer Research, 58(11): 2359-2365). ZAG는 지방세포막에서 구아노신 삼인산(GTP)-의존성 아데닐레이트 시클라제 활성을 활성화시키면서 고리형 아데노신 일인산(cAMP)의 세포 수준을 증가시킨다. 이것은 잠재적으로 여러 세포 경로의 활성화를 유발할 수 있다.
ZAG의 생물학적 특성에 대한 지식을 향상시키기 위해, B16F10 쥐 흑색종 세포주에서 안정한 재조합 인간(recombinant human, rh) ZAG 형질감염체를 생성했다. 멜라닌 생성에 대한 ZAG 형질감염의 효과를 인 비트로 및 인 비보에서 결정하였다. 마지막으로, 티로시나제 발현 및 활성에 대한 ZAG의 효과를 결정하였다. 전체적으로, 이러한 연구는 ZAG가 정상 및 악성 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 억제한다는 것을 나타낸다. 상기 메커니즘은 추가 간접 효과의 가능성과 함께 티로시나제 단백질에 대한 전사-후 효과를 포함한다. 이러한 연구는 지금까지 알려지지 않은 ZAG의 생물학적 기능의 식별을 가능하게 하였고 멜라닌 생성을 조절하는 방법을 가능하게 하였으며, 이는 따라서 멜라닌 생성 증가로 인한 피부 및 모발 색소 침착을 예방 및/또는 감소시킨다 (Hale L., Method of Modulating Melanin Production, United States Patent No. US7,803,750 B2, 2010) and (Ghada F.M. et al., 2015, Highlights in Pathogenesis of Vitiligo, World Journal of Clinical Cases 3(3): 221-230).
본 연구의 목적은 인간 세포 배양 (각질세포)에서 ZAG의 방출을 증가시키기 위한 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물의 능력을 평가하는 것이다. ZAG 함량은 미백 효과, 슬리밍 효과, 항섬유화 효과 및 진정 효과와 상관관계가 있다.
프로토콜: 정상 인간 각질형성세포를 포피(foreskin)에서 분리하고 인-하우스 절차에 따라 24- 및 96-웰 플레이트에서 배양한다.
샘플은 출물은 각질형성세포에 대해 48시간 동안 80%의 컨플루언스(confluence)로 정의된 농도로 작용하도록 두고, 세포 상청액의 ZAG은 ELISA kit를 사용하여 정량화한다.
생존률 테스트를 ZAG 분석에 사용할 무독성 용량을 정의하기 위해 사전에 수행한다.
음성 대조군은 처리하지 않은 배양 배지의 세포를 사용하여 수행한다.
생존률 테스트을 위한 양성 대조군은 0.5% SDS이다.
모든 조건은 배양 배지에서 준비되었고, 이후 세포를 36.5℃/5% CO2에서 생존율 테스트의 경우 24시간 동안 및 ZAG 분석의 경우 48시간 동안 인큐베이션한다.
● 각질형성세포에 대한 테스트 용액의 적용:
- 테스트 생성물을 24- 및 96-웰 플레이트 내 서브컨플루언스의 각질형성세포와 접촉하도록 둔다.
- 각 농도에 대해 3개의 웰에서 테스트를 수행한다.
- 플레이트를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 및 48시간 동안 인큐베이션한다.
● 생존율 테스트:
- 세포 생존율은 세포 상에서 생성물과 함께 인큐베이션 후 MTT 방법으로 평가한다.
- 24 및 48시간 동안 인큐베이션한 후, 목적하는 웰을 200 μL의 PBS로 한 번 헹군다.
- 50 μl의 0.5 mg/ml MTT 용액을 각 웰에 첨가한다: 36.5℃/5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
- 100 μl의 이소프로판올을 각 웰에 첨가한다.
- 균질화 후, 550 nm에서 흡광도 판독값을 취한다.
- 각 조건에 대해, 음성 대조군의 평균 흡광도(optical density value)에 대한 세포의 평균 흡광도의 비율은 생존율을 결정한다.
● ZAG 단백질 분석:
- 48시간 동안 인큐베이션한 후, 모든 상층액을 회수하고 분석을 위해 -20℃ 에서 보관한다.
- 분석은 ELISA 키트를 사용하여 수행한다. ZAG 분석에 대한 결과는 하기와 같다.
결론: 페레그리나 펩티드 가수분해물은 인간 세포에 대한 우수한 용량 의존성 및 낮은 독성과 함께 ZAG 생성을 유의하게 증가시킬 수 있다. 이와 같이 이는 ZAG를 현저히 증가시키는 능력에 기초하여 미백효과, 슬리밍효과, 항섬유화효과, 및 진정효과가 있다.
실시예 9: 본 발명에 따른
페레그리나
펩티드 가수분해물의 멜라닌 생성 억제 효과
피부 색소 침착은 표피 및 모낭 모두에 대해, 멜라닌 세포 내부의 멜라노솜에서 멜라닌 합성으로 시작하여 주변 각질 세포로 멜라노솜이 전달되고, 이후 색소를 전달하고 선택적으로 이를 분해하는 복합적인 과정이다. 인간에서 전체 멜라닌 세포 집단은 모낭 및 표피의 기저층에 위치한다. 피부에서의 위치에 관계없이, 멜라닌 세포는 공통되는 발생학적(embryological) 기원, 즉 멜라닌 아세포(melanoblast) (착색되지 않은 세포)의 형태에서 유래하는 신경능(neural crest)을 갖는다. 표피 세포에는 두 가지 유형이 존재한다: 갈색-검정색 색소인 유멜라닌(eumelanin) 및 황-적색 색소인 페오멜라닌(pheomelanin). 유멜라노솜 및 페오멜라노솜은 멜라닌 세포에 공존한다. 티로시나제는 페오멜라닌 및 유멜라닌 합성의 첫 번째 단계: L-티로신의 L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-DOPA)으로의 전환 및 상기 화합물의 도파퀴논으로의 산화를 조절하는 핵심 효소이다. 도파퀴논에서 합성 경로로 유멜라닌 및 페오멜라닌으로 나뉜다. 멜라닌의 주요 역할은 UV 방사선의 유해한 영향으로부터 피부를 보호하여 피부암의 발병을 예방하는 것이다 (Brenner M. et al., 2008, The protective role of melanin against UV damage in human skin, Photochemistry and Photobiology 84(3): 539-549).
목적은 본 발명에 따른 페레그리나 추출물에 5일 동안 노출된 후 인간 멜라닌 세포에 대한 멜라닌 조절 테스트를 수행하기 위해 사용된 모든 데이터와 얻은 결과를 대조(collate)하는 것이다.
프로토콜: 인간 멜라닌 세포를 96- 및 24-웰 플레이트에서 배양한다.
본 발명에 따른 페레그리나 추출물은 5일 동안 5%, 2%, 1% 및 0.1%의 농도로 포화된(confluent) 멜라닌 세포에 작용하도록 한다. 24시간 후 MTT을 사용한 생존률의 사전 테스트는 세포 독성을 평가하고 멜라닌 조절 테스트를 위한 농도를 선택할 수 있도록 한다. 이 조절은 추출물 노출 5일 후에 세포 용해물(lyzate)의 멜라닌을 분석하여 평가된다. 음성 대조군은 처리하지 않은 배양 배지의 세포를 사용하여 수행한다. 생존률 테스트을 위한 양성 대조군은 0.5% SDS이다. 멜라닌 조절 테스트의 경우, α-MSH 존재 또는 부재 배지를 음성 대조군으로 사용한다.
모든 조건은 배양 배지에서 준비되었고, 이후 세포를 36.5℃/5% CO2에서 세포독성 테스트의 경우 24시간 동안 및 멜라닌 분석의 경우 5일 동안 인큐베이션한다.
a) 멜라닌 세포에 대한 테스트 용액의 적용: 테스트 농도를 96-웰 플레이트(세포독성 시험) 및 24-웰 플레이트(멜라닌 분석) 내 포화된 멜라닌 세포와 접촉하도록 둔다. 각 농도에 대해 3개의 웰에서 테스트를 수행한다. 플레이트를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 ± 1시간 및 5일 동안 인큐베이션한다.
b) 생존율 테스트: 생성물과 24시간 인큐베이션 후 세포에 대해 MTT 방법으로 세포생존율을 평가한다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 목적하는 웰을 200 μL의 PBS로 한 번 헹군다. 50 μl의 0.5 mg/ml MTT 용액 각 웰에 첨가하고 36.5℃/5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션을 수행한다. 150 μL의 이소프로판올을 각 웰에 첨가한다. 균질화 후, 550 nm에서 흡광도 판독값을 취한다. 각 조건에 대해, 음성 대조군의 평균 흡광도(optical density value)에 대한 세포의 평균 흡광도의 비율은 생존율을 결정한다.
음성 대조군 값에 비해 70%의 생존율 컷오프 값은 시험 물질을 세포독성 또는 비세포독성으로 분류하는 데 사용된다. "비세포독성" 분류는 생존율>70%에 대한 인 비트로 결과에 주어지고, "세포독성" 분류는 생존율≤70%에 주어진다.
본 발명에 따른 추출물의 5% 농도는 시험 조건하에서 5%에서 세포독성인 것으로 입증되었다. 따라서 2%, 1% 및 0.1% 농도가 멜라닌 조절 테스트에 사용된다. 세포에 존재하는 멜라닌의 양을 세포 용해 후 분석한다. 멜라닌 생성 억제 결과는 하기와 같다.
결론: 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 in cellulo에서 멜라닌 생성을 억제하여 탈색소 효과 및 피부 미백 특성을 나타낸다.
실시예 10: DKK1 및 DKK3 조절에 대한 본 발명에 따른
페레그리나
펩티드 가수분해물의 효과 분석
멜라닌 생성 조절에서 멜라닌 세포 및 섬유아세포 간의 상호작용의 관련성은 잘 알려져 있으며 집중적으로 연구되어왔다. 이러한 상호작용은 아직 완전히 이해되지는 않았지만 손발바닥 부위의 "흼(whiteness)"의 원인이며 현재는 탈색 제품 개발을 위해 화장품에 사용된다. Yamaguchi et coll. (Yamaguchi Y. et al., 2004, Mesenchymal-Epithelial Interactions in the Skin: Increased Expression of Dickkopf by Palmoplantar Fibroblasts Inhibits Melanocyte Growth and Differentiation, Journal of Cell Biology 165(2): 275-285) 은 손발바닥 영역의 섬유아세포에 의해 생성된 가용성 메신저(soluble messenger)는 이러한 영역의 멜라닌 세포의 분화 프로그램을 수정하여, 멜라닌 생성의 감소를 유발할 수 있음을 입증했다. 이 메신저는 Dikkopf-1(DKK-1)이라는 단백질로 팀에 의해 확인되었다.
이러한 결과를 생성하기 위해 DKK-1이 사용하는 신호 전달 경로가 이제 명확하게 확인되었다. Wnt 수용체에 대한 길항 작용으로 인해, DKK-1은 실제로 멜라닌 생성에 관여하는 유전자의 조절을 일반적으로 담당하는 β-카테닌에 의해 활성화된 세포내 신호 전달 경로를 "전환(shunting)"할 수 있다. Yamaguchi et coll.은 또한 DKK-1과 유사한 분자인 DKK-3이 Wnt 수용체에 영향을 미치지 않고 DKK-1의 효과에 대한 조절 역할을 할 수 있음을 입증했다. 실제로, 이 Wnt 수용체 근처에 DKK-3의 양이 많을수록 DKK-1 및 이 수용체 사이의 상호작용이 약해진다. DKK3의 증가는 멜라닌 생성에 대한 DKK-1의 억제 효과를 감소시킨다. Yamaguchi et coll. 에 의한 연구(상기 참조)는 비-손발바닥 기원의 정상 인간 진피 섬유아세포 배양에서 DKK1/DKK3 비율에 영향을 미치는 물질(agent)의 식별이 정상 인간 비-손발바닥 멜라닌 세포를 사용하여 멜라닌 생성을 제어하는 것을 가능하게 할 것임을 시사한다.
이 연구의 목적은 단일층 배양 내 정상 인간 섬유아세포로 구성된 모델에서 "페레그리나 펩티드 가수분해물"로 알려진 화합물의 DKK-1 합성 및 방출에 미치는 효과를 평가하는 것이다.
프로토콜: 인간 섬유아세포는 인간 68세 기증자로부터 얻었다. 실험을 수행하기 위해 섬유아세포를 포화(confluence)에 도달할 때까지 단층 배양으로 성장시켰다. 100nM 덱사메타손은 DKK-1 합성 및 방출의 참조 유도제로 사용하였다.
피부 디스크를 참조 생성물 또는 테스트 생성물의 부재(대조군) 또는 존재 하에 48시간 동안 인큐베이션하였다: 페레그리나 펩티드 가수분해물: 0.01%; 0.1% 및 0.5%(v/v).
인큐베이션이 마지막에, 인큐베이션 배지를 제거하여 DKK-1 방출 측정을 수행했다.
본 발명에 따른 "페레그리나 펩티드 가수분해물"을 상기 기재된 다양한 농도에 도달시키기 위해 인큐베이션 배지에서 직접 희석시켰다.
48-시간 인큐베이션 기간 마지막에, 인큐베이션 배지로 방출된 DKK-1을 특이적인 민감한 ELISA 키트를 사용하여 정량하였다.
인큐베이션 기간 마지막에, 세포 용해물에 함유된 단백질을 분광 비색법 (spectrocolorimetric method, Bradford method)을 사용하여 정량하였다.
결과는 단백질 mg당 ng DKK-1로 표시한다(평균 ± S.D.).
"대조군" 및 "참조 생성물" 간의 유의 수준(significance level)은 스튜던트 테스트를 통해 평가하였다(*: p<0.05).
"대조군" 및 "테스트 생성물" 간의 유의 수준을 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 Holm-Sidak 테스트(*: p<0.05)를 통해 평가하였다.
우리의 실험 조건에서 100nm에서 테스트한 "덱사메타손"으로 알려진 참조 제품은 방출된 DKK-1을 "대조군"에 비해 181.8%(p<0.01)로 현저히 증가시켰다. DKK1 조절 분석에 관한 결과는 하기와 같다.
DKK3에 대한 연구
이 연구의 목적은 단일층 배양 내 정상 인간 섬유아세포로 구성된 모델에서 "페레그리나 펩티드 가수분해물"로 알려진 화합물의 DKK-3의 합성 및 방출에 미치는 효과를 평가하는 것이다.
인간 섬유아세포는 인간 68세 기증자로부터 얻었다.
실험을 수행하기 위해 섬유아세포를 포화(confluence)에 도달할 때까지 단층으로 성장시켰다.
인간 섬유아세포는 인간 68세 기증자로부터 얻었다.
실험을 수행하기 위해 섬유아세포를 포화(confluence)에 도달할 때까지 단층으로 성장시켰다.
48-시간 인큐베이션 기간 마지막에, 인큐베이션 배지로 방출된 DKK-3을 특이적인 민감한 ELISA 키트를 사용하여 정량하였다.
인큐베이션 기간 마지막에, 세포 용해물에 함유된 단백질을 분광 비색법 (spectrocolorimetric method, Bradford method)을 사용하여 정량하였다.
결과는 단백질 mg당 ng DKK-3으로 표시한다(평균 ± S.D.).
"대조군" 및 "참조 생성물" 간의 유의 수준(significance level)은 스튜던트 테스트를 통해 평가하였다(*: p<0.05).
"대조군" 및 "테스트 생성물" 간의 유의 수준을 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 Holm-Sidak 테스트(*: p<0.05)를 통해 평가하였다. DKK3 조절 분석에 관한 결과는 하기와 같다.
결론: 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 인간 세포에서 DKK1의 생성을 상당히 증가시킬 수 있으며, DKK3의 생성을 감소시키는 경향이 있다. 이는 DKK1을 상당히 증가시키고 DKK3을 현저히 감소시켜 DKK1/DKK3 비율을 증가시키는 능력을 통해 손발바닥 억제 원리를 통해 피부 색소 침착을 감소시키는 우수한 능력을 갖는다. 이 비율의 증가는 전-멜라닌 세포/멜라닌 세포 분화 경로를 제한하는 효과가 있으며; 따라서 작동하는 멜라닌 세포의 수는 시간이 지남에 따라 감소하여 피부의 착색 능력을 감소시킨다.
실시예 11: 본 발명에 따른
페레그리나
펩티드 가수분해물의 DNA 보존 효과
텔로미어 길이의 역학은 세포의 복제 수명을 조절하는데, 특히 다시 오래 사는(re long-lived) 종의 경우에 매우 중요하다. 텔로미어 단축 및 텔로머라제 활성은 노화 및 종양 형성의 중요한 요인이다(Shay, J.W., 2005, Senescence and Immortalization: Role of Telomeres and Telomerase, Carcinogenesis 26(5): 867-874). 텔로미어는 분해, 바람직하지 않은 융합-재조합 및 DNA 손상 반응의 부적절한 활성화로부터 염색체 말단을 캡핑(cap)하는 복잡한 뉴클레오티드 서열이다. 그들은 또한 세포 분열 및 염색체 안정성에 필수적인 역할을 한다. 텔로미어의 안정성이 직업적(occupational) 및 환경적 노출에 의해 영향을 받을 수 있다는 증거가 계속 증가하고 있으며, 이러한 요인 중 일부는 염증, 산화 스트레스, DNA 손상, 염색체 이상 및 후성 유전적(epigenetic) 변화의 증가와 관련되어 있기 때문이다. 매우 짧고 긴 텔로미어는 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환(CVD) 및 암 위험과 관련이 있다.
텔로머라제는 텔로미어의 말단에 텔로머 반복(telomeric repeat)의 추가를 촉매하는 리보핵단백질이다. 텔로미어는 염색체의 끝을 캡핑하고 염색체를 안정화시키는 역할을 하는 반복 서열의 긴 부분이다. 인간에서, 텔로미어는 일반적으로 7 내지 10kb 길이이며 -TTAGGG- 서열의 여러 반복으로 구성된다.
텔로머라제는 대부분의 성체 세포에서 발현되지 않으며 텔로미어의 길이는 연속적인 복제 주기와 함께 감소한다. 일정한 수의 복제 주기 후에, 텔로미어의 점진적인 단축은 세포가 텔로미어 위기 단계에 들어가도록 하며, 이는 이후 세포 노화를 유발한다. 특정 질병은 빠른 텔로미어 손실과 관련되어 있으며, 조기 세포 노화를 초래한다. 인간 세포에서 인간 텔로머라제 단백질을 코딩하는 유전자의 발현(Blasco M., 2007, Telomere Length, Stem Cells and Aging, Nature Chemical Biology 3, pages 640-649)은 아마도 세포의 자연 노화 경로를 우회함으로써 불멸의 표현형을 부여하는 것으로 입증되었다. 또한, 텔로미어가 짧은 노화 세포에서 텔로머라제 유전자의 발현은 텔로미어 길이를 증가시키고 일반적으로 젊은 세포와 관련된 표현형을 회복시키는 것으로 입증되었다.
이 연구의 목적은 단일층 배양 내 정상 인간 섬유아세포로 구성된 모델에서 "페레그리나 펩티드 가수분해물"로 알려진 화합물의 텔로미어 단축에 미치는 효과를 평가하는 것이다. 텔로미어가 생물학적 시계에 해당한다는 것은 잘 알려져 있다. 텔로미어의 길이는 세포 분열과 함께 점차 감소하여 궁극적으로 세포가 복제를 못하게 한다. 텔로미어 길이의 측정은 정량적 PCR 및 계대 2 및 5의 세포 간의 텔로미어 길이 비교를 통해 수행되었다.
프로토콜: 인간 섬유아세포는 인간 44세 기증자로부터 얻었다. 실험을 수행하기 위해 세포는 계대 2 및 5에서 사용되었다. 섬유아세포는 페레그리나 펩티드 가수분해물의 부재(대조군) 또는 증가하는 테스트 농도: 0.01%; 0.1% 및 0.5%(v/v)의 존재 하에 3회 연속 계대 배양되었다.
테스트 화합물의 제조: 테스트 화합물 "페레그리나 펩티드 가수분해물"을 상기 기재된 다양한 농도에 도달하도록 인큐베이션 배지에서 직접 희석하였다.
인큐베이션 끝에, 세포를 트립신 처리하였다. 전용(dedicated) DNA 추출 키트를 사용하여 세포에서 DNA를 추출하였다. DNA를 NanoDrop으로 정량화하였다.
텔로미어 길이는 정량적 PCR(q-PCR)로 측정했다. 각 샘플에 대해 텔로미어 길이의 변화는 SCR(single copy reference) 유전자를 참조 유전자로 사용하여 상대적 정량화에 의해 측정하였다. 각 샘플에 대해 텔로미어 서열을 인식하고 증폭하는 텔로미어 프라이머 세트를 사용하여 q-PCR을 수행하고, 인간 염색체 17의 100bp 영역을 인식하고 증폭하는 SCR 프라이머 세트를 사용하여 두 번째 q-PCR을 수행하였으며 데이터 정규화를 위한 참조로서 역할한다.
결과는 계대 2의 세포에 대한 텔로미어 길이에 상응하는 상대 단위로 표시한다 (평균 ± S.D.). 계대 2의 "대조군" 및 꼐대 5 간의 유의 수준은 스튜던트 t 테스트를 통해 평가하였다(*: p < 0.05). "대조군" 및 "테스트 화합물" 간의 유의 수준을 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 Holm-Sidak 테스트(*: p < 0.05)를 통해 각 제품에 대해 독립적으로 평가하였다.
결과: 우리의 실험 조건에서 0.05%, 0.1% 및 0.5%(v/v)에서 테스트한 페레그리나 펩티드 가수분해물은 정상 인간 섬유아세포에서 텔로미어 단축을 현저히 감소시켰다.
텔로미어 단축: 0.05%(v/v) + 8.9%(p<0.05) 및 0.1%(v/v) + 15.1%(p<0.01) 및 0.5%(v/v) + 16.6%(p<0.01)에서 억제(대조군과 비교).
결론: 인간 세포의 정상적인 증식 또는 분열의 맥락에서, 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 텔로미어 길이를 현저히 증가시키는 능력을 입증한다. 텔로미어는 DNA 물질의 보호와 관련된 캡이며; 시간이 지남에 따라 텔로미어의 사이즈의 증가는 DNA 물질의 완전성을 보존시킨다. 텔로미어 길이를 증가시키는 것은 DNA 물질을 보존하는 능력과 관련이 있다. 페레그리나 펩티드 가수분해물은 이 길이를 증가시킬 수 있기 때문에 인간 유전 물질(DNA)의 보존에 관여한다.
실시예 12: 다양한 제품의 피부 표면 보습 비교 시험
Corneometry 연구는 피부 표면에 대한 제품의 보습 효과의 측정을 가능하게 한다. 사용된 기계는 특히 임피던스 측정법(impedancemetry)으로 피부의 수분을 측정하는 프로브가 장착된 corneometer이다. 6명(남성 2명, 여성 4명)으로 구성된 패널이 유사한 유속측정(hydrometry) 및 온도 조건 하에서 팔뚝 안쪽 면에 대해 테스트되었다. 왼쪽 팔뚝의 안쪽 면에는 영역 1 및 2가 있고, 오른쪽 팔뚝의 안쪽 면에는 영역 3 및 4가 있다.
영역 1은 참조 보습 겔의 적용 영역에 해당하며; 영역 2는 참조 겔 + 2%의 본 발명에 따른 펩티드 가수분해물의 적용 구역에 해당하며; 영역 3은 참조 겔 + 2%의 모링가 올레이페라의 펩티드 가수분해물의 적용 영역에 해당하며; 영역 4는 참조 겔 + 2%의 BASF Beauty Care Solutions의 특허 FR 3 076 460에 따른 Purisoft®의 적용 영역에 해당한다.
각 영역에 적용한 제품의 양은 동일하며, 측정 시간은 각 영역마다 동일하다. 피부의 수분 제로 상태를 결정하기 위해 각 영역에 제품을 적용하기 전에 첫 번째 값을 취한다. 다음으로, 각 영역 및 각 제품에 대해 항상 동일한 오퍼레이터(operator)에 의해, 영역에 제품 적용 5분 후에 1차 측정을 수행한다. 마지막으로, 상기 두 번째 측정 30분 후에, 다시 동일한 오퍼레이터에 의해 최종 측정을 수행한다.
적용 전후에 관찰된 차이의 조합은 ANOVA(분산 분석)에서 연구된 일반적인 법칙을 따르지 않는다. 따라서 측정 전과 후의 차이로 얻은 값이 연구된 매개변수이다. 얻은 결과는 얻은 값의 양적 경향이 아니라 질적 경향을 구성한다.
결론: 영역 2는 본 발명에 따른 추출물을 함유한 제품의 적용 전후 사이에 양수의 피부 보습 값을 나타내는 반면, 2가지 추출 모드에 따른 모링가 올레이페라 추출물을 함유하는 영역 3 및 4는 음수의 값을 나타낸다, 즉, 피부가 제품을 바른 후에는 전보다 수분감이 덜하다. 본 발명에 따른 펩티드 가수분해물은 국소 적용 제품에서 보습의 이점을 유지하는 것을 가능하며, 이는 본 발명에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물을 테스트된 다른 추출물과 구별시킨다. 도 1은 얻은 결과를 나타낸다.
실시예 13: 메이크업 제품 제형
실시예 14: 세척 제품 제형
실시예 15: 케어 제품 제형
실시예 16: 이완 또는 슬리밍 정제 1g: 본 발명에 따른 건조 추출물 2% (이눌린 지지체 상에 펩티드 가수분해물 60% 함유) + 200IU 비타민 D를 함유하는 탄산칼슘 47% + 글루콘산마그네슘 25% + 이눌린 23% + 3% 마그네슘 스테아레이트).
실시예 17: 750mg 겔 캡슐 내 슬리밍 분말 200mg의 카페인, 200mg의 본 발명에 따른 건조 추출물(이눌린 지지체 상의 펩티드 가수분해물 60% 함유), 200mg의 키토산 및 150mg의 탄산칼슘을 함유.
실시예 18: 750mg 겔 캡슐 내 식욕 억제제 & 슬리밍 분말 200mg의 카페인, 200mg의 본 발명에 따른 건조 추출물(이눌린 지지체 상에 펩티드 가수분해물 60% 함유), 200mg의 키토산 및 150mg의 곤약(konjac) (글루코만난, glucomannan)을 함유.
실시예 19: 실시예 1에 따른 추출물 2%를 함유하는 설하 이완제 스프레이.
1% 로디올라 마더 팅크(Rhodiola mother tincture), 1% 레몬 밤 마더 팅크, 1% 발레리안(valerian) 마더 팅크, 1% 산사나무속(hawthorn) 마더 팅크, 2% 속새속(horsetail) 추출물, 0.15% 살리실산, 7% 소르비톨, 및 qs 물.
실시예 20: 실시예 1에 따른 가수분해된 추출물 2%를 함유하는 항주름 크림
실시예 21: 본 발명에 따른 가수분해물의 독성(toxicological) 테스트
실시예 1에 따른 펩티드 가수분해물의 제조: 열매가 익었을 때 수확한 모링가 페레그리나(Forssk.) 피오리의 껍질을 벗기지 않은 종자를 내부 수분 함량이 8% 미만, 바람직하게는 약 6%가 되도록 건조시킨 후, 이후 기계식 엔드리스 스크류 프레스(endless screw press)로 압착시켜 한편으로는 버진 오일(virgin oil)을 얻고, 다른 한편으로는 케이크를 얻기 위해 종자의 나머지에서 오일을 분리시킨다. 그런 다음 케이크는 1 내지 2cm 조각으로 미리 절단된 롤 형태로 분리된다. 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 액체 추출물이 얻어지며, 이는 하기 테스트에서 순수한 형태로 사용된다.
1. 박테리아 균주 Salmonella typhimurium(TA 100)에 대한 돌연변이성 활성(mutagenic activity) 결정 - 박테리아 복귀돌연변이(reverse mutation) 테스트
테스트는 세 가지 주요 단계로 수행되었다:
- 테스트할 요소의 세포독성을 평가하고 후속 실험을 위한 용량 범위를 선택하기 위해 예비 실험을 수행하고,
- 대사 활성화 존재 및 부재 하, 예비 연구에서 정의한 용량 범위 상 최소 아가에 대한 테스트 시스템 및 테스트의(또는 대조군의) 직접 통합(direct incorporation)을 포함하는 제1 유전독성 실험(테스트 1).
- 대사 활성화 존재 및 부재 하, 제1 실험 결과 분석 후 연구 책임자가 정의한 용량 수준으로, 테스트 시스템 및 테스트 요소(또는 대조군)의 사전 배양을 포함하는 제2 실험(테스트 2).
이 제2 실험은 특히 제1 실험에서 애매하거나 부정적인 결과가 얻어졌을 때 제1 실험의 결과를 확인하거나 완료하기 위해 수행되었다.
실시예 1에 따른 추출물의 희석액을 물에서 제조하여 세포독성 테스트를 수행하였다.
상기 테스트는 S9-Mix 유무에 관계없이 5000, 1600, 500, 160 및 50㎍/플레이트 농도에서 Salmonella typhimurium TA100 균주에 대해 수행되었다.
S9-Mix 제조에 사용된 시약은 하기 지침에 따라 제조되었다.
박테리아를 대사 활성화 시스템 존재 및 부재 하에 테스트 추출물에 노출시켰다. 사용된 대사 시스템은 보조인자-보충된(cofactor-supplemented) 후-미토콘드리아 분획(post-mitochondrial fraction)(S9)이다. 효소 유도제로 처리된 Sprague-Dawley 래트 간 균질물의 마이크로솜 분획인 이 S9 분획은 Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983)에 따라 제조되었으며 Moltox TM에 의해 공급되었다. 이를 -70℃ 이하의 온도에서 보관한다. S9 마이크로솜 분획은 S9-Mix 내에서 10% 농도로 사용되었다. 적용된 프로토콜은 다음과 같다:
- 하기를 3개의 용혈 튜브에 넣었다:
- 대사 활성화 부재 하 분석:
·다양한 농도의 테스트 요소 0.1 ml.
·0.5 ml의 멸균 0.2 M, pH 7.4 인산염 완충액,
·S. typhimurium용 탑 아가(top agar) 2ml,
·0.1 ml의 박테리아 접종원(bacterial inoculum) (TA100).
- 대사 활성화 존재 하 분석:
·다양한 농도의 테스트 요소 0.1 ml,
·S. typhimurium용 탑 아가(top agar) 2ml,
·박테리아 접종원 (TA100) 0.1 ml,
·S9-Mix 0.5ml.
- 페트리 접시에 미리 깔아둔 바닥 아가의 표면 상에 섞어 붓는다.
- 37℃ ± 2℃에서 48 내지 72시간 동안 인큐베이션한다.
이러한 분석은 예비 세포독성 테스트, 테스트 1 및 테스트 2의 각 테스트에 대해 수행되었다. 미처리 대조군, 음성 대조군 및 사전배양 방법 동안 생성된 양성 대조군을 탑 아가를 붓기 전에 37℃ ± 2℃에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션하였다.
적용된 프로토콜은 다음과 같다:
- S. typhimurium용 상부 아가의 2ml 분획 4개에 하기를 넣는다:
o 0.2M, pH 7.4 인산염 완충액 0.1ml,
o 용매 0.1 ml,
o S9-Mix 0.1ml,
o 최고 농도의 테스트 요소의 제제 0.1ml,
- 무균성을 체크하기 위해 S. typhimurium용 상부 아가 2ml 분획을 사용한다.
- 페트리 접시에 미리 깔아둔 바닥 아가의 표면 상에 섞어 붓는다.
- 37℃ ± 2℃에서 48 내지 72시간 동안 인큐베이션한다.
- 테스트는 세 차례 수행한다.
- 박테리아 증식이 관찰되지 않아야 한다.
최소 5가지 농도의 시험 추출물에 대해, 대사 활성화 부재 하 테스트 및 대사 활성화 존재 하 테스트를 수행하였다.
결과 표현 및 해석
많은 기준을 통해, 대사 활성화 존재 또는 부재 하에서 결과가 양성인지, 특히 테스트 항목의 용량과 상관관계가 있는 복귀돌연변이체(revertant) 수의 증가, 또는 하나 이상의 농도에서 복귀돌연변이체 수의 재현 가능한 증가(reproducible increase) 여부를 결정할 수 있다.
- 검증 단계의 결론에서 대사 활성화의 존재 및/또는 부존재 하에 5개 균주 중 하나 이상에서 용량-효과 관계가 재현 가능하게 얻어지는 경우, 테스트 요소는 돌연변이성(mutagenic)으로 여겨진다. 주어진 농도에서 복귀돌연변이체의 수가 TA98, TA100 및 TA102 균주의 경우 자발적 복귀율의 최소 2배(R ≥ 2) 및 TA1535 및 TA1537 균주의 경우 자발적 복귀율의 3배(R ≥ 3)인 경우에만 돌연변이성(mutagenicity)으로 여겨진다.
- 테스트 1 및 테스트 2의 결론에서, 돌연변이성 효과의 부재가 테스트된 농도의 독성과 관련이 없다는 것이 확인되었다는 전제 하에, 대사 활성화 존재 및 부재 하에, 복귀돌연변이체의 빈도가 테스트 요소의 모든 농도에서 TA98, TA100 및 TA102 균주의 경우 자발적 복귀율의 2배 미만(R < 2) 및 TA1535 및 TA1537 균주의 경우 자발적 복귀율의 3배 미만(R < 3)으로 항상 유지되는 경우 테스트 요소는 비-돌연변이성으로 여겨진다.
예비 연구에서는 테스트 요소의 세포 독성이 나타나지 않았으며; 그 결과, 이 농도 범위를 유전독성 테스트 1에 사용하였다.
테스트 1에서 얻은 결과에 기초하여 테스트 2에서 동일한 희석 범위를 사용하기로 결정하였다. 복귀돌연변이체에 대한 분석은 하기를 나타낸다:
- 세포독성 효과가 관찰되지 않았고,
- 대사 활성화 존재 및 부재 하에, TA98, TA100 및 TA102의 경우 자발적 복귀율의 2배 이상 또는 TA1535 및 TA1537의 경우 자발적 복귀율의 3배 이상의 비율 R을 나타낸 테스트 추출물의 농도가 없었고,
- 테스트 시스템 또는 테스트 조건에 관계없이 용량 반응이 관찰되지 않았다.
본 연구에서 얻은 결과에 비추어 볼 때, 실시예 1에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물은 돌연변이성 또는 돌연변이유발성(promutagenic) 활성이 없는 것으로 여겨질 수 있다.
2.
인비트로 광독성 테스트 3T3 NRU
테스트의 원리는 배양된 세포 상 UVA의 비-세포독성 용량의 존재 및 부재 하에 실시예 1에 따른 페레그리나 펩티드 가수분해물의 세포독성의 비교를 기반으로 한다. 세포 독성은 UVA 조사 존재 및 부재 하 참조 요소 및 본 발명에 따른 M. 페레그리나 추출물로 처리한 지 24시간 후, 생체 염색(vital stain): 뉴트럴 레드(neutral red)를 사용하여 세포 생존률을 결정함으로써 평가된다. 사용된 세포는 Balb/c 3T3 클론 31 라인(ATCC - CCL163)의 마우스 배아 섬유아세포이다. 양성 대조군은 클로르프로마진 용액(CAS No.: 69-09-0)이다. 음성 대조군은 테스트 추출물용 및 참조용 희석제(완충 식염수 용액 ± 1% 용매)이다. 페레그리나 펩티드 가수분해물은 UVA의 존재 및 부재 하에, 8가지 농도로, 연구된 농도당 최소 4개의 배양 웰에서 테스트되었다. 섬유아세포를 트립신 처리하고, 2개의 96-웰 배양 플레이트에 완전 배양 배지 내 2×105 개 세포/ml 를 함유하는 세포 현탁액 100㎕(즉, 웰당 2×106 개 세포)를 시딩하였다.
시딩된 플레이트는 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 마지막에, 세포 잔디(cell lawn)의 반-컨플루언스(semi-confluence)를 확인하였다. 희석액은 세포 상에 놓기 직전에 제작하였다. 가장 높은 농도의 pH가 측정되었으며; 6.5 내지 7.8 이었다. 배양 배지를 제거하고, 실온에서 유지된 PBS 150㎕로 각 웰을 조심스럽게 미리 헹군 후, 각 추출물 또는 참조 희석액 100㎕로 처리하였다. 배양 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 ± 5분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. Bio Sun 태양광 조사기(Vilber Lourmat RMX3W)를 사용하여 조사를 수행하였다. Bio Sun 기계는 프로그래밍 가능한 마이크로프로세서를 통해 UV 조사를 제어하는 시스템이다. 시스템은 지속적으로 UV 광 방출을 따라간다. 전달된 에너지가 프로그래밍된 에너지와 동일하면 조사가 자동으로 멈춘다. 테스트 장치의 분광 복사 조도(spectral irradiance)는 보정된 분광복사계(spectroradiometer)를 사용하여 250 내지 700 나노미터의 파장 범위에서 측정되었다.
두개의 플레이트 중 하나는 상온에서 덮개를 씌운 채로 조사되었고, 다른 플레이트는 UVA로부터 보호되었고 조사 동안 상온에서 유지되었다. 조사 후, 처리 배지를 흡인하고 세포를 헹구었다. 100㎕의 완전 배양 배지를 조심스럽게 첨가하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 18 내지 22시간 동안 인큐베이션하였다. 다음날, 위상차 현미경을 사용한 관찰에 의해 세포 생존율(성장, 형태, 단층 완전성)을 평가하였다. 100㎕의 염색 용액으로 처리하기 전에, 배양 배지를 제거하고 각 웰을 미리 헹구어 상온에서 유지시켰다. 동일한 조건 하 플레이트를 3시간 동안 인큐베이터로 되돌렸다. 염색 용액을 제거하고 세포를 헹군 다음, 헹굼 용액을 제거하고 150 μl의 탈착 용액을 각 웰에 첨가하였다. 결정이 완전히 용해될 때까지 플레이트를 흔들었다. 흡광도 값은 450 nm에서 측정되었다.
테스트 검증:
세포의 UVA 민감도는 대략 10회 계대마다 증가된 조사량에 노출시킨 후 그들의 생존율을 평가함으로써 확인한다. 세포는 테스트에 사용된 밀도로 배양하였다. 그들은 다음날 2.5 및 9 J/cm2의 양으로 조사되고 세포 생존력은 NRU 테스트를 통해 하루 후에 결정된다. 5 J/cm2의 UVA 조사 후 세포의 생존율이 암실에 보관된 대조군의 생존율의 80% 이상인 경우 세포가 품질 기준을 충족하며; UVA의 9 J/cm2의 가장 높은 양에서 생존율은 암실에 보관된 대조군의 생존율의 적어도 50%와 같아야 한다.
결과:
음성 대조군은 0.4 이상의 흡광도를 갖는다. 양성 대조군인 클로르프로마진의 IC50값은 UVA가 존재 하 0.1 내지 2㎍/ml 및 UVA가 부재 하 7 내지 90㎍/ml이다. 이러한 결과를 통해 테스트를 검증할 수 있다. UVA의 존재 및 부재 하 50% 세포 사멸을 일으키는 페레그리나 케이크 추출물의 펩티드 가수분해물의 농도는 추정할 수 없다. 사멸율(mortality)이 50%에 도달한 적이 없다. UVA의 존재 및 부재 하 50% 세포 생존율을 나타내는 페레그리나 케이크 추출물의 펩티드 가수분해물의 농도는 추정할 수 없다. 생존율은 항상 50% 이상이다.
결론: 채택된 실험 조건에서 페레그리나 케이크의 펩티드 가수분해물은 광독성이 없는 것으로 여겨질 수 있다.
3. SIRC 세포주에 대한 뉴트럴 레드 방출법을 사용한 인 비트로 세포독성 연구에 의한 안구 자극 가능성 평가
이 인 비트로 연구는 뉴트럴 레드 방출 기술을 통해 세포 단층에서 50% 세포 사멸을 초래하는 농도(IC50)를 결정하여 페레그리나 케이크의 펩티드 가수분해물의 세포 독성을 평가하는 것을 기반으로 한다. 사용된 세포는 미코플라스마가 없는 SIRC 토끼 각막 섬유아세포(ATCC - CCL60)이다.
상기 펩티드 가수분해물을 생리식염수에 25% 및 50%로 희석하였다. 섬유아세포를 트립신 처리하고, 2개의 24-웰 배양 플레이트에 완전 배양 배지 내 2×105 개 세포/ml를 함유하는 세포 현탁액 1ml의 비율로 시딩하였다. 시딩된 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 마지막에, 세포 잔디의 컨플루언스를 확인하였다. 염색 용액은 완전 배양 배지에서 0.5 mg/ml로 제조하였다. 배양 배지를 제거하였고; 각 웰에 1ml의 염색 용액을 넣었다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 3시간 ± 15분 동안 인큐베이터로 되돌렸다. 이 접촉 시간 후, 염색 용액을 제거하고 웰당 1ml의 완전 배양 배지로 교체했다. 추출물 또는 참조와 접촉하기 전에 시스템을 안정화시키기 위해 플레이트를 실온에서 적어도 30분 동안 유지시켰다. 각 웰을 2 ml의 PBS로 헹구고 실온에서 유지시킨 다음, 페레그리나 펩티드 가수분해물 또는 참조의 각 희석액 500 μl를 세포 잔디와 접촉시켰다. 접촉 시간은 60초(양성 대조군의 경우 30초)였다. 웰마다 처리를 수행하였으며 펩티드 가수분해물 또는 참조를 넣는 순간에 스톱워치를 시작하였다. 플레이트를 처리 내내 수동으로 흔들었다. 55초 후(또는 양성 대조군의 경우 25초), 희석액을 흡인하였다. 정확히 60초 또는 30초에 5회의 연속적인 헹굼을 수행하였다(5 x 2 ml PBS는 실온에서 유지시킴). 각 헹굼 후 상청액을 흡인하고 최종 헹굼 후 노출(revelation) 단계를 기다리는 동안 웰은 배지가 없는 상태로 유지시켰다. 배양 플레이트의 처리 완료 후, 1 ml의 탈착 용액을 각 웰에 넣었다. 균일한 염색이 얻어질 때까지 플레이트를 약 15분 동안 흔들었다. 각 배양 웰에 대해 얻은 용액을 취하여 96-웰 플레이트의 2개의 웰에, 즉 150 ㎕/웰로 나누었다.
결과:
50% 세포 사멸을 일으키는 펩티드 가수분해물의 농도는 > 50%로 평가되었다. 50%의 펩티드 가수분해물에서 세포 사멸 비율은 17%로 평가되었다.
결론: 채택된 실험 조건에서 페레그리나 케이크의 펩티드 가수분해물의 세포 독성은 무시할 수 있는 세포 독성으로 여겨질 수 있다.
4. 피부과학적 제어 하 48시간 동안 밀봉드레싱 하 펩티드 가수분해물의 1회 적용 후 피부 적합성 평가
이 연구의 목적은 48시간 동안 팔의 앞-외면(antero-external face)에 대해 수행된 피부표피(epicutaneous) 테스트에 의해 펩티드 가수분해물의 피부 적합성 정도를 평가하는 것이며; 일반적으로 피부를 좋은 상태로 유지하기 위한 펩티드 가수분해물의 능력을 평가하는 것이다. 피부가 건조하지도 않고 민감하지도 않고 치료 부위에 피부과적 병변이 없는 18세에서 65세 사이의 건강한 여성 또는 남성 지원자 10명이 연구에 포함되었다. 실시예 1에 따른 페레그리나 추출물 5% 및 프로판디올/소르비톨 혼합물 95%를 함유하는 로션 형태로 제조된 펩티드 가수분해물의 피부 적합성은 최초 적용 48시간 후에 드레싱 제거 30 내지 40분 사이에 평가하였다. 피부 반응(홍반 및 부종)은 하기 척도에 따라 0 내지 3까지 점수를 매겼다:
기타 임의의 피부 반응(물집(bulla), 구진, 수포, 건조, 표피탈락(desquamation), 거?, 비누 효과(soap effect) 등)을 하기 척도에 따라 평가하고 기술적으로 보고하였다:
- 0: 반응 없음
- 0.5: 매우 약함
- 1: 약함
- 2: 중간 정도
- 3: 확연함
연구 마지막에, 하기 공식에 따라 평균 자극 점수(mean irritation score, M.I.S.)를 계산했다.
[수학 공식. 4]
M.I.S. = 피부 반응의 합(Er + Oe + 물집 + 구진 + 수포)/분석된 지원자 수
얻어진 M.I.S.를 통해 하기 표에 제시된 척도에 따라 시험 추출물을 분류 가능하였다:
M.I.S. 0.20 비-자극성
0.20 < M.I.S. 0.50 약간 자극성
0.50 < M.I.S. 2 중간정도의 자극성
2 < M.I.S. 3 매우 자극성
결과: 페레그리나 케이크의 펩티드 가수분해물의 평균 자극 점수(M.I.S.)는 0과 동일하다.
결론: 페레그리나 케이크의 펩티드 가수분해물은 12명의 지원자에게 연속 48시간 동안 적용한 후 비-자극성인 것으로 여겨질 수 있다.
테스트의 일반적인 결론:
상기 수행된 테스트의 결과는 결정적이며 실시예 1에 따른 펩티드 가수분해물에 대해 하기를 입증한다:
1) 눈 및 피부 자극 테스트에서 음성이다.
2) 광독성 시험에서 음성이다.
3) 돌연변이성 시험에서 음성이다.
본 발명에 따른 펩티드 가수분해물의 안전성은 입증되었으며 표적 집단과 관련하여 제한 없이 대규모 국소용 화장용 용도에 이상적이다.
실시예 22: 가수분해된 케이크 추출물의 피부-탈색 활성
테스트의 목적은 적용 28일 후 본 발명에 따른 화장용 제품의 탈색 가능성 및 기호도(acceptability)를 평가하는 것이다. 테스트 제품은 실시예 20에 기재된 항주름(antiwrinkle) 크림이다.
분석된 집단:
포함 및 분석된 지원자 수: 23명의 평균 연령이 64세인 44세에서 70세 사이의 여성으로 얼굴, 목, 목선 및/또는 손에 흑색점(lentigo)이 있다.
연구에 채택된 절차: 하루에 두 번, 28일 동안 얼굴, 목, 목선 및 손의 깨끗한 피부에 완두콩-크기의 제품을 바르고 제품이 완전히 침투할 때까지 마사지하며; 눈과의 접촉을 피하고; 햇빛에 노출되기 전에 제공된 자외선 차단 제품을 바른다.
평가 기준:
- 탈색 가능성 평가: D1 및 D28의 3개 부위(처리된 색소침착된 영역, 처리된 색소침착되지 않은 영역, 처리되지 않은 색소침착되지 않은 대조군 영역)에서 mexametric 측정.
- 불편한 감각에에 대한 지원자들의 피드백.
- D1 및 D28에 C-Cube videodermoscope(Pixience SAS, Toulouse, France)를 사용한 흑색점의 설명을 위한 사진(최종 보고서가 제공되었을 때 WeTransfer에서 컨택트 시트 형태로 전송).
- 화장품 기호도: D21에 지원자가 작성한 설문지.
연구 결과:
Mexametric 측정의 분석은 D1에 비해 D28에 두 개의 처리된 영역(색소침착된 및 색소침착되지 않은 부위)에서 멜라닌 지수의 통계적으로 유의한 감소를 보여주었다. 처리되지 않은 영역에서 D28과 D1 사이에 기록된 변화는 통계적으로 유의하지 않은 것으로 밝혀졌다.
결론: 연구 조건 하에서, 테스트 제품은 28일 사용 후 유의한 탈색 효능을 나타냈다.
Claims (14)
- 분자량이 100 Da 내지 6000 Da인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드 및 글리코펩티드를 포함하는 펩티드 가수분해물을 포함하고, 모링가 페레그리나의 열매가 익었을 때, 껍질을 벗기지 않은 종자로부터 16 내지 25℃의 온도에서 2 ± 10% 내지 20% 시간 동안 pH 13 초과에서 화학적 단백질 분해에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드 및 글리코펩티드는 1500 Da 내지 5000 Da 의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물.
- 제2항에 있어서, 상기 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드 및 글리코펩티드는 3000 Da 내지 4500 Da 의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물.
- 제1항에 있어서, 펩티드, 올리고펩티드, 글리코펩티드, 및 아미노산의 건조 물질을 10 중량% 초과의 양으로 갖는 상기 펩티드 가수분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물을 얻는 방법으로서,
a) 모링가 페레그리나의 열매가 익었을 때 수확한 껍질을 벗기지 않은 종자를 수집하고 건조시켜 내부 수분 함량이 8% 미만이 되도록 하는 단계,
b) 상기 건조된 껍질을 벗기지 않은 종자를 압착하여 상기 건조된 껍질을 벗기지 않은 종자로부터 오일을 분리하여 잔류 오일을 6중량% 미만으로 포함하는 종자 케이크를 얻는 단계,
c) 상기 b)단계에서 얻은 종자 케이크를 밀링(mill)하는 단계,
d) 상기 c)단계에서 얻은 밀링된 종자 케이크를 수성 상에 분산시키는 단계,
e) 상기 d)단계에서 얻은 수성 분산액의 화학적 단백질분해를 13 초과의 pH 및 16 내지 25℃의 온도에서 2 ± 10% 내지 20% 시간 동안 수행하는 단계,
f) 단백질 분해를 중화시켜, 얻어진 펩티드 가수분해물을 안정화시키는 단계;
g) 상기 펩티드 가수분해물을 고체/액체 분리에 의해 회수하는 단계,
h) 상기 펩티드 가수분해물을 한외여과에 의해 정제하는 단계, 및 선택적으로,
i) 상기 h)단계에서 얻은 펩티드 가수분해물의 동결건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 g) 단계의 고체/액체 분리가 원심분리, 탈수, 또는 여과 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 h) 단계의 한외여과는 100 Da 내지 6000 Da의 컷오프 역치(threshold)로 수행되는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 컷오프 역치는 1500 Da 내지 5000 Da인 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 컷오프 역치는 3000 Da 내지 4500 Da인 것인 방법.
- 활성제로서 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 모링가 페레그리나 종자 케이크 추출물, 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물은 상기 조성물 내 조성물의 총 중량에 대해 0.002 중량% 내지 20 중량%의 농도로 상기 조성물에 존재하며 피부 국소 적용을 위해 제형화된 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 조성물 내 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물의 농도는 상기 조성물의 총 중량에 대해 0.01 중량% 내지 10 중량%의 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 활성제로서 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 모링가 페레그리나 종자 케이크 추출물, 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭취(ingestion)를 위해 제형화된 뉴트리코스메틱 조성물로서,
상기 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물은 상기 조성물의 총 중량에 대해 0.01중량% 내지 100중량%의 농도로 상기 조성물에 존재하는 것을 특징으로 하는 뉴트리코스메틱 조성물.
- 제10항에 있어서, 피부, 점막 또는 외피의 외양의 개선, 피부 또는 점막의 건조 예방 또는 퇴치, 피부의 노화 또는 광노화의 신호 예방 또는 퇴치, 피부 미백 촉진, 또는 슬리밍 촉진을 위한 것인 화장료 조성물.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| KR102304419B1 (ko) | 2021-05-12 | 2021-09-24 | 주식회사 시돌스코리아 | 모링가 종자 유래 아미노산 및 펩타이드를 함유하여 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 유지 및 향상, 피부 주름 방지에 유효한 다 기능성 화장품 조성물 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102304419B1 (ko) | 2021-05-12 | 2021-09-24 | 주식회사 시돌스코리아 | 모링가 종자 유래 아미노산 및 펩타이드를 함유하여 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 유지 및 향상, 피부 주름 방지에 유효한 다 기능성 화장품 조성물 |
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