JP7357983B2 - モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物、それを得るための方法、及び美容用品組成物若しくはニュートリコスメティクス組成物におけるその使用 - Google Patents
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Description
a)モリンガ・ペレグリナの果実が熟したときに採取された殻付き種子を収集し、乾燥させて、内部水分含量を8%未満とする工程と、
b)乾燥させた種子をプレスして、油を種子の残りの部分から分離させて、6重量%未満の残油を含む固形物を得る工程と、
c)工程b)で得られた固形物を粉砕する工程と、
d)工程c)で得られた粉砕された前記固形物を、水相中に分散させる工程と、
e)工程d)で得られた水分散液の化学タンパク質分解を、13より高いpHで、16℃から25℃の温度で約2時間行う工程と、
f)得られたペプチド加水分解物を安定させるために、前記化学タンパク質分解を中和させる工程と、
g)ペプチド加水分解物を固液分離によって回収する工程と、
h)ペプチド加水分解物を限外ろ過によって精製する工程と、その後、オプションで、
i)工程h)で得られたペプチド加水分解物を凍結乾燥させる工程と、を含む。
・MTT:3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT試験は生細胞をカウントするための迅速な方法である)
・SDS:ドデシル硫酸ナトリウム
・PBS:リン酸緩衝生理食塩水
・ELISA:酵素免疫測定法
・PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
・ANOVA:分散分析
・MSH:メラノサイト刺激ホルモン
・「主にペプチド加水分解物」:乾燥物の重量に対し、ペプチド、オリゴペプチド、グリコペプチド及びアミノ酸又はそれらの揮発性ニトリル誘導体の乾燥物の量が10%超え、優先的には20%超え、より優先的には30%超え、さらに最大約40%(質量/質量)、より優先的には50%である。
・「有効量」:所望の結果を得るため、すなわち、特に皮膚の外観を改善するために必要な活性分子の量。
・「タンパク質分解」:化学的又は酵素的加水分解による、タンパク質のペプチド、オリゴペプチド及びその塩基性フラグメント(アミノ酸)への分解。
・「局所適用」:本発明による活性成分又はこれを含有する組成物を、皮膚、粘膜又は外皮の表面上に適用する又は広げること。
・「生理学的に許容される」:毒性、不適合性、不安定性又はアレルギー反応のリスクなしに、ヒトの皮膚と接触させる局所的使用、又は他の投与経路を介する使用、例えば経口又は皮膚への注入に適している。
・「固形物(tourteau)」:プレス後の種子の脱油部分。これは、種子から油を抽出した際の固体残留物である。これは、油を生産する工程である粉砕作業の副産物である。これは通常は種子の質量の50%から75%である。
・「殻付き種子」:採取した種子の殻(果皮)及び上皮が実の周囲に維持されていることを意味する。
・「果実が熟したとき」:果実が熟していることを意味し、優先的には、鞘が裂開の開始時にあって暗いベージュ色から茶色に変わり、鞘の下側4分の1が180°ねじれることで弁が開こうとするときを意味する。
・「約」:所与の情報に対するプラス又はマイナス10%から20%のマージン。
・「活性分子のプール」、また、「活性成分」:モリンガ・ペレグリナ種子固形物から本発明の方法にしたがって抽出されたペプチド加水分解物。この加水分解物は、本発明に記載の生理活性の原因となる。
・「活性剤」:記載される生理活性を得るのに十分な量の本発明による抽出物。抽出物が液体であるか又は乾燥されたものであるか、濃縮されたものであるか又はその他であるかに応じて、活性剤の量は、組成物の総重量に対して0.002重量%から40重量%の割合で変わり得る。
・「皮膚の老化のサイン」:老化による皮膚及び外皮の外観のあらゆる変化、例えば、しわや細かい線、しなびた皮膚、たるんだ皮膚、薄くなった皮膚、皮膚の弾力性及び/若しくはトーンの欠如、鈍くつやのない皮膚、皮膚の色素沈着斑、毛髪の変色、又は爪のステイン、並びに変化した外観によって組織的に反映されない皮膚のあらゆる内部変化、例えば、紫外線(UV)照射への暴露後の皮膚のあらゆる内部劣化。
a)モリンガ・ペレグリナの果実が熟したときに採取された殻付き種子を収集し、乾燥させて、内部水分含量を8%未満とする工程と、
b)乾燥させた種子をプレスして、油を種子の残りの部分から分離させて、6重量%未満の残油を含む固形物を得る工程と、
c)工程b)で得られた固形物を粉砕する工程と、
d)工程c)で得られた粉砕された前記固形物を、水相中に分散させる工程と、
e)工程d)で得られた水分散液の化学タンパク質分解を、13より高いpHで、16℃から25℃の温度で約2時間行う工程と、
f)得られたペプチド加水分解物を安定させるために、前記化学タンパク質分解を中和させる工程と、
g)ペプチド加水分解物を固液分離によって回収する工程と、
h)ペプチド加水分解物を限外ろ過によって精製する工程と、その後、オプションで、
i)工程h)で得られたペプチド加水分解物を凍結乾燥させる工程と、を含む。
a)1モル濃度の強アルカリ剤、例えば、特に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム若しくは水酸化カルシウムなど、を含む溶液、又は1モル濃度の強アルカリ剤を含むが、優先的に水酸化ナトリウムを含む水性混合物を調製し(この強アルカリ溶液のpHは13よりも大きい)、
b)約1cmの断片に事前にカットされたペレグリナ固形物を、アルカリ溶液中において[1:10](質量/質量)の比率となるよう計量し、
c)工程b)で得られた固形物を粉砕し、
d)工程c)で得られた粉砕された固形物を水相中に分散させ、
e)工程d)で得られた水分散液の化学タンパク質分解を、温度20℃で約2時間行い、
f)得られたペプチド加水分解物を安定させるために、溶液を4.5から5.5のpH範囲に和らげるように弱酸を用いてタンパク質分解を中和させ、
g)ペプチド加水分解物を固液分離によって回収し、
h)ペプチド加水分解物を限外ろ過によって精製する。
DPPH溶液を、本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物(T+)の非存在下(対照)又は存在下で、そして試験サンプルの濃度を減少させて、40℃で30分間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりにおいて、参照製品の存在下と、ペレグリナ・ペプチド加水分解物の存在下若しくは非存在下とでの抗酸化活性が、40℃で30分後に染色することによって明らかにされた。したがってそれは、540nmでの反応媒体の吸光度を測定することによって評価された。試験された各濃度について、試験製品による抗酸化活性の調節が、以下の式にしたがって計算された。
抗酸化活性のパーセンテージ調節=100×[(OD540対照-OD540試験製品)/OD540参照製品]
本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物は、フリーラジカルからの保護が可能であり、1%以上の濃度で有意な抗酸化特性を有する。
試験される本発明によるペレグリナ抽出物の非存在下又は存在下で、I型コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素の溶液をその基質中で5分間インキュベートする。次いで、溶液を色原体ニンヒドリンと接触させ、続いて、80℃で15分間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりにおいて、試験又は参照製品を含む及び含まないコラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素の活性が、565nmでの反応媒体の吸光度を測定することによって評価された。試験された各濃度について、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素活性の試験製品による調節が、以下の式にしたがって計算された。
コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ酵素活性のパーセンテージ調節=100×[(OD試験又は参照製品-ODコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼのみ)/ODコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼのみ]
本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物はメタロプロテアーゼ(コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ)の強い阻害を引き起こす。これは、0.5%以上の濃度にてこれらのメタロプロテアーゼをすべて阻害することができ、皮膚の細胞外マトリックスを大効率で保護するための良好な潜在能力を有し、そして、この阻害を介してアンチエイジング効果を示す。
Pierre Fabre特許による抽出物は、コラゲナーゼ活性に対して42%のピーク阻害(全ての濃度を一緒にしたとき)という、僅かな、逆投与量依存阻害活性を示し、これは、本発明によるペプチド加水分解物についての100%のピーク阻害とは対照的である。
参照製品の非存在下(対照)若しくは存在下で、又は濃度を増加させた試験製品の非存在下若しくは存在下で、サーチュイン酵素の溶液をその基質中で20分間インキュベートする。本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物を、2%、1%、0.1%(V/V)の濃度で試験する。インキュベーション期間の終わりにおいて、試験又は参照製品を含む及び含まないサーチュイン酵素の活性が、現像剤溶液を用いて染色する(37℃で10分間)ことによって明らかにされ、405nmでの反応媒体の吸光度を測定することによって評価された。試験された各濃度について、ヒストン脱アセチル化酵素及びサーチュインI酵素の脱アセチル化活性の試験製品による調節が、以下の式にしたがって計算された。
サーチュイン酵素活性のパーセンテージ調節=100×[(OD405試験又は参照製品)-(OD405HDAC及びサーチュインIのみ)]/OD405サーチュインのみ
本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物は、2%において有意なHDAC阻害を示し、この阻害は、特に老化プロセスに関連する遺伝的浮動に対する皮膚細胞の自己保護を促進する能力を反映する。このように、抽出物は皮膚表面の共通遺伝的浮動の1つ、すなわち「スキンタッグ」(線維性突起)の出現によって現れる線維症に対して有用であるとみられる。抽出物は、有利には、皮膚表面上の線維症を防ぎ、したがって、皮膚老化を防止することができる。
直径8mmのコラーゲンディスクを、40μLの超純水(対照)、参照製品、又は、0.05%、0.1%及び0.5%(V/V)で濃度を増加させた本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物に浸した。ペレグリナ・ペプチド加水分解物を超純水に直接溶解した。各ディスクのデジタル画像を、浸す前及び浸した後30分経過後にスキャナで撮影した。画像について、コラーゲンディスクの表面積を画像分析ソフトウェアを用いて測定した。張筋効果の結果を以下に示す。
本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物は、低濃度(1%未満)で非常に顕著な張り効果を示す。これらの結果は、「リフティング」効果、ひいては短期的なアンチエイジング効果を示す。
ヒト微小血管内皮細胞はPELOBiotech社から提供され、サプライヤーの生成手順にしたがって96ウェルプレート中で培養される。抽出物は、80%コンフルエンス状態で24時間、種々の濃度で内皮細胞に作用させたままにし、次いで、細胞上清中のエンドセリン-1が、PicoKine ELISAキット(EDN1)を使用して定量化される。エンドセリン-1測定で使用する非毒性投与量を決めるために事前に生存率試験が行われる。陰性対照は培地中の細胞を処理せず用いて行われる。生存率試験における陽性対照は0.5%SDSである。全条件が培地中で準備され、続いて細胞が36.5℃、5%CO2で24時間インキュベートされる。
試験製品を、96ウェルプレート内でサブコンフルエント状態の内皮細胞に接触させる。各濃度について、試験は3つのウェルで行う。プレートを36.5℃、5%CO2で24時間±1時間インキュベートする。
b)生存率試験
細胞生存性を、製品とともにインキュベートさせた後の細胞についてMTT法を用いて評価する。24時間のインキュベーション後、上清を回収し、測定用に-20℃で保存する。次いで、ウェルを200μLのPBSで1回洗浄する。0.5mg/mLのMTT溶液を各50μLウェルに加え、36.5℃、5%CO2で3時間インキュベートする。100μLのイソプロパノールを各ウェルに加える。均等化後、550nmでの吸光度読み取り値を取得する。各条件について、陰性対照の平均光学濃度値に対する細胞の平均光学濃度値の比によって、生存率が決定される。
c)エンドセリン-1測定
測定は、ELISAキットを用いて行う。
エンドセリンの作用の阻害についての結果を以下に示す。
処理の終わりにおいて行われる生存率試験は、試験された濃度について、いかなる毒性効果も示さなかった。エンドセリン-1測定は細胞上清中において非毒性濃度で行う。各条件についてのエンドセリン-1の量はELISAキットを使用して測定される。陰性対照細胞については、値は134.94pg/mLのオーダーである。様々な濃度の抽出物で処理された細胞について、値は、87.85pg/mL(本発明による抽出物は2%)から118.15pg/mL(本発明による抽出物は0.1%)であり、これは、本発明による抽出物が0.1%以上のとき1型エンドセリン生成が約12.44%阻害されるという非常に有意な阻害を示し、本発明による抽出物が2%のときには最大34.90%阻害されることを示す。
エンドセリン及びその特異的用量依存的阻害に関する結果は、本発明によるペプチド加水分解物が強力な美白剤であることを実証する。
ヒト脂肪細胞は社内の手順にしたがって24ウェルプレート及び12ウェルプレートで培養される。このために、サンプルはコンフルエント状態の脂肪細胞上で所定の濃度で24時間作用するために放置される。24時間後のMTTによる予備生存率試験により、細胞毒性を評価し、「脂肪分解効果」試験の濃度を選択することができる。この「脂肪分解効果」は、サンプルへの曝露の24時間後の上清中のグリセロールを測定することによって評価される。
試験製品を、24ウェルプレート(細胞毒性試験)及び12ウェルプレート(試験「脂肪分解効果」)においてコンフルエント状態の脂肪細胞と接触させる。
各濃度について、試験は3つのウェルで行われる。
プレートを36.5℃、5%CO2で24時間±1時間インキュベートする。
- 生存率試験:
細胞生存性は、製品とともに24時間インキュベートした後の細胞に対してMTT法で評価される。
24時間インキュベートした後、目的のウェルを200μLのPBSで1回すすぐ。
300μLの0.5mg/mL MTT溶液を各ウェルに加え、36.5℃、5%CO2で3時間インキュベートする。
800μLのイソプロパノールを各ウェルに加える。
均等化後、550nmでの吸光度を読み取る。
各条件について、陰性対照の平均光学濃度値に対する細胞の平均光学濃度値の比により生存率が決定される。
陰性対照値に対して70%である生存率カットオフ値を使用して、試験物質を細胞毒性又は非細胞毒性として分類する。
- 「脂肪分解効果」試験:
脂肪分解効果は、製品とともに24時間±1時間インキュベーションした後の培地中のグリセロールを測定することによって評価される。
培地は、サプライヤーのプロトコルにしたがって「遊離グリセロール試薬」と混合される。
グリセロール溶液は、0μMから6250μMの濃度で標準範囲を作るために使用される。
OD(光学濃度)の読み取り値は550nmで取得される。遊離脂肪酸放出の結果を以下に示す。
本発明によるペプチド加水分解物は、ヒト脂肪細胞からのグリセロールの放出を促進し、それによって痩身効果を引き起こすことが実証された。
正常なヒトケラチノサイトを包皮から分離し、社内手順にしたがって24ウェルプレート及び96ウェルプレートで培養する。
試験製品は、24ウェルプレート及び96ウェルプレート中のサブコンフルエント状態のケラチノサイトと接触するように配置される。
各濃度について、試験は3つのウェルで行われる。
プレートを36.5℃、5%CO2で24時間及び48時間インキュベートする。
- 生存率試験:
細胞生存性は、製品とともにインキュベーションした後の細胞に対してMTT法で評価される。
24時間及び48時間インキュベートした後、目的のウェルを200μLのPBSで1回すすぐ。
50μLの0.5mg/mL MTT溶液を各ウェルに加え、36.5℃、5%CO2で3時間インキュベートする。
100μLのイソプロパノールを各ウェルに加える。
均等化後、550nmで吸光度を読み取る。
各条件について、陰性対照の平均光学濃度値に対する細胞の平均光学濃度値の比によって生存率が決定される。
- ZAGタンパク質測定:
48時間のインキュベーション後、すべての上清を回収し、測定のために-20℃で保存する。
測定はELISAキットを用いて行われる。ZAG測定の結果を以下に示す。
ペレグリナ・ペプチド加水分解物は、ZAG産生を大幅に増加させ、投与量依存性が良好で、ヒト細胞に対する毒性が低い場合がある。したがって、ペレグリナ・ペプチド加水分解物は、ZAGを大幅に増加させるその能力に基づいて、美白効果、痩身効果、抗線維化効果及び鎮静効果を有する。
ヒトメラニン細胞は、96ウェルプレート及び24ウェルプレートで培養される。
本発明によるペレグリナ抽出物を、5日間、2%、1%及び0.1%の濃度でコンフルエント状態のメラニン細胞に作用させる。24時間後のMTTによる生存率の事前試験により、細胞毒性を評価し、メラニン調節試験のための濃度を選択することができる。この調節は、抽出物への曝露の5日後の細胞溶解物中のメラニンを測定することによって評価される。陰性対照は、培地中の細胞を処理せず用いて行われる。生存率試験の陽性対照は0.5%SDSである。メラニン調節試験では、α-MSHの存在下及び非存在下の培地が陰性対照として使用される。
すべての条件を培地中で準備し、その後、36.5℃、5%CO2で、細胞毒性試験では24時間、メラニン測定では5日間、インキュベートする。
試験濃度は、96ウェルプレート(細胞毒性試験)及び24ウェルプレート(メラニン測定)内においてコンフルエント状態のメラニン細胞と接触させるように配置される。各濃度について、試験は3つのウェルで行われる。プレートを、36.5℃、5%CO2で24時間±1時間、及び5日間、インキュベートする。
b)生存率試験:
細胞生存性は、製品とともに24時間インキュベートした後の細胞に対してMTT法で評価される。24時間インキュベートした後、目的のウェルを200μLのPBSで1回すすぐ。50μLの0.5mg/mL MTT溶液を各ウェルに加え、36.5℃、5%CO2で3時間インキュベートする。150μLのイソプロパノールを各ウェルに加える。均等化後、550nmでの吸光度を読み取る。各条件について、陰性対照の平均光学濃度値に対する細胞の平均光学濃度値の比により、生存率が決定される。
陰性対照値に対して70%である生存率カットオフ値を使用して、試験物質を細胞毒性又は非細胞毒性として分類する。in vitro結果について、生存率が70%超えの結果は「非細胞毒性」と分類し、生存率が70%以下の結果は「細胞毒性」と分類する。
本発明による抽出物の5%濃度は、試験条件下で5%で細胞毒性であることが証明された。したがって、2%、1%及び0.1%の濃度がメラニン調節試験に使用される。細胞内に存在するメラニンの量は細胞溶解後に測定される。メラニン生成の抑制の結果を以下に示す。
本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物は、in celluloでメラニン生成を抑制し、色素除去効果及び皮膚美白特性を与える。
ヒト線維芽細胞は68歳のドナーから得られた。実験を行うために、線維芽細胞を、コンフルエンス状態に達するまで単層培養として増殖させた。100nMのデキサメタゾンをDKK-1合成及び放出の参照誘導物質として使用した。
本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物は、DKK1の産生を大幅に増加させることができ、かつヒト細胞におけるDKK3の産生を減少させる傾向がある。本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物は、DKK1を大幅に増加させかつDKK3を大幅に減少させ、したがってDKK1/DKK3比を増加させる能力により、掌蹠抑制の原理によって皮膚の色素沈着を減少させる高い能力を有する。この比率の増加は、前メラニン細胞/メラニン細胞分化経路を制限する効果があり、したがって、使用可能なメラニン細胞の数は時間とともに減少し、皮膚の着色能力を低下させる。
ヒト線維芽細胞は44歳のドナーから得られた。実験を行うために、2回継代及び5回継代の細胞を使用した。繊維芽細胞は、0.01%、0.1%及び0.5%(v/v)の増加する試験濃度のペレグリナ・ペプチド加水分解物の非存在下(対照)又は存在下で、連続3回継代培養した。
試験化合物「ペレグリナ・ペプチド加水分解物」をインキュベーション培地で直接希釈して、上に記載した各種濃度に到達させた。
我々の実験条件下では、0.05%、0.1%及び0.5%(v/v)で試験されたペレグリナ・ペプチド加水分解物は、正常なヒト線維芽細胞のテロメア短縮を大幅に減少させた。
0.05%(v/v)では+8.9%(p<0.05)、及び、0.1%(v/v)では+15.1%(p<0.01)、及び、0.5%(v/v)では+16.6%(p<0.01)における、(対照との比較における)阻害。
ヒト細胞の正常な増殖又は分裂という文脈において、本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物は、テロメア長を大幅に増加させる能力を示す。テロメアは、DNA物質の保護に関与するキャップである。テロメアのサイズを大きくすると、時間の経過とともにDNA物質の完全性が維持される。テロメアの長さの増加は、DNA物質を維持する能力と相関している。ペレグリナ・ペプチド加水分解物はこの長さを伸ばすことができるため、ヒトの遺伝物質(DNA)の維持に関与している。
ゾーン2は本発明による抽出物を含有する製品の適用前後で陽性皮膚保湿値を示し、一方、2つの抽出モードによるモリンガ・オレイフェラ抽出物を含有するゾーン3及びゾーン4は陰性値を示し、すなわち、製品の適用後において適用前よりも皮膚はあまり保湿されていない。本発明によるペプチド加水分解物は局所適用製品における保湿の利点を維持することを可能にし、これにより、本発明によるペレグリナ・ペプチド加水分解物は、試験した他の抽出物から区別される。図1は、得られた結果を示している。
果実が熟したときに採取されたモリンガ・ペレグリナ(Forssk.)Fioriの殻付き種子を乾燥させて内部水分含量を8%未満、優先的には約6%とし、その後、機械的エンドレススクリュープレスでプレスし、これにより、一方でバージン油を、他方で固形物を得るために、油を種子の残りの部分から分離させる。次いで、固形物を、1cmから2cmの断片の事前にカットされた筒状片の形に分離させる。例1に記載のプロトコルにしたがい、液体抽出物が得られ、これが以下の試験において純粋な形態で使用される。
予備実験は、試験する要素の細胞毒性を評価し、次の実験のための投与量範囲を選択するために行う。
第1の遺伝毒性実験(試験1)は、代謝活性化の存在下及び非存在下で、試験系及び試験要素(又は対照物)を予備実験で定められた投与量範囲で最小限のアガー上に直接組み込む。
第2の実験(試験2)は、代謝活性化の存在下及び非存在下で、第1の実験の結果の分析後に試験責任者によって定められた投与量レベルを用いて、試験系及び試験要素(又は対照物)をプレインキュベーションする。この第2の実験は、特に、あいまいな結果又は陰性結果が得られた場合に、第1の実験の結果を確認する又は完成させるために行われた。
例1による抽出物の希釈物は細胞毒性試験を行うために水中で準備された。
- 代謝活性化非存在下での測定:
0.1mLの種々の濃度の試験要素
0.5mLの0.2MのpH7.4の滅菌リン酸緩衝液
2mLのネズミチフス菌用トップアガー
0.1mLの細菌種菌(TA100)
- 代謝活性化存在下での測定:
0.1mLの種々の濃度の試験要素
2mLのネズミチフス菌用トップアガー
0.1mLの細菌種菌(TA100)
0.5mLのS9混合物
0.1mLの0.2MのpH7.4のリン酸緩衝液
0.1mLの溶媒
0.1mLのS9混合物
0.1mLの最高濃度の試験要素調製物
- 検証工程の結論として、試験要素が変異原性であると考えられるのは以下の場合であり、すなわち、代謝活性化の存在下及び/又は非存在下で、5つの菌株のうち1つ以上で投与量と効果の間の関係が再現性よく得られた場合である。変異原性は、復帰突然変異株の数がTA98株、TA100株及びTA102株で自然復帰率の2倍以上(R≧2)である場合、並びにTA1535株及びTA1537株で自然復帰率の3倍以上(R≧3)である場合にのみ、所定の濃度について考慮される。
- 試験1及び試験2の結論として、試験要素が非変異原性であると考えられるのは以下の場合であり、すなわち、代謝活性化の存在下及び非存在下で、試験要素の全濃度について、復帰突然変異株の頻度が常に、TA98株、TA100株及びTA102株については自然復帰率の2倍未満(R<2)である場合、TA1535株及びTA1537株については自然復帰率の3倍未満(R<3)である場合であるが、但し、試験された濃度の毒性に変異原性作用の欠如が関係していないことを確認したことを条件とする。
- 細胞毒性作用は認められなかった。
- 試験抽出物のいずれの濃度も、代謝活性化の存在下及び非存在下で、TA98株、TA100株及びTA102株について自然復帰率の少なくとも2倍以上、又はTA1535株及びTA1537株について自然復帰率の3倍以上の比率Rを示さなかった。
- 試験系又は試験条件に関係なく投与量応答は観察されなかった。
細胞のUVA感受性は、増加する照射線量に細胞を曝露した後の細胞の生存性を評価することによって、約10回継代毎に確認される。細胞を試験に用いた密度で培養する。それらを2.5J/cm2及び9J/cm2の照射量で翌日に照射し、細胞生存性を1日後にNRU試験によって決定する。細胞は、5J/cm2のUVA照射後の生存性が暗所に維持された対照の生存性の80%以上である場合、品質基準を満たし、9J/cm2のUVAの最高照射量では、生存性は、暗所に維持された対照の生存性の少なくとも50%に等しくなければならない。
陰性対照は0.4以上の吸光度を有する。陽性対照であるクロルプロマジンは、IC50値が、UVAの存在下で0.1μg/mLから2μg/mL、UVAの非存在下で7μg/mLから90μg/mLである。これらの結果により試験を有効性のあるものとすることができる。UVAの照射下又は非照射下で50%細胞死をもたらすペレグリナ固形物のペプチド加水分解物の濃度は推定できない。死亡率が50%に達することはなかった。UVAの照射下又は非照射下で50%細胞生存率をもたらすペレグリナ固形物のペプチド加水分解物の濃度は推定できない。生存率は常に50%を超える。
適用された実験条件の下において、ペレグリナ固形物のペプチド加水分解物は非光毒性と考えることができる。
50%細胞死をもたらすペプチド加水分解物の濃度は50%超えと評価された。ペプチド加水分解物50%での細胞死のパーセンテージは17%であると評価された。
適用された実験条件下において、ペレグリナ固形物のペプチド加水分解物の細胞毒性は無視できる細胞毒性であると考えることができる。
0:反応なし
0.5:非常に軽度
1:軽度
2:中程度
3:顕著
M.I.S.=皮膚反応の和(紅斑+浮腫+水疱+丘疹+小水疱)/分析したボランティアの数
M.I.S.≦0.20 非刺激性
0.20<M.I.S.≦0.50 わずかに刺激性
0.50<M.I.S.≦2 中程度の刺激性
2<M.I.S.≦3 高度の刺激性
ペレグリナ固形物のペプチド加水分解物の平均刺激スコア(M.I.S.)は0に等しい。
ペレグリナ固形物のペプチド加水分解物は、12名のボランティアに48時間連続適用した後、非刺激性と考えられる。
上で行った試験の結果は疑う余地のないものであり、例1によるペプチド加水分解物について、以下の点を実証するものである。
1)眼及び皮膚刺激性試験は陰性
2)光毒性試験は陰性
3)変異原性試験は陰性
本発明によるペプチド加水分解物の安全性が実証され、ターゲット集団に関する制限なく大規模局所美容用品使用に理想的である。
含まれた、分析されたボランティアの数:23
顔、首、首筋及び/又は手にほくろがある、平均年齢64歳(44歳から70歳まで)の女性。
1日2回、28日間、エンドウ豆大の量の製品を顔、首、首筋及び手の清潔な皮膚に塗り、製品が完全に浸透するまでマッサージする。目に入らないようにする。日光を浴びる前には、提供される日焼け止め製品を塗る。
色素除去の見込みの評価:D1及びD28での、3つの部位(処理された色素沈着ゾーン、処理された非色素沈着ゾーン、未処理の非色素沈着対照ゾーン)でのメクサメトリック(mexametriques)測定
不快感に関するボランティアからのフィードバック
D1及びD28でのC-Cubeビデオダーモスコープ(Pixience SAS,Toulouse,フランス)を使用したほくろの説明用の写真(最終レポートが得られる段階になったときにWeTransferによってコンタクトシートの形で送信される)
化粧品の許容性:D28にボランティアによって記入されるアンケート
試験の条件下において、試験製品は28日間の使用後に大きな色素除去効果を示した。
Claims (18)
- ペプチド加水分解物を含む、モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物であって、
前記ペプチド加水分解物は、
アミノ酸誘導体、アミノ酸、ペプチド及びグリコペプチドを含み、
分子量が100Daから6000Daの間であり、
前記抽出物は、熟したモリンガ・ペレグリナの果実の殻付き種子の化学タンパク質分解によって得られたものであり、前記化学タンパク質分解は、16℃から25℃の温度で約2時間、13より高いpHで行われる、抽出物。 - 前記抽出物は、0.3%から3%の揮発性化合物をさらに含み、この化合物の50%、すなわち前記抽出物の0.15%から1.5%が、軽ニトリル化合物、主にイソブチロニトリル及びメチルブタンニトリルから構成され、この化合物の5%から10%、すなわち前記抽出物の0.015%から0.3%が、イソチオシアネート誘導体、主にイソプロピルイソチオシアネート及びイソブチルイソチオシアネートから構成され、この化合物の1%から5%、すなわち0.003%から0.15%が、精油、主にユーカリプトール、メントール及びベンズアルデヒドから構成される、請求項1に記載の抽出物。
- アミノ酸誘導体、アミノ酸、ペプチド及びグリコペプチドを含むペプチド加水分解物であって分子量が100Daから6000Daの間であるペプチド加水分解物を含む、モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物を得るための方法であって、
熟したモリンガ・ペレグリナの果実の殻付き種子の化学タンパク質分解を行う工程を含み、
前記化学タンパク質分解は、16℃から25℃の温度で約2時間、13より高いpHで行われる、方法。 - a)モリンガ・ペレグリナの果実が熟したときに採取された殻付き種子を収集し、乾燥させて、内部水分含量を8%未満とする工程と、
b)乾燥させた前記種子をプレスして、油を前記種子の残りの部分から分離させて、6重量%未満の残油を含む固形物を得る工程と、
c)前記工程b)で得られた前記固形物を粉砕する工程と、
d)前記工程c)で得られた粉砕された前記固形物を、水相中に分散させる工程と、
e)前記工程d)で得られた水分散液を用いて前記化学タンパク質分解を行う工程と、
f)得られたペプチド加水分解物を安定させるために、前記化学タンパク質分解を中和させる工程と、
g)前記ペプチド加水分解物を固液分離によって回収する工程と、
h)前記ペプチド加水分解物を限外ろ過によって精製する工程と、を含む、請求項3に記載の方法。 - i)前記工程h)で得られた前記ペプチド加水分解物を凍結乾燥させる工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記工程g)の前記固液分離は、遠心分離、脱水又はろ過などの各種処理によって行われる、請求項4又は5に記載の方法。
- 前記工程h)の前記限外ろ過は、100Daから6000Daの間のカットオフ閾値で行われる、請求項4~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程h)の前記限外ろ過は、1500Daから5000Daの間のカットオフ閾値で行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記工程h)の前記限外ろ過は、3000Daから4500Daの間のカットオフ閾値で行われる、請求項8に記載の方法。
- 活性剤として有効量の請求項1又は2に記載のモリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物と、生理学的に許容される添加剤と、を含有する、美容用品組成物又はニュートリコスメティクス組成物。
- 前記組成物は、皮膚への局所適用のために製剤化された美容用品組成物であり、
前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物は、前記美容用品組成物の総重量に対して0.002重量%から20重量%の濃度で前記美容用品組成物中に存在する、請求項10に記載の組成物。 - 前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物は、前記美容用品組成物の総重量に対して0.01重量%から10重量%の濃度で前記美容用品組成物中に存在する、請求項11に記載の組成物。
- 経口摂取用に製剤化されたニュートリコスメティクス組成物であって、
モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物が、前記ニュートリコスメティクス組成物の総重量に対して0.01重量%から100重量%の濃度で前記ニュートリコスメティクス組成物中に存在する、ニュートリコスメティクス組成物。 - 請求項10~13のいずれか1項に記載の組成物の美容用品又はニュートリコスメティクスにおける使用であって、当該使用は、皮膚、粘膜又は外皮の外観の改善、皮膚又は粘膜の乾燥の予防及び/又は対処、皮膚の老化及び/又は光老化のサインの予防及び/又は対処、美白の促進、並びに痩身の促進のための、使用。
- 美容用品組成物又はニュートリコスメティクス組成物を得るための方法であって、
請求項3~9のいずれか1項に記載の方法を実行して、前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物を得る工程と、
活性剤として、有効量の前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物を提供する工程と、
生理学的に許容される添加剤を提供する工程と、を含む、方法。 - 得られた前記組成物は、皮膚への局所適用のために製剤化された美容用品組成物であり、
前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物は、前記美容用品組成物の総重量に対して0.002重量%から20重量%の濃度で前記美容用品組成物中に存在する、請求項15に記載の方法。 - 前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物は、前記美容用品組成物の総重量に対して0.01重量%から10重量%の濃度で前記美容用品組成物中に存在する、請求項16に記載の方法。
- 経口摂取用に製剤化されたニュートリコスメティクス組成物を得るための方法であって、
請求項3~9のいずれか1項に記載の方法を実行して、前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物を得る工程と、
前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の抽出物を、前記ニュートリコスメティクス組成物の総重量に対して0.01重量%から100重量%の濃度で提供する工程と、を含む、方法。
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