FR3110346A1

FR3110346A1 - Extrait du tourteau des graines de Moringa peregrina, son procédé d’obtention et son utilisation dans des compositions cosmétiques ou nutricosmétiques

Info

Publication number: FR3110346A1
Application number: FR2005433A
Authority: FR
Inventors: Vincent Bourgeteau; Elisabeth DODINET
Original assignee: Agence Francaise pour le Developpement Dalula AFALULA SAS
Current assignee: Agence Francaise pour le Developpement Dalula AFALULA SAS
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: MA58503A1; FR3110346B1; MA58503B1

Abstract

L’invention concerne un extrait du tourteau des graines de Moringa peregrina comprenant majoritairement un hydrolysat peptidique et un procédé d’obtention de l’extrait. Elle concerne également les compositions cosmétiques ou nutricosmétiques comprenant ledit extrait et l’utilisation des dites compositions pour améliorer l’aspect de la peau, des muqueuses ou des phanères, prévenir et/ou lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses, prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement, favoriser le blanchiment de la peau et prévenir les tâches de vieillesse, favoriser l’amincissement et prévenir ou soulager les rougeurs de la peau.

Description

Extrait du tourteau des graines de Moringa peregrina, son procédé d’obtention et son utilisation dans des compositions cosmétiques ou nutricosmétiques

L’invention se rapporte au domaine de la cosmétique et nutricosmétique et plus particulièrement celui des ingrédients actifs entrant dans la formulation des compositions pour les soins de la peau. L’invention a trait à un extrait du tourteau des graines deMoringa peregrinacomprenant majoritairement un hydrolysat peptidique. L’invention concerne également le procédé d’obtention de l’extrait particulier du tourteau des graines deMoringa peregrina ,les compositions cosmétiques ou nutricosmétiques comprenant de tels extraits, et enfin l’utilisation cosmétique ou nutricosmétique de telles compositions pour le soin de la peau, du cuir chevelu et des phanères.

Arrière-plan technologique

Les Moringaceae constituent une famille mono-générique (un seul genre,MoringaAdans), élément de la flore Saharo-sindienne, constituée d’entre douze et quatorze espèces selon les auteurs, réparties de l’Afrique orientale à l’Asie. Le genre est classiquement divisé en 3 sections qui ne sont, cependant, pas confirmées comme monophylétiques par les analyses phylogénétiques. Ces dernières ont plutôt mis en évidence des clades axés sur certains caractères morphologiques : pachycaules (« bottle trees ») ; tubéreux (« tuberous trees ») et ni pachycaules - ni tubéreux (en anglais « slender trees »). L’espèceMoringa peregrina(Forssk.) Fiori, appartient au troisième groupe. Les quelques études génétiques sur le genre ou la famille confirment la réalité de l’espèce par rapport aux autres espèces dans le genre, notamment vis-à-vis du Moringa indien,Moringa oleiferaLam. (voir notamment les articles:Olson , M. E. 2002, Combining Data from DNA Sequences and Morphology for a Phylogeny of Moringaceae (Brassicales),Systematic Botany27(1): 55-73;Hassanein , A. M. A. et AL-SOQEE, A. A., 2018,Morphological and genetic diversity ofMoringa oleiferaandMoringa peregrinagenotypes,Horticulture, Environment and Biotechnology59(2): 251-261). Un article récent sur leMoringa peregrinaéchantillonné sur différentes localités en Arabie Saoudite a conclu, en utilisant des marqueurs ITS, à une stabilité génétique de l’espèce (A la klabi , A.,2015, Genetic diversity ofMoringa peregrinaspecies in Saudi Arabia with ITS sequences,Saudi Journal of Biological Sciences22: 186-190) avec cependant un haut niveau de variation génétique intra-populations.

L’espèceMoringa peregrinase retrouve dans les environnements rocheux du Yémen, d’Oman, et d’Arabie Saoudite, en Afrique orientale, au Soudan, en Éthiopie, Érythrée, Somalie et Djibouti. Sa présence en Iran semble limitée aux provinces sud-orientales mais demande à être confirmée (PROTA14=Munyanziza E. et Yongabi K. A.,Vegetable oils/Oléagineux,Moringa peregrina(Forssk.) Fiori, http://database.prota.org/protahtml/moringa peregrina_fr.htm, accès le 23/10/2019). Au Levant et en Égypte, l’espèce ne représente, aujourd’hui, plus que de rares stations dispersées, relictuelles (à l’exception de quelques peuplements altitudinaux), principalement dans les secteurs de l’aire soudanienne.Moringa peregrinaest également considéré aujourd’hui comme rare et en danger au Soudan et au Yémen.Moringa peregrinaoccupe par rapport aux autres espèces de son clade les habitats les plus arides et les plus inhospitaliers. Il est apparemment plus résistant à la sécheresse queMoringa oleiferaqui est planté commercialement à grande échelle dans les zones tropicales et subtropicales. Des travaux récents ont montré que la taille et la grosseur des graines impactait favorablement le temps de germination et le taux et la rapidité de la croissance des jeunes individus (Gomaa N. H. et Picó F. X., 2011, Seed germination, seedling traits, and seed bank of the treeMoringa peregrina(Moringaceae) in a hyper-arid environment, American Journal of Botany98(6): 1024-1030), indiquant un ajustement dans l’allocation des ressources sur la qualité de la graine plutôt que le nombre, ce qui permet àMoringa peregrinade se reproduire efficacement dans des environnements abiotiques extrêmes (hyperarides). Les graines deMoringa peregrinaont une mesotesta centrale plus épaisse, en termes de couche de cellules, que celles deM oringa oleifera.

Il existe quelques mentions historiques qui tendent à indiquer que l’huile deMoringa peregrinafaisait l’objet d’un commerce actif dans les débuts de l’Islam dans la région d’AlUla (Naseef, A. A. S., 1995,A l-‘Ulā, A study of Cultural and Social Heritage). L’huile produite à partir deMoringa peregrinaest aujourd’hui destinée principalement à l’autoconsommation ou aux marchés locaux. En Arabie Saoudite, les feuilles étaient utilisées traditionnellement en décoction en usage interne pour soigner le diabète, les maladies du colon, les maladies des yeux et les anémies (Abdel-Kader , M. S., Hazazi A.M. A., Elmakki O. A. et Alqasoumi S. I., 2018,A survey on the traditional plants used in Al Kobah village,Saudi Pharmaceutical Journal26(6): 817-821) et comme diurétique, rubéfiant et astringent (Aqeel A. A .M. , Tariq M. , Mossa J. S., Al-Yahya M. A. et Al-Said M. S.,1984, «Plants used in Arabia Folk medicine ,Report submitted to Saudi Arabian National Cenre for Science and Technology,Riyadh, Saudi Arabia). En Oman, l’huile, extraite par les femmes à la fin de l’été, est utilisée contre les migraines, la fièvre, les brûlures, les lacérations et les fractures, la constipation et les douleurs d’estomac, contre les douleurs musculaires et contre la sécheresse capillaire (Ghazanfar S. A., 1994, Handbook of Arabian Medicinal Plants, 1^eéd., CRC Press, Boca Raton, Ann Harbor, s.u. ;GhazanfarS.A., 1998, Plants of Economic Importance, cap. 15, inGhazanfar, S.A. et Fisher, M. (éd.)Vegetation of the Arabian Peninsula. Geobotany 25, p. 241-264, Kluwer Academic Publishers, tableau 11.1, p. 247 et 11.7 p. 251). Elle était également utilisée dans des compositions parfumées (GhazanfarS. A., 1998, p. 259) et en Oman et au Yémen comme lotion faciale (Ghazanfar S. A. et Rechinger B .,1996, Two multi-purpose seed oils form Oman. Plants for Food and Medicine.Paper presented at the joint meeting of the Society for Economic Botany and International Society for Ethnopharmacology, 1-7 July 1996, London).

On connait des extraits provenant de la graine deMoringa oleifera, dans le domaine cosmétique. Par exemple on connaît du document FR296879 un extrait de graines entières (avec téguments) deMoringa oleiferacontenant pour 100 g d’extrait sec de 5 à 50% d'huile (dont triglycérides, acides gras et lipides polaires) et de 0.01 à 5% de polyphénols, et son utilisation dans des compositions cosmétiques pour lutter contre le vieillissement cutané. Dans ce document, il est effectué une extraction par un solvant moyennement polaire sur la graine entière deMoringa oleifera.

On connaît également du document FR2776519 que des extraits protéiques de graines deMoringa oleifera, connus pour leurs effets clarifiants sur les eaux turbides, présentent sur la peau et les muqueuses un effet adoucissant, conditionneur physiologique, hydratant, restructurant, réparateur et un effet antipollution. Dans ce document les principes actifs sont des protéines de poids moléculaires compris entre 6.5 et 8.8 kDa qui sont obtenues par extraction aqueuse sur le tourteau deMoringa oleifera.

On connaît encore du document FR2825267 que des extraits de graines deMoringa, entières ou broyées, décortiquées ou non décortiquées, ou dont on a réalisé un broyat ou des extraits protéiniques délipidées ou non délipidées, ont des bénéfices dans les domaines de la désodorisation et de la suppression des mauvaises odeurs, de la propreté, de l'hygiène intime, de l'hygiène buccale et des soins dentaires, de même que des propriétés cosmétiques adoucissantes, hydratantes, apaisantes et anti-fatigue sur la peau, Dans ce document, il est démontré que les extraits de protéines entières présentent une activité accrue lorsque la graine n’est pas déshuilée.

Le document FR3076460 concerne l’utilisation d’un extrait protéique de graine non germée et déshuilée deMoringa oleiferapour le traitement des peaux et/ou muqueuses sensibles, sensibilisées, réactives, fragiles et/ou fragilisées et/ou dans le traitement et/ou la prévention de l'érythème, en particulier l'érythème fessier du nourrisson. Dans ce document, le procédé d’extraction permet d’obtenir une fraction majeure de protéines dont les poids moléculaires sont environ de 8800 Da.

Enfin, on connaît du document KR20130088224 l’utilisation d’un extrait de graine entière germée deMoringa oleiferaen cosmétique, en particulier obtenu par une extraction à l’aide d’un fluide supercritique. Ce procédé permet d’isoler des caroténoïdes et acides aminés apolaires, qui sont décrits comme actifs pour une utilisation cosmétique blanchissante.

Tous les documents précités concernent l’utilisation de l’espèceMoringa oleifera, aucun ne décrit ni ne suggère l’utilisation dans le domaine cosmétique d’extraits provenant de l’espèceMoringa peregrina.

Plus spécifiquement pour l’espèceMoringa peregrina, on connait que certains composés phénoliques et flavonoïdes obtenus de feuille ou de la graine entière deMoringa peregrinaprésentent une activité anti-oxydante (Al-DabbasM., 2017, Antioxidant activity of different extracts from the aerial part ofMoringa peregrina(Forssk.) Fiori, from Jordan,Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences ,30(6): 2151-2157). Ces composés sont extraits avec des solvants tels que le méthanol, l’éthyl acétate ou l’hexane à partir des feuilles ou des graines entières. Il apparaît que ce sont les feuilles qui comprennent le plus de composés actifs.

Ainsi, selon l’espèce utilisée dans le genreMoringa, il est observé que selon la partie des plantes (feuille, graine), la partie des graines (entière ou non, décortiquée ou non) et le procédé d'extraction mis en œuvre, notamment le choix du solvant, les molécules extraites s'avèrent être différentes. Or la composition de l'extrait conditionne l'activité biologique et en conséquence l'efficacité cosmétique.

Considérant ce qui précède, un problème que se propose de résoudre l’invention est de développer des produits nouveaux à base d’un extrait de l’espèceM oringa peregrinadu genreMoringaet de la famille Moringaceae qui soient utilisables en cosmétique et facile à mettre en œuvre.

De ce fait, la Demanderesse a mis en évidence un nouvel extrait obtenu à partir du tourteau des graines de l’espèceMoringa peregrina,qui améliore l’aspect de la peau, des muqueuses et des phanères et notamment pour prévenir et/ou lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses, prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement, favoriser le blanchiment de la peau et prévenir les tâches de vieillesse, ainsi que pour favoriser l’amincissement et prévenir ou soulager les rougeurs de la peau. L’extrait selon l’invention comprend majoritairement un hydrolysat peptique du tourteau des graines deMoringa peregrina. L’extrait obtenu spécifiquement à partir du tourteau des graines non décortiquées deMoringa p ere grinaest nouveau à double titre dans le domaine de la cosmétique par rapport aux extraits de l’art antérieur, d’une part par l’espèce spécifique d’origine utilisée et d’autre part par son profil moléculaire particuliers.

Résumé

L’invention a pour premier objet un extrait du tourteau des graines deMoringa peregrinacomprenant majoritairement un hydrolysat peptique.

Grâce à sa caractéristique, l’extrait selon l’invention est unique dans le genreMoringaet la famille Moringaceae. Il sera démontré que l’extrait de l’espèceMoringa peregrinaprésente un hydrolysat peptidique particulier et différent des autres espèces du genre, notamment de l’espèceMoringa oleifera, que la demanderesse a su mettre en évidence.

L’invention a pour deuxième objet un procédé d’obtention d’un extrait de tourteau des graines deMoringa peregrinaselon l’invention, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes selon lesquelles :
a) on recueille les graines non décortiquées deMoringa peregrinaque l’on sèche pour obtenir un taux d’humidité interne inférieur à 8%,
b) on presse les graines séchées de sorte à séparer l’huile de peregrina (nom INCI « Moringa peregrina seed oil ») du reste de la graine de sorte à obtenir le tourteau comprenant moins de 6% en poids d’huile résiduelle,
c) on broie le tourteau obtenu à l’étape b),
d) on met en dispersion en phase aqueuse le tourteau broyé obtenu à l’étape c),
e) on réalise une protéolyse chimique et/ou enzymatique de la dispersion aqueuse obtenue à l’étape d) pendant une durée comprise entre 30 minutes et 4 heures,
f) on neutralise la protéolyse pour stabiliser l’hydrolysat peptidique obtenu,
g) on récupère l’hydrolysat peptidique par séparation solide/liquide,
h) on purifie l’hydrolysat peptidique par ultrafiltration, puis éventuellement,
i) on effectue une lyophilisation de l’hydrolysat peptidique obtenu à l’étape h).

L’invention a pour troisième objet une composition cosmétique ou nutricosmétique comprenant à titre d’agent actif, une quantité efficace d’un extrait du tourteau des graines deMoringa peregrinaselon l’invention et un excipient physiologiquement acceptable.

L’invention a enfin pour quatrième objet l’utilisation cosmétique ou nutricosmétique d’une composition selon l’invention, pour améliorer l’aspect de la peau, des muqueuses ou des phanères, prévenir et/ou lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses, prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement, favoriser le blanchiment de la peau et prévenir les tâches de vieillesse et également prévenir ou soulager les rougeurs de la peau.

L’invention a enfin pour cinquième objet l’utilisation cosmétique ou nutricosmétique d’une composition selon l’invention, pour favoriser l’amincissement.

Brève description des figures

L’invention sera mieux comprise, et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description suivante de plusieurs modes de réalisation particuliers de l’invention, donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés.

représente les résultats comparatifs de l’effet hydratant de différents produits à la surface de la peau.

Dans cette description, à moins qu’il n’en soit spécifié autrement, il est entendu que, lorsqu’un intervalle est donné, il inclut les bornes supérieures et inférieures dudit intervalle.

Dans la présente invention, les abréviations suivantes signifient :
- MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium (test MTT est une méthode rapide pour la numération des cellules vivantes)
- SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
- PBS : Phosphate Buffer Saline
- ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
- PCR : Polymerase Chain Reaction
- ANOVA : Analysis Of Variance
- MSH : Melanocyte Stimulating Hormone

Dans la présente invention, on entend par :
- « majoritairement un hydrolysat peptidique » une quantité supérieure à 10%, préférentiellement supérieure à 20%, préférentiellement encore supérieure à 30% et pouvant atteindre environ 40% (Masse/Masse) de matière sèche en peptides, oligopeptides, glycopeptides et en acides aminés ou leurs dérivés nitrilés volatiles, préférentiellement encore 50% du poids de la matière sèche.
- « quantité efficace » la quantité nécessaire de molécules actives pour obtenir le résultat recherché, à savoir, permettre notamment d’améliorer l’aspect de la peau.
- « protéolyse » la segmentation des protéines en peptides, oligopeptides et ses fragments de base (acides aminés) via l'hydrolyse chimique ou enzymatique.
- « application topique », le fait d’appliquer ou d’étaler le principe actif selon l’invention, ou une composition le contenant, à la surface de la peau, d’une muqueuse ou des phanères.
- « physiologiquement acceptable » qui convient à une utilisation topique, en contact avec la peau humaine, ou à une utilisation par d’autres voies d’administration, par exemple la voie orale ou l’injection dans la peau, sans risque de toxicité, d’incompatibilité, d’instabilité, de réponse allergique.
- « tourteau », la partie déshuilée de la graine après pressage. Il s’agit du résidu solide de l’extraction de l’huile des graines. C’est un coproduit de la trituration, procédé de fabrication de l’huile. Il représente généralement de 50 à 75% de la masse des graines.
- « graines non décortiquées », le fait que la coque (péricarpe) et le tégument des graines récoltées soient maintenus autour des amandes.
- « environ » une marge plus ou moins de 10% à 20% par rapport à l’information donnée.
- « pool de molécules actives », également « principe actif », l’hydrolysat peptidique extrait selon le procédé de l’invention à partir du tourteau des graines deMoringa peregrina. Cet hydrolysat est responsable des activités biologiques décrites dans la présente invention.
- « agent actif » une quantité suffisante d’un extrait selon l’invention pour obtenir les activités biologiques décrites. Selon si l’extrait est liquide ou séché, concentré ou non, les quantités de l’agent actif peut varier dans les proportions de 0,002 à 40% en poids par rapport au poids total de la composition.
- « signes du vieillissement cutané », toutes modifications de l’aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, la peau flétrie, la peau molle, la peau amincie, le manque d’élasticité et/ou de tonus de la peau, la peau terne et sans éclat ou les taches de pigmentation de la peau, la décoloration des cheveux ou les taches sur les ongles, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, toute dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnements ultraviolets (UV).

L’invention concerne en premier objet un extrait du tourteau des graines deMoringa peregrinacomprenant majoritairement un hydrolysat peptique. L’hydrolysat peptidique, comprenant des peptides, oligopeptides, glycopeptides et acides aminés, n’a jamais été mis en évidence dans un extrait des graines des espèces du genreMoringa. L’espèceMoringa peregrinapousse dans des climats très arides. Ainsi, sa faculté à résister à la sécheresse et à se reproduire dans des conditions extrémophiles lui a permis d’acquérir des caractéristiques particulières uniques, que la Demanderesse a pu identifier par la mise en œuvre d’un procédé d’extraction spécifique sur le tourteau des graines deMoringa peregrina.

Dans le cadre de la présente invention, la partie de plante choisie est le tourteau de la graine deMoringa peregrina. Il est connu que les graines deMoringa peregrinasont utilisées pour l’extraction de leur huile, utile pour l’autoconsommation ou en soins médicinaux traditionnels divers. Le tourteau obtenu après que la graine ait été déshuilée, est un déchet actuellement utilisé pour la nourriture des animaux notamment.

Selon un mode de réalisation préférentiel, l’extrait selon l’invention est obtenu du tourteau des graines non décortiquées deMoringa peregrina.

Selon un mode de réalisation, l’hydrolysat peptidique de l’extrait selon l’invention comprend des dérivés d’acides aminés, des acides aminés, des peptides et glycopeptides dont le poids moléculaire est compris entre 100 Da et 6000 Da, et plus particulièrement entre 1500 Da et 5000 Da, et encore plus particulièrement entre 3000 Da et 4500 Da.

Selon un autre mode de réalisation, l’extrait comprend également entre 0.3 % et 3 % de composés volatiles, dont 50% de ces composés soit entre 0.15% et 1.5% de l’extrait selon l’invention est constitué de composés nitrilés légers, avec principalement l’isobutyronitrile et le methyl-butanenitrile ; dont 5 à 10% de ces composés soit entre 0.015 et 0.3% de l’extrait selon l’invention est constitué de dérivés d’isothiocyanates, avec principalement l’isothiocyanate d’isopropyle et l’isothiocyanate d’isobutyle ; dont 1 à 5% de ces composés soit entre 0.003 et 0.15 % est constitué d’huile essentielle, avec principalement de l’eucalyptol, du menthol et du benzaldéhyde.

L’invention a pour deuxième objet un procédé d’un extrait de tourteau des graines deMoringa peregrinaselon l’invention comprenant les étapes suivantes selon lesquelles :
a) on recueille les graines non décortiquées deMoringa peregrinaque l’on sèche pour obtenir un taux d’humidité interne inférieur à 8%,
b) on presse les graines séchées de sorte à séparer l’huile du reste de la graine de sorte à obtenir le tourteau comprenant moins de 6% en poids d’huile résiduelle,
c) on broie le tourteau obtenu à l’étape b),
d) on met en dispersion en phase aqueuse le tourteau broyé obtenu à l’étape c),
e) on réalise une protéolyse chimique et/ou enzymatique de la dispersion aqueuse obtenue à l’étape d) pendant une durée comprise entre 30 minutes et 4 heures,
f) on neutralise la protéolyse pour stabiliser l’hydrolysat peptidique obtenu,
g) on récupère l’hydrolysat peptidique par séparation solide/liquide,
h) on purifie l’hydrolysat peptidique par ultrafiltration, puis éventuellement :
i) on effectue une lyophilisation de l’hydrolysat peptidique obtenu à l’étape h).

On recueille les graines non décortiquées, c’est à dire dont on garde la coque (péricarpe), à maturité du fruit et préférentiellement lorsque la gousse est en début de déhiscence.

On sèche les graines pour obtenir un taux d’humidité interne inférieur à 8% et préférentiellement autour de 6%, le séchage se fera préférentiellement sur clayette ventilée à l’abri des rayons du soleil de préférence sous ombrière à l’air libre.

On broie alors les graines séchées extemporanément au pressage à froid qui permet de séparer mécaniquement l’huile du reste de la graine compressée à savoir le tourteau.

Le tourteau est alors broyé mécaniquement avec tout type de broyeurs mécaniques tels que système à marteaux, à fléau, à couteaux, à concassage/déchiquetage, à billes ou boulets ou à pilon, mais aussi avec tout type de cryobroyeur.

La dispersion en phase aqueuse selon l’étape d) et la protéolyse selon l’étape e) s’effectuent avantageusement toujours sous agitation permettant ainsi une dispersion et une homogénéisation du solide dans le liquide, améliorant ainsi la surface d’échange globale et par conséquent la protéolyse.

Selon un mode de réalisation du procédé selon l’invention, on réalise une protéolyse chimique à l’étape e) par hydrolyse alcaline, à une température comprise entre 12 et 40°C et à pH supérieur à 13 pendant une durée d’environ 2 heures.

On obtient un hydrolysat peptidique liquide d’une densité supérieure à 1 et préférentiellement autour de 1.1, comprenant un taux de matières sèches compris entre 10 et 15 %, préférentiellement autour de 12.5% comprenant entre 1 et 6% de composés azotés, notamment des dérivés nitriles volatiles dans une proportion de 0.5 à 1.5%, préférentiellement autour de 0.8%.et 20 mg/litre de polyphénols (0.0002%).

Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l’invention, on réalise une protéolyse enzymatique à l’étape e) avec des protéases alcalines, à une température comprise entre 12 et 40°C et à pH inférieur à 9 pendant une durée d’environ 2 heures.

Selon un mode de réalisation préférentiel du procédé selon l’invention, la température de la protéolyse de l’étape f) est comprise entre 16 et 25°C.

Selon un mode de réalisation préférentiel du procédé selon l’invention, la séparation solide/liquide de l’étape g) est réalisée par différents procédés tels que centrifugation, essorage, filtration.

Selon un autre mode de réalisation préférentiel du procédé selon l’invention, l’ultrafiltration à l’étape h) est effectuée avec un seuil de coupure compris entre 100 Da et 6000 Da et plus particulièrement entre 1500 Da et 5000 Da, et encore plus particulièrement entre 3000 Da et 4500 Da.

Dans un mode de réalisation selon l’invention, le procédé d’obtention d’un extrait de tourteau des graines est obtenu à partir du tourteau des graines non décortiquées par protéolyse, sous agitation, dans une proportion de 25% en poids de matière solide par rapport au poids total mis en œuvre dans le solvant aqueux, à une température comprise entre 16 et 25°C pendant une durée d’environ 2 heures.

Dans un mode de réalisation du procédé d’obtention de l’extrait deMoringa peregrinaliquide obtenu, l’hydrolysat peptidique est purifié par distillation, microfiltration, ultrafiltration et/ou nanofiltration pour concentrer l’extrait en composés d’intérêt par rapport aux matières organiques également extraites, notamment des autres dérivés également extraits. Ces étapes de purification permettent de concentrer le pool de composés d’intérêt au dépend d’autres composés extraits tels que cités.

Dans un autre mode de réalisation du procédé d’extraction selon l’invention, l’extrait liquide obtenu est séché de manière à obtenir un extrait sec du tourteau des graines deMoringa peregrinacontenant une quantité supérieure à 10%, préférentiellement supérieure à 20%, préférentiellement encore supérieure à 30% et pouvant atteindre environ 40% (Masse/Masse) de matière sèche en peptides, oligopeptides, glycopeptides et en acides aminés ou leurs dérivés nitrilés volatiles, préférentiellement encore 50% du poids de la matière sèche.

Selon un mode de réalisation de l’invention l’extrait de tourteau des graines deMoringa peregrinaliquide obtenu est préférentiellement séché par exemple par atomisation, lyophilisation ou zéodratation de manière à obtenir un extrait de graines deMoringa peregrinasolide, l’eau étant évaporé. Le séchage peut être réalisé en présence d’un support tel que la maltodextrine, support organique tel que la maltodextrine, cyclodextrine ou inuline, ou en présence d’un support inorganique tel que phyllosilicate, magnésium silicate ou carbonate et ses sels.

L’invention concerne également l’extrait du tourteau des graines deMoringa peregrinasusceptible d’être obtenu par le procédé d’extraction selon l’invention.

L’invention a pour troisième objet une composition cosmétique ou nutricosmétique comprenant à titre d’agent actif, une quantité efficace d’un extrait du tourteau des graines deMoringa peregrinaselon l’invention, et un excipient physiologiquement acceptable.

La composition selon l'invention peut être formulée sous la forme de différentes préparations adaptées à une administration topique ou à une administration orale.
Selon une première variante, les différentes préparations sont adaptées à l'administration topique et incluent les crèmes, les émulsions huile dans eau et eau dans huile, les laits, les pommades, les lotions, les huiles, les baumes, les solutions aqueuses ou hydro-alcooliques ou glycoliques, les sérums, les poudres, les patchs, les sprays ou tout autre produit pour application externe tel que par, exemple, les dispositifs médicaux ou les produits de la cosméto-textile.
Selon une deuxième variante, les différentes préparations sont adaptées à une administration orale ; l'extrait végétal comprenant l’hydrolysat peptidique pouvant entrer soit dans une composition alimentaire soit dans un complément alimentaire. Le complément alimentaire peut se présenter sous forme de gélules ou de capsules molles de gélatine ou végétales dans le cadre de la présente invention. Ledit complément alimentaire peut alors contenir de 0.01 à 100% en poids de l'extrait végétal.

Dans le cadre d'une utilisation alimentaire, à visée nutritive ou cosmétique (cosmeto-food ou nutricosmétique), la composition sera avantageusement formulée sous la forme d'une préparation adaptée à une administration orale. Elle pourra ne pas comprendre d'excipient et être constituée, en intégralité, de l’extrait végétal comprenant l’hydrolysat peptidique sous forme séchée.

Selon un mode de réalisation préférentiel, les compositions selon l'invention sont destinées plus particulièrement à une administration par voie topique. Ces compositions doivent donc contenir un milieu cosmétiquement acceptable, c’est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, et couvrent toutes les formes cosmétiques. Ces compositions pourront notamment être sous forme de crèmes, émulsions huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsions multiples, sérums, solutions, suspensions, gels, laits, lotions, sticks ou encore de poudres, et adaptées à une application sur la peau, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions comprennent les excipients nécessaires à leur formulation, tels que solvants, émollients, épaississants, diluants, tensioactifs, anti-oxydants, agents bioactifs, colorants, conservateurs, parfums. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau.

La composition selon l'invention peut en particulier consister en une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, un après-shampooing, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une lotion restructurante pour les cheveux, un masque, etc. La composition cosmétique selon l'invention peut être utilisée notamment dans les traitements mettant en œuvre une application qui est suivie ou non d'un rinçage, ou encore sous forme de shampooing. La composition selon l'invention pourra avantageusement être utilisée dans les soins antipelliculaires. Elle peut également se présenter sous forme de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux.

Les compositions selon l’invention comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d’odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc.

L’INCI Dictionary & Handbook (« International Nomenclature of Cosmetic Ingredients » (13^eéd. 2010) publié par The Personal Care Products Council Inc., Washington, D.C.) décrit une grande variété, sans limitation, d'ingrédients cosmétiques et pharmaceutiques habituellement utilisés dans l'industrie du soin de la peau, qui conviennent pour être utilisés comme ingrédients additionnels dans les compositions selon la présente invention.

Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l’invention.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la quantité ou teneur en extrait végétal dans la composition cosmétique selon l’invention est de 0.002 à 20 % en poids, et en particulier de 0.2 à 10 % en poids par rapport au poids total de la composition.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la quantité ou teneur en extrait végétal dans la composition nutricosmétique selon l’invention est de 0.002 à 40 % en poids, et en particulier de 0.2 à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition.

L’invention a pour quatrième objet l’utilisation cosmétique ou nutricosmétique d’une composition selon l’invention pour améliorer l’aspect de la peau, des muqueuses ou des phanères, prévenir et/ou lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses, prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement, favoriser le blanchiment de la peau et prévenir les tâches de vieillesse et également pour prévenir ou soulager les rougeurs de la peau.

Enfin, l’invention a pour cinquième objet l’utilisation cosmétique ou nutricosmétique d’une composition selon l’invention pour favoriser l’amincissement.

Bien que l'invention ait été décrite en liaison avec plusieurs modes de réalisation particuliers, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.

L’usage du verbe « comporter », « comprendre » ou « inclure » et de ses formes conjuguées n’exclut pas la présence d’autres éléments ou d’autres étapes que ceux énoncés dans une revendication.

Exemples

Exemple 1 : Préparation d’un extrait végétal selon l’invention à partir du tourteau de Moringa peregrina

Des graines deMoringa peregrina(Forssk.) Fiori ont été séchées pour obtenir un taux d’humidité interne inférieur à 8% et préférentiellement autour de 6%, puis pressées avec une presse mécanique à vis sans fin, de sorte à séparer l’huile du reste de la graine pour obtenir d’une part l’huile vierge peregrina (nom INCI « Moringa peregrina seed oil ») et d’autre part un tourteau. Le tourteau est alors isolé sous forme de boudins prédécoupés en morceau de 1 à 2 cm sur lequel est effectué l’extraction. La composition des matières premières utilisées dans le procédé est donnée ci-dessous.

Matières	Fournisseur	%	Qté réelle pesée
Tourteau de peregrina *prédécoupé en morceaux de 1 à 2 cm			8.4%	33.6
Eau du réseau			80.68%	322.7
Hydroxyde de sodium	PROCHIMIA	3.36 %	13.5
Acide citrique monohydrate F6000	ADETIS	ADETIS	7.14%	28.7
Benzoate de sodium	ADETIS	ADETIS	0.42%	1.7
		Total	100	400.2

Protocole :

a) On prépare une solution concentrée à 1 molaire d’un agent alcalin fort tel que notamment l’hydroxyde de sodium, l’hydroxyde de potassium ou l’hydroxyde de calcium, ou d’un mélange aqueux concentrant 1 molaire d’agents alcalins forts, mais préférentiellement l’hydroxyde de sodium ; cette solution alcaline forte présente un pH 14,

b) On pèse 9.1% (masse/masse) de tourteau de peregrina prédécoupé en morceaux de 1cm environ dans 89.9% (masse/masse) de la solution alcaline,

c) on broie le tourteau obtenu à l’étape b),

d) On met en dispersion en phase aqueuse le tourteau broyé obtenu à l’étape c),

e) on réalise une protéolyse chimique de la dispersion aqueuse obtenue à l’étape d) pendant une durée comprise entre 30 minutes et 4 heures,

f) on neutralise la protéolyse pour stabiliser l’hydrolysat peptidique obtenu avec un acide faible de sorte à tamponner la solution dans une plage de pH 4.5-5.5,

g) on récupère l’hydrolysat peptidique par séparation solide/liquide,

h) on purifie l’hydrolysat peptidique par ultrafiltration,

On obtient un filtrat jaune translucide contenant environ 12.48% de matière sèche. L’extrait liquide obtenu est nommé par la suite « hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention » ou « hydrolysat peptidique peregrina ».

Cet hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention présente une densité supérieure à 1 et préférentiellement autour de 1.1, comprenant un taux de matières sèches compris entre 10 et 15 %, préférentiellement autour de 12.5% comprenant entre 1 et 6% de composés azotés, notamment des dérivés nitriles volatiles dans une proportion de 0.5 à 1.5%, préférentiellement autour de 0.8% et 20 mg/litre de polyphénols (0.0002%). La composition de l’hydrolysat peregrina sec selon l’invention se trouve ci-après.

Tr	N° CAS	Composés	% MS
4.42.	64-17-5	Ethanol	0.809
5.58	67-64-1	Acétone	0.444
6.10	75-15-0	Disulfure de carbone	0.327
7.83	78-93-3	2-Butanone	0.165
8.57	141-78-6	Acétate d'Ethyle	0.047
8.99	78-82-0 Isobutyronitrile 20.720	Isobutyronitrile	20.720
10.39	78-82-0	Isobutyronitrile	0.127
12.06	547-63-7	Isobutyrate de méthyle	0.201
14.10	18936-17-9	2-Méthyl-butanenitrile	2.194
14.56	625-28-5	3-Méthyl-butanenitrile	27.495
18.77	66-25-1	Hexanal	0.186
21.09	2253-73-8	Isothiocyanate d'isopropyle	4.590
23.65	628-73-9	Hexanenitrile	0.198
24.43	110-43-0	2-Heptanone	0.093
27.18	4426-79-3	2-isothiocyanato-Butane	1.058
27.59	80-56-8	Alpha-Pinène	0.048
28.45	591-82-2	Isothiocyanate d'isobutyle	2.299
28.99	100-52-7	Benzaldéhyde	1.753
29.77	108-95-2	Phénol	0.413
30.80	13475-82-6	2,2,4,6,6-pentamethyl-Heptane	0.318
32.80	99-87-6	Para-Cymène	0.232
33.10	138-86-3	Limonène	0.133
33.34	470-82-6	Eucalyptol	0.918
36.45	1195-32-0	Para-Cyménène	0.035
36.88	124-19-6	Nonanal	0.080
40.26	65-85-0	Acide benzoique	19.150
41.07	1490-04-6	Menthol	0.918
56.29	96-76-4	2,4-Di-telt-butylphenol	0.086
		Total	85.035

L’hydrolysat peptidique peregrina contient de l'isothiocyanate d'isopropyle et de l'isothiocyanate d'isobutyle à des niveaux relativement élevés, confirmant les publications antérieures sur l'espèce (Kjaeret al. 1979, Isothiocyanates in Myrosinase-treated seed extracts ofMoringa peregrina,Phytochemistry, 18, p. 1485-1487 ;Afsharypuoret al., 2010, Volatile Constituents of the Seed Kernel and Leaf ofMoringa peregrina(Forssk.) Fiori, Agricolt. Cultivated in Chabahar (Iran),Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences6(2): 141-144 ;DehshahriS. et al., 2012, Determination of volatile glucosinate degradation products in seed coat, stem and in vitro cultures ofMoringa peregrina(Forssk.) Fiori, ScienceOpen,Research in Pharmaceutical Sciences7(1) : 51-56). Les isothiocyanates sont des composés produits par diverses plantes appartenant à l’ordre des Brassicales, notamment dans les familles des Brassicaceae, Capparaceae, Caricaceae et Moringaceae comme système de défense contre les attaques de pathogènes. Dans le genre Moringa, ils ont été identifiés notamment dansM. oleiferaetM. stenopetala(Baker f.) Cufold. (Abd RaniN.Z.,Kharaina, H. etKumolosasi, E., 2018,Moringagenus: A review of Phytochemistry and Pharmacology,Frontiers in Pharmacology, vol. 9, art. 108). Les isothiocyanates proviennent de l'hydrolyse des glucosinolates par l'enzyme myrosinase lorsque les tissus de la plante sont endommagés. Il a été rapporté que les isothiocyanates ont divers effets biologiques, tels qu'une activité antifongique (Troncoso-Rojas , R. et Tiznado-Hernández, M. E., 2007,Natural compounds to control fungal diseases in fruits & vegetables, inTroncoso-Rojas, R., Tiznado-Hernández, M. E., González-León,A. (éd)Recent advances in alternative postharvest technologies to control fungal diseases in fruits & vegetables. Editorial. Transworld Research Network, Kerala, India, pp 127–156; Troncoso-Rojas, R. et al., 2005, Analysis of the isothiocyanates present in cabbage leaves extract and their potential application to control alternaria rot in bell peppers,Food Research International38:701–708), des effets anti-microbiens, anti-cancéreux et anti-inflammatoires (Park, E.J.et al.,2011, Inhibition of lipopolysaccharide induced cyclooxygenase-2 expression and inducible nitric oxyde synthase by 4-[(2′-Ο-acetyl-α-L-rhamnosyloxy)benzyl]isothiocyanate fromM. oleifera,Nutrition and Cancer63(6): 971-982 ;Rajan,T. S.et al., 2016, Anticancer activity of glucomoringin isothiocyanate in human malignant astrocytoma cells,Fitoterapa110 :1-7 ; Padla E. P. et al. 2012, Antimicrobial isothiocyanates from the seeds ofMoringa oleiferaLam.,Zeitschrift für NaturforschungC, 67, 557–564 ;Waterman,C.et al., 2014, Stable, water extractable isothiocyanates from Moringa oleifera leaves attenuate inflammation in vitro. Phytochemistry 103: 114–122). Le furfural est présent à une concentration très standard, trouvée dans ce type de graines et dans de nombreux fruits secs. Le disulfure de carbone, l'isobutyronitrile, l'isobutyrate de méthyle, le méthyl butanenitrile et l'hexanenitrile sont des composés volatils issus des acides aminés. Ce sont des marqueurs de la dégradation des protéines. Ces composés de dégradation représentent environ 50% des composés volatils de l'extrait du tourteau de peregrina hydrolysé. Ce résultat indique que l'extrait est principalement constitué de protéines. Nous n'avons détecté que de très faibles traces de graisses ou de sucres libres dans l'extrait hydrolysé deMoringa peregrina, principalement des protéines et des glycoprotéines. Dans la matière sèche, le tampon citrate (qui est un composé osidique) représente environ 50% du reste et englobe les composés glycosylés (osidiques) résultant de la dégradation par protéolyse des protéines, oligopeptides et acides aminés. Enfin, il est à noter la présence d’environ 20 mg/litre de polyphénols (0,0002%) issus des graines de peregrina. L'acide benzoïque n'est pas à considérer dans la caractérisation car il s'agit d'un agent stabilisant ajouté à l'extrait.

L’extrait sec décrit ci-dessus est obtenu par une méthode gravimétrique basée sur la masse avant et après évaporation présent dans l’extrait liquide.

Exemple 2 : E ffet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention comme anti-oxydant

L’objectif de cette étude est d’évaluer la modulation de l’activité anti-oxydante par l’hydrolysat peptidique peregrina dans un modèle colorimétriquein vitroacellulaire faisant appel au radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) ainsi qu’à l’antioxydant de référence, l’acide ascorbique. La méthode utilisée est dite d’inhibition. Elle est basée sur la dégradation du radical oxydant DPPH, de coloration violette absorbant à 540 nm, par un antioxydant de référence, l’acide ascorbique. Cette réaction sert de témoin positif et conduit à la formation du composé DPPH qui est incolore voire jaune clair. L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention et le produit de référence « Acide Ascorbique » sont mis en contact avec la solution de DPPH pendant 30 mn à 40°C. L’activité antioxydante est alors évaluée par mesure d’absorbance à 540 nm. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage de stimulation de l’activité antioxydante par l’actif testé, avec pour référence l’activité antioxydante maximale obtenue en présence d’acide ascorbique (T+).

Protocole : Une solution de DPPH est incubée, pendant 30 minutes à 40°C, en absence (contrôle), en présence de l’hydrolysat peptidique de peregrina selon l’invention (T+) et à des concentrations décroissantes de l’échantillon à tester. A la fin de la période d’incubation, l’activité antioxydante en présence du produit de référence et en présence ou en absence de l’hydrolysat peptidique peregrina a été révélée par coloration après 30 minutes à 40°C. Elle a ainsi été évaluée par mesure d’absorbance du milieu réactionnel à 540 nm. Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité antioxydante par le produit testé est calculée selon la formule suivante.

[Math. 1] Pourcentage de modulation de l’activité antioxydante = 100 x [(DO540 Contrôle – DO540 Produit à tester) / DO540 Produit de référence].

Si le résultat est négatif, le produit à tester sera considéré comme oxydant ; si le résultat est positif, le pourcentage sera exprimé en stimulation de l’activité anti-radicalaire. Les résultats obtenus sont donnés ci-après de l’inhibition du DPPH par l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention.

	Inhibition DPPH
Hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention	2%	12
	1.0%	13
	0.1%	2

Conclusion : L’hydrolysat peptique peregrina selon l’invention est capable de protéger des radicaux libres, il présente des propriétés anti-oxydantes significatives dès la concentration de 1%.

Exemple 3 : Effet de l’ extrait peregrina selon l’invention comme inhibiteur des Métal l oprotéases

L’objectif de cette étude est d’évaluer la modulation de l’activité anti-Métalloprotéase par l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention dans un modèlein v i t r oacellulaire faisant appel à une Collagénase de type I et une Hyaluronidase, un complexe de substrat et un chromophore, Ninhydrine. Une solution tamponnée de Collagénase de type I et hyaluronidase réagit avec un complexe de substrat spécifique et le transforme pour former un composé capable d’activer un chromophore par incubation à 80°C pendant 15 mn. L’activité de la Collagénase et de la Hyaluronidase peuvent ainsi être évaluées par mesure de l’absorbance à 565 nm. L’échantillon est mis en contact avec la solution de Collagénase et Hyaluronidase en même temps que le complexe de substrat des enzymes à 37°C pendant 5 minutes. Le substrat transformé par les enzymes est capable d’activer le chromophore par incubation à 80°C pendant 15 minutes. L’activité de la Collagénase et Hyaluronidase en présence/absence de l’échantillon est alors évaluée par mesure de l’absorbance à 565 nm. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage d’inhibition ou d’activation de l’activité de la Collagénase et Hyaluronidase en absence d’actif, c’est-à-dire uniquement en présence du substrat de l’enzyme.

Protocole : Une solution d’enzymes Collagénase de type I et Hyaluronidase est incubée dans son substrat, pendant 5 minutes, en absence ou présence de l’extrait peregrina selon l’invention testé. Les solutions sont ensuite mises en contact avec le chromogène, Ninhydrin, avant une incubation de 15 minutes à 80°C. A la fin de la période d’incubation, l’activité des enzymes Collagénase et Hyaluronidase avec et sans produit à l’essai ou de référence a été évaluée par mesure de l’absorbance des milieux réactionnels à 565 nm. Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité des enzymes Collagénase et Hyaluronidase par le produit à l’essai est calculée selon la formule suivante.

[Math. 2] Pourcentage de modulation de l’activité des enzyme Collagénase/ Hyaluronidase = 100 x [(DO produit à l’essai ou de référence – DO Collagénase/Hyaluronidase seule)/DO Collagénase/Hyaluronidase seule].

Si le résultat est négatif, le pourcentage est exprimé en inhibition des enzymes ; si le résultat est positif, le pourcentage est exprimé en activation des enzymes. Les résultats de l’inhibition des Métalloprotéases sont donnés ci-dessous.

		Inhibition versus Contrôle (%)
Hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention	1%	100
	0.5%	100
	0.1%	92
	0.01%	50

Conclusion : L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention engendre une forte inhibition des Métalloprotéases (Collagénase / Hyaluronidase). Il est capable d’inhiber totalement ces Métalloprotéases dès la concentration de 0.5% et a un bon potentiel pour protéger avec une grande efficacité la matrice extra-cellulaire de la peau et, par cette inhibition, il montre un effet anti-vieillissement.

Des tests comparatifs sont reportés ci-après avec l’extrait obtenu selon le brevet FR2946879 de Pierre Fabre dont voici les résultats, selon le même test impliquant simplement la collagénase :

	Pourcentage	Inhibition versus Contrôle (%)
Extrait deMoringa oleiferaselon Brevet Pierre Fabre	1%	Concentration non compatible avec système d’essai
	0,5%	4
	0,1%	24
	0,01%	42

Conclusion : l’extrait selon le brevet de Pierre Fabre montre une légère action inhibitrice sur l’activité collagénase en dose-dépendance inverse avec un pic d’inhibition de 42% toutes concentrations confondues contre un pic d’inhibition de 100% pour l’hydrolysat peptidique selon l’invention.

L’activité anti-âge sur ce paramètre apparaît différente et nouvelle comparativement aux effets observés avec l’extrait selon le brevet de Pierre Fabre.

Exemple 4 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pour inhib er les enzymes Hi stones Desacé tylases (HDACs) et Sirtuine I

L’objectif de cette étude est de démontrer l’activité inhibitrice de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention sur les enzymes HDACs et Sirtuines I. Une solution tamponnée de HDACs & Sirtuine I réagit avec un substrat pendant 20 minutes à 37°C et le transforme pour former un composé qui se colore en présence d’un développeur après incubation à 37°C pendant 10 minutes. L’activité maximum de désacétylation des Sirtuines peut ainsi être évaluée par mesure de l’absorbance à 405 nm L’extrait peregrina selon l’invention ou le produit de référence « Trichostatin A (STA) inhibiteur 1µM » sont mis en contact avec la solution de Sirtuines en même temps que le substrat de l’enzyme pendant 20 minutes à 37°C, le substrat transformé par l’enzyme est coloré par l’ajout d’un développeur. L’activité désacétylante des HDACs et Sirtuine I en présence de l’actif est alors évaluée par mesure de l’absorbance à 405 nm. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage d’inhibition ou d’activation de l’activité maximum des HDACs & Sirtuine I en absence d’actif, c’est-à-dire uniquement en présence du substrat des enzymes HDACs & Sirtuine I.

Protocole : Une solution d’enzymes Sirtuines est incubée dans son substrat pendant 20 mn en absence (contrôle) ou présence du produit de référence, ou de concentrations croissantes des produits à l’essai. L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention est testé aux concentrations suivantes : 2% ; 1% ; 0.1% (V/V). A la fin de la période d’incubation, l’activité des enzymes Sirtuines avec et sans produit à l’essai ou de référence a été révélée par coloration à l’aide d’une solution de développeur (10 mn à 37°C) et évaluée par mesure de l’absorbance des milieux réactionnels à 405 nm. Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité désacétylante des enzymes Histones Désacétysases et Sirtuines I par le produit à l’essai est calculée selon la formule suivante.

[Math. 3] Pourcentage de modulation de l’activité des enzymes Sirtuines = 100 x [(DO₄ ₀ ₅produit à l’essai ou de référence) – (DO₄ ₀ ₅HDACs & Sirtuine I seules)]/DO₄ ₀ ₅Sirtuines seules.

Si le résultat est négatif, le pourcentage est exprimé en inhibition de la réaction enzymatique ; si le résultat est positif, le pourcentage est exprimé en activation de la réaction enzymatique. Les résultats de l’inhibition des enzymes Histones Desacétylases (HDACs) sont donnés ci-dessous.

Hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention	pourcentage	Inhibition versus Contrôle (%)
	2%	15
	1%	ns
	0.10%	-18

Conclusion : A 2% L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention montre une inhibition significative des HDACs ; cette inhibition signifie la capacité de promouvoir l’autoprotection des cellules de la peau contre la dérive génétique, notamment liée au processus de vieillissement. Ainsi l’extrait apparaît être utile contre l’une des dérives génétiques les plus courantes à la surface de la peau à savoir la fibrose qui se manifeste par l’apparition de « bouton » de chair (protubérance fibrotique). L’extrait pourra avantageusement interférer avec les phénomènes de fibrose à la surface de la peau et prévenir ainsi le vieillissement de la peau.

Exemple 5 : Effet tenseur de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention .

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet tenseur de l’actif hydrolysat peptidique peregrina dans un modèlein vi t r oacellulaire de disques de collagène lyophilisé. Des disques de collagène lyophilisé de 8 mm de diamètre ont été utilisés. La contraction de ces disques en réponse aux différents traitements a été mesurée par analyse d’image. Plus la surface des disques de collagène diminue, plus l’effet tenseur des actifs est important. Le produit de référence utilisé dans cette étude est l’albumine sérique bovine à 100 mg/ml.

Protocole : Des disques de collagène de 8 mm de diamètre ont été imbibés avec 40 µl d’eau ultra pure (contrôle), du produit de référence, ou de concentrations croissantes de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention : 0.05 ; 0.1 et 0.5% (v/v). L’hydrolysat peptidique peregrina a été solubilisé directement dans l’eau ultra pure. Des clichés numériques de chacun des disques ont été réalisés à l’aide d’un scanner, avant et 30 minutes après imbibition. La mesure de la surface des disques de collagène a été réalisée sur les clichés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les résultats de l’effet tenseur sont donnés ci-dessous.

	Reduction Versus Contrôle (%)
Hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention	0.5%	51.1
	0.1%	38.4
	0.05%	ns

Conclusion : L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention montre un effet tenseur très significatif à faible concentration (moins de 1%). Ces résultats permettent de démontrer un effet « liftant » et par conséquent un effet antivieillissement à court terme.

Les exemple 2 à 5 permettent de démontrer que l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention a le profil d’un bon actif antivieillissement, à court ou long terme.

Exemple 6 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pour inhiber l’action de l‘endothéline 1
Il a été rapporté ces dernières années que l'endothéline favorise une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium dans les mélanocytes épidermiques (cellules de mélanine) pour faciliter la croissance cellulaire à travers le système de transduction du signal intracellulaire. Cette action améliore l'activité de la tyrosinase qui est une enzyme déterminant la vitesse dans la synthèse de mélanine (Kadono, S.et al., 2001, The Role of the Epidermal Endothelin Cascade in the Hyperpigmentation Mechanism of Lentigo Senilis,Journal of Investigative Dermatology, 116(4): 571-577). Il a également été rapporté (KawaharaN.et al., 2005, About the Component of Snow Tea, Collection of Pharmaceutical, Society of Japan annual convention Subject matter, abstract 30-0823, p. 159) que l'endothéline est un facteur d'activation des mélanocytes produit par les kératinocytes épidermiques, ainsi qu'un facteur important dans la pigmentation induite par la lumière ultraviolette ou la tache sombre sénile (Aoki, H., 2008, Recent Melanin Pigment Research,Fragrance JournalN° 338, vol. 36(9) : 14). Ces actions biologiques de l'endothéline suggèrent que des matériaux capables de supprimer l'action de l'endothéline peuvent être utiles pour réduire ou empêcher la production de mélanine ou la pigmentation.

L'endothéline est le vaso-constricteur le plus puissant connu dans le corps humain. D'un autre côté, la diminution de l'endothéline est également connue pour créer un effet vasodilatateur (Hi r ata, Y.et al., 1988, Cellular mechanism of action by a novel vasoconstrictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells,Biochemical and Biophysical Research Communications, 154(3) : 868-875 ;ShalinkumarP.et al., 2008, H2S Mediates the Vasodilator Effect of Endothelin-1 in the Cerebral Circulation.American Journal of Physiology. Heart Circulatory Physiology, 315, p. 1759-1764).

L’objectif est de doser l’endothéline de type 1 dans les cellules endothéliales micro-vasculaires humaines après exposition pendant 24h à l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention.

Protocole : Les cellules endothéliales micro-vasculaires humaines ont été fournies par la société PELOBiotech et mise en culture dans les plaques 96 puits selon les procédures de production du fournisseur. Il s'agit de laisser agir les extraits à différentes concentrations sur les cellules endothéliales à 80% de confluence pendant 24 heures, puis de quantifier l’endothéline 1 à l’aide du kit ELISA PicoKine (EDN1) dans les surnageants cellulaires. Un test de viabilité au préalable est réalisé pour définir les doses non-toxiques à utiliser lors de dosage de l’endothéline 1. Le contrôle négatif est réalisé à l'aide des cellules en milieu de culture sans traitement. Le contrôle positif dans le test de viabilité est le SDS à 0,5%. Toutes les conditions sont préparées dans des milieux de culture, et les cellules sont ensuite incubées à 36.5°C / 5% CO2 pendant 24 heures.
a) Application des solutions à tester sur les cellules endothéliales :
Les produits à tester sont mis en contact avec les cellules endothéliales en sub-confluence dans les plaques 96 puits. Pour chaque concentration le test est réalisé sur 3 puits. Les plaques sont incubées pendant 24 heures ± 1 heure à 36.5°C / 5% CO2.
b) Test de viabilité :
La viabilité cellulaire est évaluée par la méthode MTT sur les cellules après incubation avec les produits. Après 24 heures d'incubation, les surnageants sont récupérés et conservés à -20°C pour les dosages. Les puits sont ensuite rincés 1 fois avec 200 μL de PBS. Dans chaque puits 50 μL de solution de MTT à 0,5 mg/ml sont ajoutés : incubation pendant 3 heures à 36.5°C / 5% CO2. Dans chaque puits 100 μL d'isopropanol sont ajoutés. Après homogénéisation, une lecture de l'absorbance est réalisée à 550 nm. Pour chaque condition, le rapport de la moyenne des densités optiques des cellules sur la moyenne des densités optiques des contrôles négatifs déterminera le taux de viabilité.
c) Dosage de l’endothéline 1 :
Le dosage est réalisé à l’aide du kit ELISA. Les résultats de l’inhibition de l’action de l’endothéline sont donnés ci-dessous.

	Extrait concentration	Croissance cellulaire versus contrôle (%)	Endothelin 1 versus contrôle (%)	Endothelin 1 versus contrôle (pg/ml)
Extrait peregrina selon l’invention	2%	+8.46	-34.90	-47.09
	1%	1.54	-13.03	-17.58
	0.10%	-1.15	-12.44	-16.79

Conclusion : Le test de viabilité réalisé à la fin de traitement n’a pas montré d’effet toxique pour les concentrations testées.
Le dosage de l’endothéline 1 est réalisé dans les surnageants cellulaires à des concentrations non toxiques. La quantité de l’endothéline 1 pour chaque condition est dosée à l'aide du kit ELISA.
Pour les cellules du contrôle négatif, les valeurs sont de l'ordre de 134.94 pg/ml. Pour les cellules traitées avec différentes concentrations d’extraits, les valeurs sont de 87.85 pg/ml (avec 2% de l’extrait selon l’invention) à 118.15 pg/ml (avec 0.1% de l’extrait selon l’invention), ce qui montre des inhibitions très significatives dès 0.1% de l’extrait selon l’invention avec environ 12.44% d’inhibition de production d’endothéline de type 1 et jusque 34.90% d’inhibition avec 2% de l’extrait selon l’invention.
Les résultats sur l’endothéline et son inhibition dose-dépendante spécifique démontrent que l’hydrolysat peptidique selon l’invention est un puissant éclaircissant de la peau.

Exemple 7 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pour libérer les acides gras libres.

La lipolyse dans les adipocytes, ou l'hydrolyse du triacylglycérol (TAG) pour libérer les acides gras et le glycérol pour une utilisation par d'autres organes, est une fonction unique du tissu adipeux blanc. La lipolyse dans les adipocytes se produit à la surface des gouttelettes lipidiques cytosoliques, qui ont récemment attiré beaucoup d'attention en tant qu'organites dynamiques, partie intégrante du métabolisme lipidique. L'identification récente de l'AdPLA en tant que principale phospholipase adipeuse A(2) a conduit à la découverte d'une régulation autocrine/paracrine dominante de la lipolyse par la PGE (2). Les mécanismes ci-dessus sont des acteurs clés de la lipolyse et de sa régulation. Des découvertes récentes relient la lipolyse aux altérations ou mutations génétiques et prévoient l'activation de la lipolyse dans les adipocytes comme cible thérapeutique potentielle (A hmadja nM. et al., 2010, Lipolysis in Adipocytes, The InternationalJournal of Biochemistry and Cell Biology, 42(5): 555-559).

L’objectif de l’étude est d'évaluer la capacité de l’hydrolysat peptidique selon l’invention à augmenter la libération de glycérol dans la culture de cellules humaines (adipocytes). La teneur en glycérol est corrélée à la lipolyse. L'augmentation de la teneur en glycérol implique un effet de lipolyse. L'effet amincissant cosmétique est associé à l'effet lipolyse.

Protocole : Les adipocytes humains sont mis en culture dans les plaques 24 et 12 puits selon les procédures internes. Il s'agit de laisser agir les échantillons à des concentrations définies sur les adipocytes à confluence pendant 24 heures. Un test préalable de viabilité au MTT après 24 heures permet d’évaluer la cytotoxicité et de choisir les concentrations pour le test « effet lipolytique ». Cet « effet lipolytique » est évalué par le dosage du glycérol dans les surnageants après 24 heures d’exposition aux échantillons.

Le contrôle négatif est réalisé à l'aide des cellules en milieu de culture sans traitement. Le contrôle positif pour le test de viabilité est le SDS à 0.5%. Le contrôle positif pour le test « effet lipolytique » est la caféine à 0.05%. Toutes les conditions sont préparées dans des milieux de culture, et les cellules sont ensuite incubées à 36.5°C / 5% CO2 pendant 24 ± 1 heure.

Application des solutions à tester sur les adipocytes :

Les produits à tester sont mis en contact avec les adipocytes en confluence dans les plaques 24 puits (test de cytotoxicité) et 12 puits (test « effet lipolytique »).
Pour chaque concentration, le test est réalisé sur 3 puits.
Les plaques sont incubées pendant 24 ± 1 heures à 36.5°C / 5% CO2.

Test de viabilité :

La viabilité cellulaire est évaluée par la méthode MTT sur les cellules après 24 heures d’incubation avec les produits.
Après 24 heures d'incubation, les puits prévus sont rincés 1 fois avec 200µL de PBS.
Dans chaque puits 300 µl de solution de MTT à 0,5 mg/ml sont ajoutés : incubation pendant 3 heures à 36.5°C / 5% CO2.
Dans chaque puits 800 µl d'isopropanol sont ajoutés.
Après homogénéisation, une lecture de l'absorbance est réalisée à 550 nm.
Pour chaque condition, le rapport de la moyenne des densités optiques des cellules sur la moyenne des densités optiques des contrôles négatifs déterminera le taux de viabilité.
Une valeur seuil de viabilité à 70 % par rapport à la valeur du contrôle négatif est utilisée pour classifier les substances testées comme cytotoxiques ou non cytotoxiques.

Test « effet lipolytique » :

L’effet lipolytique est évalué par le dosage de glycérol dans les milieux de culture après 24 ± 1 heures d’incubation avec les produits.
Les milieux de cultures sont mélangés avec le « free glycerol reagent » selon le protocole du fournisseur.
La solution de glycérol est utilisée pour faire la gamme étalon à des concentrations de 0 à 6250 µM.
La lecture de DO est réalisée à 550nm. Les résultats de la libération des acides gras libres sont donnés ci-dessous.

	Concen-tration	Croissance cellulaire versus contrôle (Caféine, %)	I Augmentation de la production de glycérol versus contrôle (%)	Production de glycérol Production (µM)
Hydrolysat peptidique peregrina	2%	-6.16	+40.00	8.32
	0.5%	-7	+3.00	0.63
	0.10%	+9.03	NS	0

Conclusion : L’hydrolysat peptidique selon l’invention a montré qu'il favorisait la libération de glycérol des adipocytes humaines et induisait de ce fait un effet amincissant.

Exemple 8 : Effet de l’ extrait peregrina selon l’invention pour stimuler la protéine ZAG

L'alpha-2-glycoprotéine de zinc (ZAG) est une glycoprotéine plasmatique qui tire son nom de sa mobilité électrophorétique et de sa capacité à être précipité par les sels de Zn. Le ZAG fait partie de la superfamille des gènes d'immunoglobulines et possède une structure tridimensionnelle hautement homologue aux molécules du CMH de classe I et II. ZAG a été détecté immunohistochimiquement dans les cellules épithéliales sécrétoires normales du sein, de la prostate et du foie, dans les glandes salivaires, bronchiques, gastro-intestinales et sudoripares et dans les épithéliums stratifiés normaux, y compris l'épiderme. L'ARNm de ZAG reste uniformément distribué dans différents types de cellules [Za7]. Du fait de sa production par l'épithélium sécrétoire, le ZAG est présent dans la plupart des sécrétions corporelles et constitue respectivement 2.5% des protéines de la salive et 30% des fluides séminaux.

Les fonctions standard de ZAG ne sont pas claires. Cependant, le ZAG a été isolé de l'urine de patients cancéreux humains atteints de cachexie et peut fonctionner comme un facteur de mobilisation des lipides. Le ZAG purifié extrait du sérum humain ou de souris, ou extrait de l'urine humaine chez les patients cancéreux, induit une lipolyse, entraînant la libération de glycérol. Ce dernier augmente également l'utilisation des lipides dans les adipocytes humains et souris (Hi r aiK.et a l ., 1998, Biological Evaluation of a Lipid-Mobilizing Factor Isolated from the Urine of Cancer Patients,C a n c e r R e search, 58(11) : 2359-2365). Le ZAG active une activité d'adénylate cyclase dépendante du GTP sur les membranes des adipocytes, augmentant les niveaux d'AMPc cellulaire. Cela peut potentiellement conduire à l'activation de multiples voies cellulaires.

Pour approfondir les propriétés biologiques de ZAG, des transfectants stables du ZAG humain recombinant (rh) ont été créés dans la lignée cellulaire de mélanome murin B16F10. L'effet de la transfection de ZAG sur la production de mélanine a été déterminéin vitroetin vivo. Enfin, l'effet de ZAG sur l'expression et l'activité de la tyrosinase a été déterminé. Dans l'ensemble, ces études montrent que le ZAG inhibe la production de mélanine dans les mélanocytes normaux et malins. Les mécanismes comprennent des effets post-transcriptionnels sur la protéine tyrosinase, avec le potentiel d'effets indirects supplémentaires. Ces études ont permis d'identifier une fonction biologique du ZAG jusque-là inconnue et ont rendu possible une méthode de modulation de la production de mélanine, empêchant et/ou diminuant ainsi la pigmentation de la peau et des cheveux due à l'augmentation de la production de mélanine (HaleL., Method of Modulating Melanin Production, United States Patent No. US7,803,750 B2, 2010) et (GhadaF. M.et a l ., 2015, Highlights in Pathogenesis of Vitiligo,World Journal of C linical C ases3(3): 221-230).

L’objectif de cette étude est d’évaluer la capacité de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention à augmenter la libération de glycérol dans la culture de cellules humaines (adipocytes). La teneur en glycérol est corrélée à la lipolyse. L'augmentation de la teneur en glycérol implique un effet de lipolyse. L'effet amincissant cosmétique est associé à l'effet lipolyse.

Protocole : Les kératinocytes humains normaux sont isolés à partir de prépuces et mis en culture dans les plaques 24 et 96 puits selon les procédures internes.

Il s'agit de laisser agir les échantillons à des concentrations définies sur les kératinocytes à 80% de confluence pendant 48 heures, puis de quantifier les ZAG à l’aide du kit ELISA dans les surnageants cellulaires.

Un test préalable de viabilité est réalisé pour définir les doses non-toxiques à utiliser lors de dosage des ZAG.

Le contrôle négatif est réalisé à l'aide des cellules en milieu de culture sans traitement.

Le contrôle positif pour le test de viabilité est le SDS à 0.5%.

Toutes les conditions sont préparées dans des milieux de culture, et les cellules sont ensuite incubées à 36.5°C / 5% CO2 pendant 24 heures pour le test de viabilité et 48 heures pour le dosage des ZAG.

Application des solutions à tester sur les kératinocytes :

Les produits à tester sont mis en contact avec les kératinocytes en sub-confluence dans les plaques 24 et 96 puits.
Pour chaque concentration, le test est réalisé sur 3 puits.
Les plaques sont incubées pendant 24 heures et 48 heures à 36.5°C / 5% CO2.

Test de viabilité :

La viabilité cellulaire est évaluée par la méthode MTT sur les cellules après incubation avec les produits.
Après 24 et 48 heures d'incubation, les puits prévus sont rincés 1 fois avec 200µL de PBS.
Dans chaque puits 50 µl de solution de MTT à 0,5 mg/ml sont ajoutés : incubation pendant 3 heures à 36.5°C / 5% CO2.
Dans chaque puits 100 µl d'isopropanol sont ajoutés.
Après homogénéisation, une lecture de l'absorbance est réalisée à 550 nm.
Pour chaque condition, le rapport de la moyenne des densités optiques des cellules sur la moyenne des densités optiques des contrôles négatifs déterminera le taux de viabilité.

Dosage des protéines ZAG :

Après 48 heures d’incubation, tous les surnageants sont récupérés et conservés à -20°C pour les dosages.
Le dosage est réalisé à l’aide d’un kit ELISA. Les résultats du dosage de ZAG sont donnés ci-dessous.

	Con-centration	Croissance cellulaire versus contrôle (%)	ZAG versus contrôle (%)	ZAG versus contrôle (ng/ml)
Hydrolysat peptidique peregrina	2%	-17.88	+337.80	0.390
	1%	-12.54	+195.73	0.157
	0.10%	-3.88	+151.83	0.085

Conclusion : L’hydolysat peptidique peregrina peut augmenter de manière significative la production de ZAG, avec une bonne dépendance à la dose et une faible toxicité sur les cellules humaines. Il a de ce fait un effet blanchissant, un effet amincissant, un effet anti-fibrotique et un effet apaisant basé sur sa capacité à augmenter significativement la ZAG.

Exemple 9 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pour inhiber la production de mélanine

La pigmentation de la peau est un processus complexe qui, dans l'épiderme comme dans les follicules pileux, commence par la synthèse de mélanine dans les mélanosomes à l'intérieur des mélanocytes, suivie du transfert des mélanosomes aux kératinocytes environnants, qui à leur tour transportent le pigment et éventuellement le dégrade. Chez l'homme, toute la population mélanocytaire est localisée dans les follicules pileux et dans la couche basale de l'épiderme. Quelle que soit leur localisation dans la peau, les mélanocytes ont une origine embryologique commune, la crête neurale dont ils dérivent sous forme de mélanoblastes (cellules non pigmentées). Il existe deux types de mélanine dans les cellules épidermiques, l'eumélanine, un pigment brun-noir, et la phéomélanine, un pigment jaune-rouge. Dans les mélanocytes, les eumélanosomes et les phéomélanosomes coexistent. La tyrosinase est l'enzyme clé qui régule les premières étapes de la synthèse de la phéomélanine et de l'eumélanine: la conversion de la L-tyrosine en L-3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA) et l'oxydation de ce composé en dopaquinone. À partir de la dopaquinone, les voies de synthèse diffèrent pour l'eumélanine et la phéomélanine. Le rôle principal de la mélanine est de protéger la peau des effets nocifs des rayons UV, empêchant ainsi le développement d'un cancer de la peau (BrennerM. et al., 2008, The Protective Role of Melanin Against UV damage in human skin,Photochemistry and Photobiology84(3): 539-549).

L’objectif est de regrouper l'ensemble des données utilisées, ainsi que les résultats obtenus, pour la réalisation du test de modulation de la mélanine sur les mélanocytes humains après exposition pendant 5 jours à l’extrait peregrina selon l’invention.
Protocole : Les mélanocytes humains sont mis en culture dans les plaques 96 et 24 puits.
Il s'agit de laisser agir l’extrait peregrina selon l’invention à des concentrations de 5%; 2% ; 1% et 0.1% sur les mélanocytes à confluence pendant 5 jours. Un pré-test de viabilité au MTT après 24 heures permet d’évaluer la cytotoxicité et de choisir les concentrations pour le test de modulation de la mélanine. Cette modulation est évaluée par le dosage de la mélanine dans les lysats cellulaires après 5 jours d’exposition aux extraits. Le contrôle négatif est réalisé à l'aide des cellules en milieu de culture sans traitement. Le contrôle positif pour le test de viabilité est le SDS à 0.5%. Pour le test de la modulation de la mélanine des milieux avec et sans α–MSH sont utilisés comme contrôles négatifs.
Toutes les conditions sont préparées dans des milieux de culture, et les cellules sont ensuite incubées à 36.5°C / 5% CO2 pendant 24 heures pour le test de cytotoxicité et 5 jours pour le dosage de mélanine.
a) Application des solutions à tester sur les mélanocytes : Les concentrations à tester sont mises en contact avec les mélanocytes en confluence dans les plaques 96 (test de cytotoxicité) et 24 (dosage de mélanine) puits. Pour chaque concentration le test est réalisé sur 3 puits. Les plaques sont incubées pendant 24 ± 1 heures et 5 jours à 36.5°C / 5% CO2.
b) Test de viabilité : La viabilité cellulaire est évaluée par la méthode MTT sur les cellules après 24 heures d’incubation avec les produits. Après 24 heures d'incubation, les puits prévus sont rincés 1 fois avec 200 μL de PBS. Dans chaque puits 50 μl de solution de MTT à 0.5 mg/ml sont ajoutés et l’incubation est effectuée pendant 3 heures à 36.5°C / 5% CO2. Dans chaque puits 150 μl d'isopropanol sont ajoutés. Après homogénéisation, une lecture de l'absorbance est réalisée à 550 nm. Pour chaque condition, le rapport de la moyenne des densités optiques des cellules sur la moyenne des densités optiques des contrôles négatifs déterminera le taux de viabilité.
Une valeur seuil de viabilité à 70 % par rapport à la valeur du contrôle négatif est utilisée pour classifier les substances testées comme cytotoxiques ou non cytotoxiques. Une classification « non cytotoxique » est donnée sur les résultatsin vitropour une viabilité > 70% et une classification « cytotoxique » pour une viabilité ≤ 70%.
La concentration à 5% de l’extrait selon l’invention s’est montrée cytotoxique à 5% dans les conditions du test. Les concentrations 2%, 1% et 0.1% sont donc utilisées pour le test de modulation de la mélanine. La quantité de mélanine présente dans les cellules est dosée après la lyse cellulaire. Les résultats de l’inhibition de la production de mélanine sont donnés ci-dessous.

	Extrait concentration	Croissance cellulaire versus contrôle (%)	Inhibition Mélanine versus contrôle (%)	Contenu en Mélanine (µg/ml)
Hydrolysat peptidique selon l’invention	2%	-24.48	+16.50	152
	1,0%	-17.15	+55.00	82
	0.10%	-18.06	+71.40	52

Conclusion : L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention inhibe la production de mélaninein celluloce qui lui confère une propriété blanchissante de la peau.

Exemple 10 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention sur la modulation du dosage de DKK1 et DKK3

L'implication des interactions entre les mélanocytes et les fibroblastes dans la régulation de la mélanogenèse est bien connue et a été étudiée de manière intensive. Bien que ces interactions ne soient pas encore parfaitement comprises, elles sont à l'origine de la "blancheur" des zones palmo-plantaires et sont désormais utilisées en cosmétique pour le développement de produits dépigmentants Yamaguchi et collègues (Yamagu c hiY.e t a l., 2004, Mesenchymal-Epithelial Interactions in the Skin: Increased Expression of Dickkopf by Palmoplantar Fibroblasts Inhibits Melanocyte Growth and Differentiation,Journal of C e ll B io l ogy165(2): 275-285) ont démontré qu'un messager soluble produit par les fibroblastes des régions palmo-plantaires, était capable de modifier le programme de différenciation des mélanocytes de ces régions, conduisant à une diminution de la production de mélanine. Ce messager a été identifié par l'équipe comme une protéine nommée Dikkopf-1 (DKK-1).

Les voies de signalisation utilisées par DKK-1 pour produire ces résultats sont bien identifiées aujourd'hui. Grâce à son action antagoniste sur le récepteur Wnt, DKK-1 est en effet capable de "shunter" les voies de signalisation intracellulaires activées par la β-caténine, généralement responsables de la régulation des gènes impliqués dans la mélanogenèse. Yamaguchi et collègues ont également démontré que DKK-3, une molécule comme DKK-1, mais sans effet sur le récepteur Wnt, pourrait jouer un rôle régulateur sur l'effet de DKK-1. En fait, plus la quantité de DKK-3 au voisinage de ce récepteur à Wnt, plus les interactions entre DKK-1 et ce récepteur sont faibles. L'augmentation de DKK3 réduit les effets inhibiteurs de DKK-1 sur la mélanogenèse. Les travaux de Yamaguchi et collègues (cf. supra) suggèrent que l'identification d'agents ayant une influence sur le rapport DKK1 / DKK3 dans des cultures de fibroblastes dermiques humains normaux d'origine non palmo-plantaire permettrait de contrôler la production de mélanine à partir de mélanocytes humains normaux non palmo-plantaires

L’objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du composé dénommé « Hydrolysat peptidique peregrina » sur la synthèse et la libération de DKK-1 dans un modèle composé de fibroblastes humains normaux en culture monocouche.

Protocole : Les cellules de fibroblastes humains sont obtenues auprès d'un donneur âgé de 68 ans. Pour réaliser les expériences, les fibroblastes sont cultivés en monocouche jusqu'à atteindre la confluence. La dexaméthasone à 100 nm a été utilisée comme inducteur de référence de la synthèse et de la libération de DKK-1.
Les disques cutanés ont été incubés pendant 48 heures en absence (contrôle) ou en présence de produit de référence ou de produit à tester : « Hydrolysat peptidique peregrina » : 0.01; 0.1 et 0.5% (v/v).

À la fin de l'incubation, les milieux d'incubation ont été retirés pour effectuer la mesure de libération de DKK-1.
Le composé d'essai « Hydrolysat peptidique pérégrina » a été dilué directement dans le milieu d'incubation afin d'atteindre les différentes concentrations décrites ci-dessus.
À la fin de la période d'incubation de 48 heures, le DKK-1 libéré dans les milieux d'incubation a été quantifié à l'aide d'un kit ELISA sensible et spécifique.
À la fin de la période d'incubation, les protéines contenues dans les lysats cellulaires ont été quantifiées à l'aide d'une méthode spectro-colorimétrique (méthode Bradford).
Les résultats sont exprimés en ng de DKK-1 par mg de protéines (moyenne ± S.D.).
Le niveau de signification entre le « contrôle » et le « produit de référence » a été évalué à l'aide d'un test de Student (*: p <0.05).
Le niveau de signification entre le « contrôle » et le « produit d'essai » a été évalué par une analyse de variance à un facteur (ANOVA unidirectionnelle) suivie d'un test de Holm-Sidak (*: p <0.05).

Dans nos conditions expérimentales, le produit de référence nommé « Dexamethasone », testé à 100 nm, a significativement augmenté le DKK-1 libéré de 181.8% (p <0.01) par rapport à « Contrôle ». Les résultats sur la modulation du dosage de DKK1 sont donnés ci-dessous.

	Concentration	Croissance cellulaire versus contrôle (%)	DKK1 versus contrôle (%)
Hydrolysat peptidique peregrina	0.5%	+1.9	+131.50
	0.1%	ca. 0	+32.30
	0.05%	-0.6	+26.10

Etude sur DKK3
Le but de cette étude est d'évaluer l'effet de composés appelés « Hydrolysat peptidique peregrina » sur la synthèse et la libération de DKK-3 dans un modèle composé de fibroblastes humains normaux en culture monocouche.
Les cellules de fibroblastes humains ont été obtenues auprès d'un donneur âgé de 68 ans.
Pour réaliser les expériences, les fibroblastes ont été cultivés en monocouche jusqu'à atteindre la confluence.
Les cellules de fibroblastes humains ont été obtenues d'un donneur de 68 ans.
Pour réaliser les expériences, les fibroblastes ont été cultivés en monocouche jusqu'à atteindre la confluence.
À la fin de la période d'incubation de 48 heures, le DKK-3 libéré dans les milieux d'incubation a été quantifié à l'aide d'un kit ELISA sensible et spécifique.
À la fin de la période d'incubation, les protéines contenues dans les lysats cellulaires ont été quantifiées à l'aide d'une méthode spectro-colorimétrique (méthode Bradford).
Les résultats sont exprimés en ng de DKK-3 par mg de protéines (moyenne ± S.D.).
Le niveau de signification entre le « contrôle » et le « produit de référence » a été évalué à l'aide d'un test de Student (*: p <0.05).
Le niveau de signification entre le « contrôle » et le « produit d'essai » a été évalué par une analyse de variance à un facteur (ANOVA unidirectionnelle) suivie d'un test de Holm-Sidak (*: p <0.05). Les résultats sur la modulation du dosage de DKK3 sont donnés ci-dessous.

	Concentration	Croissance cellulaire versus contrôle (%)	DKK3 versus contrôle (%)
Hydrolysat peptidique peregrina	0.5%	101.9	-20.7
	0.1%	env. 100	-8
	0.05%	99.4	-3.9

Conclusion : L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention peut augmenter considérablement la production de DKK1 dans les cellules humaines. Il a une forte capacité à diminuer la pigmentation de la peau grâce au principe d'inhibition palmo-plantaire, dans sa capacité à augmenter considérablement DKK1 et diminuer significativement DKK3, ce qui augmente le ratio DKK1/DKK3.

Exemple 11 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pour préserver l’ADN

La dynamique de la longueur des télomères est très importante pour la régulation de la durée de vie réplicative dans les cellules, en particulier chez les espèces à longue durée de vie. Le raccourcissement des télomères et l'activité de la télomérase sont des facteurs importants dans le vieillissement et la tumorigenèse (Sh a y, J. W., 2005, Senescence an Immortalization: Role of Telomeres and Telomerase,C a r c inog e n e sis26(5) : 867-874). Les télomères sont des séquences nucléotidiques complexes qui recouvrent l'extrémité des chromosomes de la dégradation, de la fusion-recombinaison indésirable, de l'activation inappropriée de la réponse aux dommages de l'ADN. Ils jouent également un rôle essentiel dans la division cellulaire et la stabilité des chromosomes. Il existe de plus en plus de preuves que la stabilité des télomères peut être affectée par l'exposition professionnelle et environnementale, car certains de ces facteurs ont été associés à une augmentation de l'inflammation, du stress oxydatif, des dommages à l'ADN, de l'aberration chromosomique et des altérations épigénétiques. Les télomères extrêmement courts et longs ont été associés à des maladies neurodégénératives, cardiovasculaires (MCV) et au risque de cancer.

La télomérase est une ribonucléoprotéine qui catalyse l'addition de répétitions télomériques aux extrémités des télomères. Les télomères sont de longs tronçons de séquences répétées qui coiffent les extrémités des chromosomes et sont censés stabiliser le chromosome. Chez l'homme, les télomères ont généralement une longueur de 7 à 10 kb et comprennent plusieurs répétitions de la séquence -TTAGGG-.

La télomérase n'est pas exprimée dans la plupart des cellules adultes et la longueur des télomères diminue avec les cycles de réplication successifs. Après un certain nombre de cycles de réplication, le raccourcissement progressif des télomères fait entrer les cellules dans une phase de crise télomérique, qui à son tour conduit à la sénescence cellulaire. Certaines maladies sont associées à une perte télomérique rapide, entraînant une sénescence cellulaire prématurée. Il a été démontré que l'expression du gène codant pour la protéine de télomérase humaine dans les cellules humaines (B las c oM., 2007, Telomere Length, Stem Cells and Aging,Nat u r e C h e mic a l B io l ogy3, p. 640-649) confère un phénotype immortel, probablement en contournant la voie de sénescence naturelle des cellules. De plus, il a été démontré que l'expression du gène de la télomérase dans les cellules vieillissantes avec de courts télomères produit une augmentation de la longueur des télomères et restaure un phénotype généralement associé aux cellules plus jeunes.

L’objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du composé dénommé « Hydrolysat peptidique peregrina » sur le raccourcissement des télomères dans un modèle composé de fibroblastes humains normaux en culture monocouche. Il est bien connu que le télomère correspond à une horloge biologique. La longueur des télomères diminue progressivement avec les divisions cellulaires, entraînant finalement une incapacité de réplication de la cellule. La mesure de la longueur des télomères a été effectuée en utilisant la PCR quantitative et en comparaison avec la longueur des télomères entre les cellules aux passages 2 et 5.

Protocole : Des cellules de fibroblastes humains ont été obtenues auprès d'un donneur de 44 ans. Pour effectuer les expériences, des cellules ont été utilisées au passage 2 et 5. Les fibroblastes ont été cultivés pendant 3 passages consécutifs en absence (contrôle) ou en présence d'une concentration croissante à tester de l’hydrolysat peptidique peregrina: 0.01; 0.1 et 0.5% (v/v).

Préparation du composé d'essai : Le composé d'essai « Hydrolysat peptidique peregrina » a été dilué directement dans le milieu d'incubation afin d'atteindre les différentes concentrations décrites ci-dessus.

A la fin de l'incubation, les cellules ont été trypsinisées. L'ADN a été extrait des cellules à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN dédié. L'ADN a été quantifié par nanodrop.

La longueur des télomères a été mesurée par PCR quantitative (q-PCR). Pour chaque échantillon, la variation de la longueur des télomères a été mesurée par quantification relative en utilisant le gène SCR (référence à copie unique) comme gène de référence. Pour chaque échantillon, une q-PCR est effectuée en utilisant un jeu d'amorces de télomères qui reconnaît et amplifie les séquences de télomères et une seconde q-PCR est effectuée en utilisant le jeu d'amorces SCR qui reconnaît et amplifie une région de 100 pb sur le chromosome 17 humain et sert de référence pour la normalisation des données.

Les résultats sont exprimés en unités relatives correspondant à la longueur des télomères par rapport aux cellules au passage 2 (moyenne ± S.D.). Le niveau de signification entre « contrôle » aux passages 2 et 5 a été évalué à l'aide d'un test de Student t ($: p <0,05). Le niveau de signification entre « contrôle » et « composé d'essai » a été évalué indépendamment pour chaque produit par une analyse de variance à un facteur (ANOVA unidirectionnelle) suivie d'un test Holm-Sidak (*: p <0,05).

Résultats : Dans nos conditions expérimentales, l’hydrolysat peptidique peregrina testé à 0.05%, 0.1% et 0.5% (v / v), a significativement diminué le raccourcissement des télomères des fibroblastes humains normaux.

Raccourcissement des télomères : inhibition (en comparaison avec le contrôle) à 0.05% (v / v) + 8.9% (p <0.05) et à 0.1% (v / v) + 15.1% (p <0.01) et à 0.5% (v / v) + 16.6% (p <0.01).

	Concentration	Croissance cellulaire versus contrôle (%)	Longueur des télomères versus contrôle (%)
Hydrolat peptidique peregrina	0.5%	+1.9	+16.60
	0.1%	ca. 0	+15.10
	0.05%	-0.6	+8.90

Conclusion : Dans un contexte de multiplication ou de division normale des cellules humaines, l’hydrolysat peptidiqueperegrinaselon l’invention démontre une capacité à augmenter considérablement la longueur des télomères. Les télomères sont des bouchons impliqués dans la protection du matériel ADN ; l'augmentation de la taille des télomères préserve l'intégrité du matériel ADN au fil du temps. L'augmentation de la longueur des télomères est corrélée à la capacité de préserver le matériel d'ADN. L’hydrolysat peptidiqueperegrinapeut augmenter la longueur des télomères. Cet hydrolysat est donc impliqué dans la préservation du matériel génétique humain (ADN).

Exemple 12 : Tests comparatifs de différents produit s sur l’hydratation à la surface de la peau

L’étude en cornéométrie permet la mesure de l’effet hydratant d’un produit à la surface de la peau. L’appareil utilisé est un cornéomètre doté d’une sonde mesurant notamment l’humidité de la peau par impédancemétrie. Un Panel composé de 6 personnes (2 hommes et 4 femmes) ont testé dans des condition similaires d’hydrométrie et de température sur les faces internes de leur avant-bras. La face interne de l’avant-bras gauche porte les zones 1 et 2, la face interne de l’avant-bras droit porte les zones 3 et 4.

La zone 1 correspond à la zone d’application du gel hydratant de référence ; la zone 2 correspond à la zone d’application du gel de référence + 2% de l’hydrolysat peptidique selon l’invention ; la zone 3 correspond à la zone d’application du gel de référence + 2% de l’hydrolysat peptidique avecMoringa oleifera; la zone 4 correspond à la zone d’application du gel de référence + 2% de Purisoft® selon brevet FR3076460 de de BASF Beauty Care Solutions.

La quantité de produit appliquée sur chaque zone est la même, et les temps de mesures sont les mêmes pour chacune des zones. Une première prise de valeur est faite avant application du produit sur chaque zone de sorte à connaître l’état zéro d’humidité de la peau. Ensuite, pour chaque zone et chaque produit, une première mesure est conduite 5 minutes après l’application du produit sur la zone, toujours par le même opérateur. Enfin une dernière mesure est conduite 30 minutes après la seconde mesure ci-dessus, toujours par le même opérateur.

La combinaison des différences observées avant et après application ne suit pas une loi normale étudiée en ANOVA (analyse la variance). La valeur obtenue par différence de la mesure avant et après est donc le paramètre étudié. Les résultats obtenus sont une tendance qualitative et non quantitative des valeurs obtenues :

Zone	Moyenne différences estimées
1 = référence (placebo)	1,286
2 = réf. + hydrolysat peptidique selon invention 2%	1,190
3 = Réf. + hydrolysat peptidique deM. oleifera2%	-0,214
4 = réf. + extrait Purisoft® BASF 2%	-0,667

Conclusion : La zone 2 présente une valeur d’hydratation positive pour la peau entre avant et après l’application du produit, tandis que les zones 3 et 4 présentent des valeurs négatives, c’est-à-dire que la peau est moins hydratée après qu’avant application des produits. L’hydrolysat peptidique selon l’invention permet de maintenir le bénéfice d’une hydratation dans un produit d’application topique ce qui distingue l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention des autres extraits testés. La représente les résultats obtenus.

Exemple 13 : Formulation d’un produit maquillant

Ingrédients	%
Eau	QSP
Caprylic / Capric triglyceride	19.0000
Gomme Acacia senegal	7.0000
Charcoal	6.0000
Glycerine	5.0000
Propanediol	5.0000
Bentonite	3.1500
Cetearyl glucoside	3.0000
Cetearyl alcohol	3.0000
Benzyl alcohol	1.0000
Hydrolysat peptidique peregrina selon invention	2.0000
Gomme Cellulose	0.8000
Gomme Xanthane	0.1750
Acide Citrique	0.1750

Exemple 14 : Formulation d’un produit lavant

Ingrédients	%
Eau	QSP
Sodium coco-sulfate	5,0000
Sodium cocoyl isethionate	4,0000
Bentonite	3,7800
Caprylic / Capric triglyceride	2,0000
Hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention	1,0000
Gluconolactone	0,7500
Sodium benzoate	0,5450
Parfum	0,5000
Gomme Xanthane	0,2700
Sodium stearoyl glutamate	0,2250
Acide Citrique	0,2250
Calcium gluconate	0,0050

Exemple 15 : formulation d’un produit de soin

Ingrédient	%
Eau	QSP
Caprylic / Capric triglyceride	18,0000
Bentonite	4,2000
Cetearyl alcohol	1,5000
Hydrolysat peptidique peregrina selon invention	2,0000
Gluconolactone	0,7500
Sodium benzoate	0,5450
Gomme Xanthane	0,5000
Parfum	0,5000
Sodium stearoyl glutamate	0,2500
Acide Citrique	0,2500
Calcium gluconate	0,0050

Exemple 16 : c omprimé relaxant ou amincissantde 1 g : 2% extrait sec selon l’invention (contenant 60% d’hydrolysat peptidique sur un support d’inuline) + 47% carbonate de calcium contenant 200 UI de vitamine D + 25% gluconate de magnésium + 23% inuline + 3% stéarate de magnésium).

Exemple 17 : P oudre amincissante en gélulede 750 mg contenant 200 mg de caféine, 200 mg d’extrait sec selon l’invention (contenant 60% d’hydrolysat peptidique sur un support d’inuline), 200 mg de chitosane et 150 mg de carbonate de calcium.)

Exemple 18 : P oudre coupe-faim & minceur en gélulede 750 mg contenant 200 mg de caféine, 200 mg d’extrait sec selon l’invention (contenant 60% d’hydrolysat peptidique sur un support d’inuline), 200 mg de chitosane et 150 mg de Konjac (glucomannane).

Exemple 19 : S pray relaxant sublingualcontenant 2% d’extrait selon l’exemple 1, 1% teinture mère deRhodiola, 1% Teinture mère de Mélisse, 1% teinture mère de Valériane, 1% teinture mère d’Aubépine, 2% d’extrait de prêle, 0.15% d’acide salycilique, 7% de sorbitol, et QSP en eau).

Claims

Extrait du tourteau des graines deMoringa peregrinacaractérisé en ce qu’il comprend majoritairement un hydrolysat peptidique.
Extrait selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il est obtenu du tourteau des graines non décortiquées deMoringa peregrina.
Extrait selon la revendication 2 caractérisé en ce que l’hydrolysat peptidique comprend des dérivés d’acides aminés, des acides aminés, des peptides et glycopeptides dont le poids moléculaire est compris entre 100 Da et 6000 Da, préférentiellement entre 1500 Da et 5000 Da, préférentiellement encore entre 3000 et 4500 Da.
Extrait selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend également entre 0.3 % et 3 % de composés volatiles, dont 50% de ces composés soit entre 0.15% et 1.5% de l’extrait est constitué de composés nitrilés légers, avec principalement l’isobutyronitrile et le méthyl-butanenitrile ; dont 5 à 10% de ces composés soit entre 0.015 et 0.3% de l’extrait est constitué de dérivés d’isothiocyanates, avec principalement l’isothiocyanate d’isopropyle et l’isothiocyanate d’isobutyle ; dont 1 à 5% de ces composés soit entre 0.003 et 0.15 % est constituté d’huile essentielle, avec principalement de l’eucalyptol, du menthol et du benzaldéhyde.
Procédé d’obtention d’un extrait de tourteau des graines deMoringa peregrinaselon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes selon lesquelles :
a) on recueille les graines non décortiquées deMoringa peregrinaque l’on sèche pour obtenir un taux d’humidité interne inférieur à 8%,
b) on presse les graines séchées de sorte à séparer l’huile du reste de la graine de sorte à obtenir le tourteau comprenant moins de 6% en poids d’huile résiduelle,
c) on broie le tourteau obtenu à l’étape b),
d) on met en dispersion en phase aqueuse le tourteau broyé obtenu à l’étape c),
e) on réalise une protéolyse chimique et/ou enzymatique de la dispersion aqueuse obtenue à l’étape d) pendant une durée comprise entre 30 minutes et 4 heures,
f) on neutralise la protéolyse pour stabiliser l’hydrolysat peptidique obtenu,
g) on récupère l’hydrolysat peptidique par séparation solide/liquide,
h) on purifie l’hydrolysat peptidique par ultrafiltration, puis éventuellement,
i) on effectue une lyophilisation de l’hydrolysat peptidique obtenu à l’étape h).
Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu’on réalise une protéolyse chimique à l’étape e) par hydrolyse alcaline, à une température comprise entre 12 et 40°C et à pH supérieur à 13 pendant une durée d’environ 2 heures.
Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu’on réalise une protéolyse enzymatique à l’étape e) avec des protéases alcalines, à une température comprise entre 12 et 40°C et à pH inférieur à 9 pendant une durée d’environ 2 heures.
Procédé selon l’une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que la température est comprise entre 16 et 25°C.
Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séparation solide/liquide de l’étape g) est réalisée par différents procédés tels que centrifugation, essorage, filtration.
Procédé selon l’une des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que à l’étape h) l’ultrafiltration est effectuée avec un seuil de coupure compris entre 100 Da et 6000 Da et plus particulièrement entre 1500 Da et 5000 Da, et encore plus particulièrement entre 3000 Da et 4500 Da.
Composition cosmétique ou nutricosmétique, caractérisée en ce qu’elle comprend, à titre d’agent actif, une quantité efficace d’un extrait du tourteau des graines deMoringa peregrinaselon l’une des revendications 1 à 3, et un excipient physiologiquement acceptable.
Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce qu’elle est une composition cosmétique formulée pour être appliquée topiquement sur la peau et en ce que l’extrait de tourteau des graines deMoringa peregrinaest présent dans la composition à une concentration de 0.002 à 20% en poids par rapport au poids total de la composition, préférentiellement de 0.2 à 10%.
Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce qu’elle est une composition nutricosmétique formulée pour être ingérée et en ce que l’extrait de tourteau des graines deMoringa peregrinaest présent dans la composition à une concentration de 0.002 à 40% en poids par rapport au poids total de la composition, préférentiellement de 0.2 à 20%.
Utilisation cosmétique ou nutricosmétique d’une composition selon l’une des revendications 11 à 13, pour améliorer l’aspect de la peau, des muqueuses ou des phanères, prévenir et/ou lutter contre la sècheresse de la peau et des muqueuses, prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement et favoriser le blanchiment de la peau.
Utilisation cosmétique ou nutricosmétique d’une composition selon l’une des revendications 11 à 13, pour favoriser l’amincissement.