FR3065172A1 - Preparation cosmetique contenant un extrait de truffe blanche et procede cosmetique associe - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un extrait de truffe blanche (Tuber magnatum) pour une utilisation cosmétique sur la peau, l'extrait de truffe blanche pouvant être obtenu par le procédé, et une composition cosmétique comprenant ledit extrait. L'invention concerne un procédé de réduction des signes de vieillissement et d'éclaircissement de la peau.
Description
DOMAINE TECHNIQUE [1] La présente invention relève du domaine des produits cosmétiques et plus spécifiquement du domaine des soins cutanés. L’invention concerne un procédé de préparation d’un extrait de truffe blanche (Tuber magnatum) par extraction aqueuse, un extrait de truffe blanche pouvant être obtenu par le procédé et une composition cosmétique comprenant l’extrait de truffe blanche.
[2] L’invention concerne également un procédé de réduction et/ou de correction des signes du vieillissement et du photovieillissement de la peau, et d’éclaircissement de la peau.
[3] L’extrait de truffe blanche peut être utilisé seul ou en combinaison avec d’autres agents actifs.
CONTEXTE [4] La peau est un organe vital composé de plusieurs couches (derme, couches prolifératives et couche cornée) qui couvre la totalité de la surface du corps et assure des fonctions protectrices, sensitives, immunitaires, métaboliques ou thermorégulatrices. La peau, comme les autres organes, est sujette au vieillissement.
[5] Par exemple, l’apparence de la peau est modifiée par différents types d’agressions intérieures (maladie et modifications hormonales telles que la grossesse) ou extérieures (facteurs environnementaux, tels que la pollution, les rayons du soleil, les rayons ultraviolets, les pathogènes, etc.). Alors des rides et ridules, des imperfections d’hyperpigmentation ou d'hypopigmentation, une sécheresse voire une déshydratation de la peau, un amincissement de l’épiderme, une élastose, des imperfections, des tâches de vieillesse, etc., peuvent apparaître.
[6] Dans la peau, un vieillissement prématuré est observé, survenant dans les zones exposées aux rayons ultraviolets.
[7] Avec l’âge, l’apparence de la peau se modifie. Des tâches brunes, un teint terne, une perte d’uniformité du teint sont des effets remarquables associés à l’âge. La perte de l'éclat cutané de la jeunesse est souvent l'un des premiers signes extrinsèques du vieillissement et une exposition constante aux rayons UV du soleil peut également être responsable de l'apparence sèche et terne de la peau.
[8] On sait que les champignons constituent une vaste famille d'organismes vivants. Les fructifications de certains champignons sauvages et cultivables contiennent des composés médicaux qui sont utilisés dans les médicaments et produits cosmétiques classiques. Les champignons ont, au cours de leur évolution, développé différentes propriétés pour résister au stress environnemental, et il est connu que certains composés fongiques peuvent avoir un effet de modération des lésions causées par les circonstances de la vie et l'environnement naturel sur les organismes. Ainsi, la recherche de nouveaux composés bioactifs naturels d'origine fongique s'est intensifiée. Par exemple, le champignon Inonotus obliquus contient une enzyme telle que la superoxyde dismutase (SOD), qui est un élément clé dans la protection des cellules contre le RO S.
[9] De plus, les truffes sont connues pour être efficaces sur certaines affections par exemple pour améliorer l’immunité et l’hyperlipidémie. Le genre Tuber, un champignon souterrain, appartient à Ascomycota phylum. Le genre Tuber fungi comprend certaines espèces de truffes. Ces espèces de truffes sont des champignons hypogés qui établissent une symbiose ectomycorhizienne avec les arbres et les arbustes et forment une fructification.
[10] Certaines des espèces de truffes sont des aliments très prisés, en raison des caractéristiques aromatiques et du goût délicieux de leurs fructifications. On fait référence à ces espèces comme aux « truffes » ou « vraies truffes » et elles constituent des denrées précieuses et onéreuses largement utilisées dans les fameuses cuisines française et italienne.
[11] Les truffes communes, qui appartiennent à la classe des ascomycètes, ordre des Tubérales, sont appréciées comme d’excellents champignons comestibles depuis des siècles et ont une importance considérable en raison de leur arôme spécial. Les truffes sont des champignons souterrains se développant en symbiose avec les racines des chênes et formant des fructifications de type tubercule. Dans le procédé d’extraction des truffes, plusieurs agents actifs sont libérés. Il s’est avéré qu'une stimulation non spécifique du système immunitaire pouvait être permise.
[12] Dans la description de l’invention, le terme « truffe » fait référence aux espèces suivantes : les truffes blanches italiennes (nom scientifique : Tuber magnatum pico), la truffe noire (également connue comme les truffes du Périgord, provenant de France, nom scientifique : Tuber melanosporum), la truffe de Bourgogne (Tuber uncinatum), la truffe du
Kalahari (Terfeziapfeilii), la truffe du lion (Terfezia leonis), la truffe d’été (Tuber aestivum), la truffe d’hiver (Tuber hrumale), la truffe chinoise (Tuber sinensis ou Tuber indicum) et la truffe Bianchetto ou blanchette (Tuber borchii).
[13] La truffe blanche (Tuber magnatum) fait référence à la truffe du Piémont ou à la truffe d’Alba. Les truffes se développent à quelques centimètres au-dessous de la surface du sol, en symbiose avec les racines de feuillus tels que les chênes, les marronniers, les noisetiers et les charmes. Les petites sphères noueuses de forme irrégulière ont une taille d’environ 2,5 centimètres et peuvent peser jusqu’à 500 grammes (bien que les truffes de cette taille soient rares). La chair ferme d’une truffe blanche est d’une couleur crème pâle à marron clair, toute marbrée de blanc. Les truffes sont le fruit de la terre, plus rares et plus précieuses que tout autre racine, tubercule ou champignon comestibles. Il n’existe aucun goût similaire sur terre, expliquant peut-être pourquoi elles sont si souvent décrites comme divines.
[14] De nombreuses tentatives de domestication de ces truffes sauvages ont été faites, bien qu’elles puissent mettre une décennie à pousser. Certaines de ces tentatives ont connu la réussite, mais la source la plus fiable reste de creuser dans la nature pour les chercher.
[15] En se basant sur l’état de la technique, de nombreux produits cosmétiques sont connus qui, d’une certaine manière, contiennent des matières premières à base de plantes sous la forme d'huiles ou d'extraits. Dans la plupart des cas, les effets avantageux connus des plantes individuelles sont utilisés pour obtenir un effet global correspondant.
[16] L’utilisation d’extrait de truffe blanche dans une composition cosmétique est connue dans la technique antérieure. La plupart des extraits sont des extraits totaux ou des extraits eau-alcool. Par exemple, la demande de brevet chinois, CN-A-104856928 décrit un produit cosmétique antirides dans lequel la substance active est l’un d’un mélange A, d’un extrait (VEchinacea piupurea, et d’un extrait de truffe blanche, ou toute combinaison de ceux-ci, et ledit mélange A est un mélange de trifluoroacétyle tripeptide-2, de glycérol et de dextrane. Le brevet US accordé 6843995 décrit une préparation cosmétique comprenant au moins un extrait aqueux de truffes communes (Tubéracées) conjointement à du champagne séché par pulvérisation, dans lequel le complexe actif est fourni dans un gel cosmétique acceptable avec un stabilisant. Le brevet chinois CN-A-104666237 décrit un procédé de préparation utilisant un extrait hydroalcoolique et l'application du principe actif à base de truffe pour la préparation d’un antioxydant et d'un produit de blanchiment de la peau. Cependant, aucun document n’a décrit de procédé d’extraction à l’eau pour préparer un ingrédient cosmétique efficace et totalement sûr à partir de truffe blanche.
[17] En dépit des différents produits cosmétiques contre le vieillissement commercialisés pour le traitement de la peau, il reste un besoin pour des compositions cosmétiques efficaces d'application topique qui fournissent des avantages anti-âge ou réjuvénilisants à la peau, aux cheveux et/ou aux ongles utilisant des ingrédients naturels en tant qu’agent actif. Les produits non naturels, chimiquement synthétisés, peuvent être perçus comme n’étant pas sûrs sur les plans environnemental ou personnel. En revanche, les produits naturels sont perçus comme purs, doux, et supérieurs aux produits chimiquement synthétisés. Un grand nombre de produits naturels extraits de plantes ou d’herbes sont connus pour contenir des agents de piégeage des radicaux libres/antioxydants qui peuvent neutraliser les effets des lésions liées aux radicauxlibres. En outre, ils peuvent contenir des agents qui stimulent la synthèse et la restauration de structures de tissus conjonctifs endommagées dans le derme et la fonction barrière dans l'épiderme.
[18] Il reste un besoin pour des compositions cosmétiques qui répondent aux problèmes des signes de vieillissement, en particulier l'apparition de rides, ridules, et d'un relâchement. Un objectif de la présente invention consiste par conséquent à fournir de nouvelles compositions et de nouveaux procédés de traitement, d'amélioration, et/ou de prévention des signes d’une peau vieillie ou vieillissante. Un autre objectif de l’invention consiste à améliorer l’apparence globale de la peau vieillie ou vieillissante.
[19] L’introduction ci-dessus est uniquement proposée pour permettre une meilleure compréhension de la nature des problèmes que rencontre la technique et ne sera en aucun cas être interprétée comme une reconnaissance de l’état de la technique antérieure et la citation de références quelconques dans le présent document ne sera pas non plus interprétée comme une reconnaissance du fait que ces références constituent « la technique antérieure » à la présente demande.
RÉSUMÉ [20] Le principal aspect de la présente invention concerne un procédé d’obtention d’un extrait contenant une fructification d’un champignon (truffes blanches) du genre Tuber magnatum, comprenant les étapes suivantes :
(i) ajout d’eau aux truffes blanches pour faire un mélange, (ii) agitation dudit mélange en maintenant la température entre température ambiante et moins de 80 °C, (iii) filtration du mélange pour éliminer la partie solide pour obtenir l'extrait.
[21] Dans un autre aspect, la présente invention concerne un extrait de truffe blanche obtenu par le procédé selon la présente invention.
[22] Dans un autre aspect, la présente invention concerne une composition cosmétique comprenant l'extrait de truffe blanche obtenu par extraction aqueuse, dans lequel l’extrait de truffe blanche comprend des composés ayant une masse moléculaire inférieure à 60 kDa dans un milieu physiologiquement acceptable.
[23] Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de réduction et/ou de correction des signes du vieillissement et du photovieillissement de la peau, comprenant l’application topique à la peau d’une composition cosmétique comprenant un extrait de truffe blanche obtenu par extraction aqueuse, dans lequel l’extrait de truffe blanche comprend des composés ayant une masse moléculaire inférieure à 60 kDa dans un milieu physiologiquement acceptable.
[24] Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de réduction de la pigmentation de la peau et/ou d’éclaircissement de la peau, comprenant l’application topique à la peau d’une composition cosmétique comprenant un extrait de truffe blanche obtenu par extraction aqueuse, dans lequel l’extrait de truffe blanche comprend des composés ayant une masse moléculaire inférieure à 60 kDa dans un milieu physiologiquement acceptable.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS [25] D’autres modes de réalisation de la présente invention peuvent être compris avec les figures annexées.
[26] La figure 1 est une illustration de l’expression du collagène de type I sur les fibroblastes évaluée par immunofluorescence.
[27] La figure 2 est une illustration de la teneur en mélanine sur les biopsies de la peau ex vivo (Fontana-Masson).
[28] La figure 3 est une illustration de la stimulation de LC3 (voie de l’autophagie), évaluée sur les kératinocytes.
[29] La figure 4 est une illustration de la stimulation de LC3 (voie de l’autophagie), évaluée sur des biopsies cutanées ex vivo.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE [30] Des modes de réalisation détaillés de la présente invention sont décrits dans le présent document ; cependant, il faut comprendre que les modes de réalisation décrits sont uniquement proposés à titre d’illustration de l’invention qui peut être mise en application sous différentes formes. Par conséquent, les détails structuraux et fonctionnels spécifiques décrits dans le présent document ne doivent pas être interprétés comme restrictifs, mais uniquement comme une base représentative pour enseigner aux hommes du métier différentes utilisations de la présente invention.
[31] Chaque fois qu’un terme est identifié par référence à une plage, la plage sera comprise comme décrivant explicitement chaque élément de celle-ci. En tant qu'un exemple non restrictif, une plage de 1 à 10 % sera comprise comme incluant 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, et 10 %, et toutes les valeurs entre 1 et 10 %.
[32] Lorsque l’on fait référence à deux substituants ou plus comme étant « sélectionnés parmi » un groupe de variantes énumérées, on entend que chaque substituant peut être tout élément de ce groupe, indépendamment de l’identité des autres substituants.
[33] Tel qu’il est utilisé dans le présent document, « % » fait référence au % en poids, en d’autres termes le pourcentage en poids d’un composant relativement au poids total de la composition (en d’autres termes, comprenant tous les vecteurs, véhicules, solvants, charges, ou autres composants ajoutés avant l’application à la peau) sauf spécification contraire.
[34] Tous les termes utilisés dans le document sont destinés à avoir leur sens ordinaire sauf spécification contraire. Pour les fins de la description et des revendications de la présente invention, les termes suivants sont définis :
[35] «Extrait» doit être compris comme toute substance ou préparation isolée extraite d’une source naturelle, indépendamment du procédé d’extraction ou des ingrédients. Le terme est utilisé dans un sens large comprenant, par exemple, des ingrédients solubles dans l’eau ou dans un solvant organique extrait d’une substance naturelle à l'aide du solvant, ou des ingrédients spécifiques d’une substance naturelle.
[36] Un « extrait aqueux » doit être compris comme étant un mélange de composés obtenus par extraction avec de l’eau.
[37] On comprendra par « physiologiquement acceptable » que l’extrait de truffe blanche selon l’invention, ou une composition contenant ledit agent, est approprié à entrer en contact avec la peau ou une membrane muqueuse sans provoquer de réaction de toxicité ou d’intolérance.
[38] « Signes cutanés du vieillissement et du photovieillissement» fait référence à toutes les modifications de l’apparence de la peau et des phanères, comme, par exemple, l’amincissement de la peau, le relâchement, la perte d’hydratation et l’atonie, les rides profondes et les ridules, la perte de fermeté, un aspect terne, une atrophie dermique ou tout autre dégradation interne de la peau résultant de l'exposition aux rayons ultraviolets tels que des tâches de vieillissement.
[39] « Éclaircissement de la peau » fait référence à une amélioration du teint de la peau, de la luminance, et/ou de la clarté et/ou à la restauration du lustre ou de la brillance de la peau.
[40] L’espèce « Tuber magnatum », ou «truffe blanche» ou « trifola d'Alba Madonna » (« truffe de la vierge blanche » en italien) est principalement rencontrée dans les zones de Langhe et de Montferrat de la région du nord du Piémont en Italie, la zone la plus réputée étant la campagne autour des villes d’Alba et Asti. La truffe blanche est caractérisée par une odeur spécifique très fine et rare, une humidité de 81 %, une teneur en protéine d’environ 10 % et une teneur en sucre d'environ 2 %.
[41] Tel qu’il est utilisé dans le présent document, le terme « peau » fait référence à tout le tissu de revêtement constituant la peau, les membranes muqueuses et les phanères, y compris les cheveux, les ongles, les cils et les sourcils.
[42] « Application topique » sera comprise comme l’application ou la diffusion d’une composition contenant ledit extrait de truffe blanche, sur la surface de la peau ou d’une membrane muqueuse.
[43] Ce qui est décrit dans le présent document est un procédé d’obtention d'un extrait de truffe blanche broyée, une composition cosmétique comprenant l’extrait, un procédé de réduction et/ou de correction des signes du vieillissement et du photovieillissement de la peau par application topique de la composition comprenant l’extrait de truffe blanche à la peau.
[44] Les antioxydants jouent un rôle important en tant que facteurs protégeant la santé. L’évidence scientifique suggère que les antioxydants réduisent le risque de maladies chroniques, y compris le cancer et les maladies cardiaques. Les sources primaires d'antioxydants naturels sont les grains entiers, les fruits, les fleurs et les légumes. Les antioxydants végétaux sont la vitamine C, la vitamine E, les carotènes, l'acide phénolique, les flavonoïdes.
[45] L’extrait de truffe blanche selon l’invention est connu pour être riche en composés phénoliques, par exemple en acides phénoliques. Toutes ces molécules solubles dans l’eau connues pour leur activité antioxydante contribuent à fournir la puissance antioxydante de l'extrait de truffe blanche selon l'invention. La teneur en polyphénols totaux mesurée est de 100 mg/kg de l'extrait.
[46] Les composés polyphénoliques sont reconnus pour être des molécules antioxydantes puissantes. Les « composés polyphénoliques » sont des composés que l'on rencontre abondamment dans les sources d'aliments végétaux naturels qui ont des propriétés antioxydantes. Ils font référence à toutes les classes de polyphénols, ils signifient des composés comprenant au moins un cycle aromatique diphénol, un groupe phénol peut être facultativement éthérifié ou estérifié. Ils peuvent aussi simplement être nommés « polyphénol ».
[47] Les polyphénols jouent un rôle important dans le maintien de votre santé et de votre bien-être. Les antioxydants en tant que groupe aident à protéger les cellules dans votre corps des lésions liées aux radicaux, régulant ainsi la vitesse à laquelle vous vieillissez. Les antioxydants peuvent être divisés en trois principaux groupes : caroténoïdes, sulfures d’allyle, rencontrés dans l'ail et les oignons, polyphénols (également connus comme les composés phénoliques).
[48] Les polyphénols peuvent en outre être décomposés en quatre catégories : les acides phénoliques, les flavonoïdes, les lignanes, et les stilbènes, avec des sous-groupes supplémentaires basés sur le nombre de cycles phénol qu’ils contiennent, et sur la base des éléments structurels qui lient ces cycles les uns aux autres.
[49] L’acide phénolique est un type de composé phytochimique dénommé polyphénol, que l’on rencontre dans une variété d’aliments à base de plantes ; les graines et la peau des fruits et les feuilles des légumes en contiennent les concentrations les plus élevées. Les acides phénoliques sont facilement absorbés à travers les parois du tractus gastro-intestinal, et ils peuvent être bénéfiques à la santé parce qu'ils fonctionnent en tant qu'antioxydants qui empêchent les lésions cellulaires dues aux réactions d'oxydation des radicaux libres. On rencontre un grand nombre d’acides phénoliques différents dans la nature, et ils peuvent être divisés en deux catégories : les dérivés de l’acide benzoïque, tel que l'acide gallique ; et les dérivés de l’acide cinnamique, y compris l’acide caféique et l’acide férulique. Les acides cinnamiques sont plus communs que les acides benzoïques.
[50] On entend par « extrait de truffe blanche » que l’extrait est obtenu de la partie fructifiante du champignon Tuber magnatum fraîche ou congelée puis broyée.
[51] L’extrait de truffe blanche selon l’invention peut être obtenu par extraction aqueuse. Un grand nombre de composés que l’on rencontre dans l’extrait de truffe blanche sont susceptibles d’avoir une activité biologique et sont hydrosolubles.
[52] Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un procédé d’obtention d’un extrait de truffe blanche (Tuber magnatum), ledit procédé comprenant :
(i) l’ajout d’eau à la truffe blanche broyée pour faire un mélange, (ii) l’agitation du mélange pendant 2 heures par maintien d’une température entre température ambiante et moins de 80 °C, (iii) la filtration du mélange pour éliminer la partie solide pour obtenir l'extrait.
[53] Dans un mode de réalisation préféré, on fait macérer la truffe blanche broyée dans l'eau. La solution est soumise à une macération douce et courte pendant 2 heures à une température comprise entre température ambiante et moins de 80 °C. De manière préférée entre toutes, la température est maintenue entre température ambiante et 50 °C pour préserver l'intégrité des molécules d'intérêt tels que les acides phénoliques et ainsi leur capacité à agir en tant qu'antioxydant.
[54] Le choix de la température d’extraction dépend du type souhaité de composés à extraire, des caractéristiques structurales de la source botanique (fleurs, fruits, tiges, graines, feuilles, racines), de la qualité et du rendement requis pour l’extrait, et de la faisabilité économique d’une mise à l'échelle du procédé. L’extraction des composés phénoliques de la substance végétale est influencée par la température et la durée d'extraction, ce qui reflète les actions conflictuelles de solubilisation et de dégradation des analytes par oxydation. Cependant, un grand nombre de composés phénoliques sont facilement hydrolysés et oxydés.
Des durées d’extraction longues et une température élevée augmentent le risque d'oxydation des composés phénoliques qui réduisent le rendement des composés phénoliques dans les extraits. L’analyse a été réalisée à différentes températures et a mis en évidence que des températures élevées dégradaient ces types de molécules.
[55] L'extraction dans l’eau peut être réalisée à température ambiante ou avec de l’eau chauffée à une température pas supérieure à 80 °C, sous agitation. Différents procédés d’extraction ont été testés et sélectionnés afin de permettre de préserver l’intégrité des molécules présentes dans la truffe, avec un rendement satisfaisant et tout en permettant d’éliminer les molécules volatiles responsables de l’odeur de champignon caractéristique de la truffe. Les molécules ciblées étant sensibles, il a été mis en évidence qu’une extraction à une température de 50°C permettait d’obtenir le meilleur extrait selon les besoins de l’invention. Ainsi, de préférence, l’extraction est réalisée par macération dans l’eau chauffée à 50 °C pendant 2 heures. La solution brute est alors soumise à une filtration sur grille pour éliminer les matières insolubles. Après la filtration sur grille, la fraction aqueuse ou liquide est collectée. Pour éliminer les plus petits résidus de l’extrait aqueux, une filtration par tout procédé bien connu des hommes du métier peut être réalisée.
[56] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de purification commence par des filtrations successives à l’aide de filtres ayant une porosité décroissante d’environ 50pm à environ 20 pm jusqu’à environ 0,5 à 0,2 pm pour obtenir un extrait. De préférence les filtres ont une porosité décroissante de 50 pm à 20 pm jusqu’à 0,5 pm à 0,2 pm.
[57] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de purification est suivi par une double purification par le charbon actif.
[58] Dans un autre mode de réalisation préféré, l’extrait obtenu est composé de fragments protéiques et de peptides avec une masse moléculaire inférieure à 60 kDa, telle que mise en évidence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE). L'extrait obtenu est une solution claire et brillante.
[59] Dans un autre mode de réalisation préféré, l’extrait est alors dilué à une concentration comprise entre 0,5 g/kg et 1,5 g/kg, de préférence à 1 g/kg de matière sèche avec des solvants, tels que l'eau, le glycérol, l’éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les polyols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants, par exemple, 30 % de butylène glycol et 2 % de 1.2-hexanediol par maintien du pH entre 4 et 5.
[60] Ensuite, l’extrait de truffe blanche dilué est stérilisé par filtration stérile. Alors, la solution est chauffée une nuit à 65 °C pour réaliser une pasteurisation à basse température.
[61] En outre, l’extrait de truffe blanche dilué avec des solvants à une concentration comprise entre 0,5 g/kg et 1,5 g/kg, de préférence à 1 g/kg de matière sèche peut être analysé qualitativement et quantitativement. Les caractéristiques sont les suivantes :
- protéines : 0,05 à 0,15 g/kg,
- sucres : 0,35 à 1,05 g/kg,
- acides aminés : 0,025 à 0,075 g/kg,
- composés phénoliques : 0,05 à 0,15 g/kg,
- l’extrait ne contient pas de céramide ou de sphingolipide.
[62] Les teneurs en protéine de l'extrait de truffe blanche ont été déterminées par dosage protéique de Lowry (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951). « Protein measurement with the Folin phénol reagent», J. Biol. Chem. 193 (1) : 265-75), qui a été utilisé pour quantifier la teneur totale en protéines de l'extrait. Le dosage de Lowry est un dosage biochimique visant à déterminer le niveau total de protéine dans une solution. La méthode de Lowry se base sur une réaction du Cu+, produit par l’oxydation des liaisons peptidiques, avec le réactif de Folin-Ciocalteu. L’absorbance de l’échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 550 nm. La teneur en protéine est déterminée en utilisant une courbe d’étalonnage du BSA.
[63] La teneur en acides aminés de l'extrait de truffe blanche a été déterminée à partir d'un protocole publié par Moore et al. (Moore et al, “Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids”, Journal of Biological Chemistry 1948 Vol. 176 pp. 367388). La teneur en acides aminés libres de l'extrait a été évaluée par la formation d'un complexe coloré, après la rupture des fonctions amines et carboxyliques par le réactif ninhydrine. L’absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 570 nm. Les acides aminés totaux sont déterminés en utilisant une courbe d'étalonnage du pool d’acides aminés.
[64] La teneur en sucres totaux de l’extrait de truffe blanche a été déterminée par colorimétrie via une adaptation du dosage décrit par (Dubois et al. (“Colorimétrie Method for Détermination of Sugars andRelated Substances”, Anal. Chem., 1956, 28 (3), 350-356). Cette analyse consiste en la dissolution de la matière première dans l'acide sulfurique concentré puis en la réaction avec du phénol pour former un complexe coloré. L’absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 490 nm. La teneur en sucres est déterminée en utilisant une courbe d’étalonnage du glucose.
[65] La teneur en polyphénol de l'extrait de truffe blanche a été déterminée en utilisant le dosage de Folin-Ciocalteu (Singleton et al. (1999). « Analysis of total phénols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent», 299 : 152). Les composés polyphénol dans l’échantillon réagissent avec le réactif de Folin-Ciocalteu, l’oxydation du réactif donne une couleur bleue. L’absorbance de l’échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 760 nm. La teneur a été exprimée en équivalents d'acide gallique en utilisant une courbe d'étalonnage de l'acide gallique.
[66] On a réalisé une électrophorèse SDS-PAGE pour évaluer le poids moléculaire des protéines de l’extrait. L’extrait de truffe blanche est chauffé à 70 °C pendant 10 minutes dans des conditions dénaturantes et réductrices dans un tampon d'échantillon de dénaturation. Une solution antioxydante est ajoutée à la chambre interne (cathode) de manière à ce que les protéines réduites ne se réoxydent pas durant l'électrophorèse. La migration des protéines est réalisée en utilisant un tampon de migration MES avec l'étalon Novex® Sharp en tant que marqueur du poids moléculaire. La coloration protéique est réalisée en utilisant la coloration à l'argent.
[67] La présente demande concerne une composition cosmétique comprenant l'extrait de truffe blanche obtenu par extraction aqueuse, l’extrait de truffe blanche comprenant des composés ayant une masse moléculaire inférieure à 60 kDa et un milieu physiologiquement acceptable.
[68] L’avantage de l’extrait selon l'invention est que les petits composés sont plus stables et plus reproductibles sans présenter d'effet allergénique.
[69] Dans un autre mode de réalisation préféré, l’extrait de truffe blanche est présent en une concentration dans la plage d’environ 0,01 % à environ 20 % en poids, de préférence de 0,1 % à environ 5 % en poids du poids total de la composition.
[70] Dans un autre mode de réalisation, l’extrait de truffe blanche est utilisé pour des applications cosmétiques, de manière davantage préférée pour des applications topiques.
[71] Dans un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne des formulations orales, parentérales ou topiques adaptées par l’homme du métier, en particulier pour des compositions cosmétiques ou dermatologiques. Les compositions selon l’invention sont avantageusement conçues pour être administrées par voie topique. Ces compositions doivent par conséquent contenir un milieu physiologiquement acceptable, en d’autres termes, compatible avec la peau, et couvrir toutes les formes cosmétiques ou dermatologiques.
[72] De plus, les présentes compositions sont de préférence sous la forme de solutions aqueuses, hydroalcooliques ou huileuses ; d’une émulsion huile-dans-l'eau, d’une émulsion eau-dans-l'huile ou d’émulsions multiples ; de crèmes, de suspensions, de poudres adaptées à l'application sur la peau, les membranes muqueuses, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions peuvent également être plus ou moins fluides et ont l'apparence d'une crème, d’une lotion, d’un lait, d’un sérum, d’une pommade, d’un gel, d’une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent exister sous la forme solide, sous la forme d’un stick, ou peuvent être appliquées à la peau sous la forme d'un aérosol. Elles peuvent également être utilisées sous la forme d'un produit de soin cutané et/ou d'un produit de maquillage.
[73] Dans un autre mode de réalisation, la composition comprend un additif classiquement utilisé envisagé dans la portée de la demande, ainsi que les additifs nécessaires pour sa formulation, tels que des cosolvants (éthanol, glycérol, alcool benzylique, mouilleurs...), des agents épaississants, des diluants, des émulsifiants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d’odeur, des huiles essentielles, des oligo-éléments, des acides gras essentiels, des surfactants, des polymères filmogènes, des filtres chimiques ou des minéraux, des agents hydratants ou des eaux thermales, etc. Des polymères solubles dans l'eau, de préférence naturels, tels que des polysaccharides ou des polypeptides, des dérivés de cellulose du type méthylcellulose ou hydroxypropylcellulose, voire des polymères synthétiques, des poloxamères, des carbomères, des siloxanes, le PVA ou la PVP, et en particulier des polymères commercialisés par la compagnie Ashland, peuvent être cités, par exemple.
[74] On comprendra bien que l’extrait de truffe blanche selon l’invention peut être utilisé seul ou conjointement à d'autres agents actifs.
[75] En outre, les compositions qui peuvent être utilisées selon l'invention contiennent avantageusement au moins un autre agent actif. Les types d'ingrédients suivants peuvent être cités, de manière non restrictive : d’autres agents actifs peptidiques, des extraits de légumes, des agents cicatrisants, des agents antivieillissement, des agents antirides, des agents calmants, des agents anti-radicaux libres, des agents anti-UV, des agents de stimulation de la synthèse macromoléculaire dermique ou du métabolisme énergétique, des agents hydratants, des agents antibactériens, des agents antifongiques, des agents anti-inflammatoires, des agents anesthésiques, des agents de modulation de la différenciation cutanée, de la pigmentation ou dépigmentation cutanée, et des agents de stimulation de la croissance des ongles et des cheveux.
[76] Dans un mode de réalisation plus spécifique, la composition selon l'invention 5 comprendra :
- des écrans solaires, des agents anti-UV et infra-rouge,
- des agents anti-radicaux libres,
- de la DHEA (déhydroépiandrostérone),
- au moins un composé de co-activation du cytochrome, et/ou,
- un (ou plusieurs) composé activant l’aquaporine et/ou,
- un (ou plusieurs) composé activant la sirtuine et/ou,
- un (ou plusieurs) composé qui augmente l’adhérence cellulaire et/ou,
- un (ou plusieurs) composé qui augmente la production de protéines matricielles du type collagène ou laminine, etc.,
- un (ou plusieurs) composés de modulation de la protéine HSP,
- un (ou plusieurs) composé qui augmente l'énergie cellulaire,
- un (ou plusieurs) composé de modulation de la pigmentation tel qu'un extrait peptidique de levure, d'amaranthe, de graines de lin, de fèves, de cacao, de maïs, de soja, de tournesol, de colza ou de pois,
- un (ou plusieurs) composé améliorant la fonction de barrière cutanée,
- un (ou plusieurs) composé de protection des mitochondries,
- la vitamine A et notamment l'acide rétinoïque, le rétinol, le propionate de rétinol, le palmitate de rétinol,
- la vitamine B3 et notamment le niacinamide, le nicotinate de tocophérol,
- la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B12, le panthénol,
- la vitamine C, et notamment l'acide ascorbique, l’ascorbyl glucoside, le tétrapalmitate d’ascorbyle, l’ascorbyl phosphate de magnésium et de sodium,
- les vitamines E, F, H, K, PP, et le coenzyme Q10, les inhibiteurs des métalloprotéinases, l’activateur des inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases (TIMP),
- les acides aminés et notamment l'arginine, l'omithine, l'hydroxyproline, le dipalmitate d’hydroxyproline, la palmitoylglycine, l'hydroxylysine, la méthionine et ses dérivés, les acides aminés N-acylés,
- les peptides naturels ou synthétiques, y compris, les di-, tri-, tétra-, penta- et hexapeptides et leurs dérivés lipophiles, isomères et un complexe avec d'autres molécules telles que l'ion métallique (en d'autres termes, le cuivre, le zinc, le manganèse, le magnésium, et autres), les peptides commercialisés sous les noms commerciaux MATRIXYL®, ARGIRELINE®, CHRONOGEN™, LAMINIXYL IS™, PEPTIDE Q10™, COLLAXYL ™ (brevet FR2827170, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 01™ (brevet FR2837098, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 02™ (brevet FR2841781, ASHLAND®), ATPeptide™ (brevet FR2846883, ASHLAND®), ou le peptide synthétique de séquence Arg-Gly-Ser-NH2, commercialisé sous le nom de ATPeptide™ by ASHLAND®,
- un extrait d’Artémia salina, commercialisé sous le nom commercial de GP4G™ (FR2817748, ASHLAND®),
- des extraits peptidiques botaniques tels qu’un extrait de graines de lin (Lipigénine™, brevet FR2956818, ASHLAND®), un extrait de soja, de petit épeautre, de raisin, de graines de colza, de riz, de maïs ou de pois,
- des extraits de levure, tels que Dynagen™, (brevet FR2951946, ASHLAND®) ou Actopontine™ (brevet FR2944526, ASHLAND®) ; l'acide déhydroacétique (DHA),
- les phystostérols naturels ou synthétiques,
- les alpha- et bêta-hydroxyacides, les silanols,
- les sucres aminés, la glucosamine, la D-glucosamine, la N-acétyl-glucosamine, la Nacétyl-D-glucosamine, la mannosamine, la N-acétyl mannosamine, la galactosamine, la N-acétyl galactosamine,
- les polyphénols, les isoflavones, les flavonoïdes, tels qu’un extrait de raisin, un extrait de pin, un extrait d’olive,
- les lipides tels que les céramides ou les phospholipides,
- les huiles animales telles que les squalènes ou squalanes,
- les huiles végétales, comme l’huile d’amande, l'huile de coco, l’huile de ricin, l’huile de jojoba, l'huile d'olive, l’huile de colza, l’huile d'arachide, l’huile de tournesol, l’huile de germe de blé, l'huile de germe de maïs, l'huile de soja, l'huile de coton, l’huile de luzerne, l’huile de pavot, l'huile de graines de courge, l’huile d'onagre, l’huile de millet, l’huile d’orge, l’huile de seigle, l'huile de carthame, l’huile de passion, l’huile de noisette, l'huile de palme, l’huile de noyau d'abricot, l'huile d'avocat, l’huile de calendula, les huiles végétales éthoxylées, ou le beurre de karité, les composés mentionnés ci-dessus peuvent être naturels, tels que des hydrolysats peptidiques de plantes, ou également synthétiques, tels que des composés peptidiques.
[77] Il est clair que l’invention est conçue pour les mammifères en général, et plus spécifiquement pour les êtres humains. Les inventeurs ont en effet identifié des activités biologiques qui sont utiles pour réduire et/ou corriger les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement de la peau et pour éclaircir la peau.
[78] Dans encore un autre mode de réalisation, la présente demande concerne un procédé cosmétique de réduction et/ou de correction des signes du vieillissement et du photovieillissement de la peau, comprenant l’application topique à la peau, une composition comprenant un extrait de truffe blanche selon la demande. De préférence, pour la réalisation de ce procédé cosmétique, l’extrait de truffe blanche comprend des composés ayant une masse moléculaire inférieure à 60 kDa, dans un milieu physiologiquement acceptable.
[79] Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne un procédé cosmétique visant à éclaircir la peau, dans lequel une composition cosmétique comprenant un extrait de truffe blanche selon l’invention est appliquée par voie topique à la peau à traiter. De préférence, pour la réalisation de ce procédé cosmétique, l’extrait de truffe blanche comprend des composés ayant une masse moléculaire inférieure à 60 kDa, dans un milieu physiologiquement acceptable.
[80] Les modes de réalisation qui sont spécifiques de ce procédé cosmétique résultent également de la description ci-dessus.
[81] D’autres avantages et caractéristiques de l'invention peuvent être observés plus en détails à la lecture des exemples non restrictifs, proposés à titre d'illustration.
[82] Exemple 1 : préparation d’un extrait de truffe blanche ( lither magnatum}
Les truffes blanches (fructification) proviennent d’Alba en Italie. On place 50 g de truffe blanche congelés et broyés dans 1 litre d’eau distillée. On chauffe la solution pendant 2 heures à une température de 50 °C. On réalise alors une filtration avec un filtre de 20 à 50 pm pour séparer le résidu de truffe solide de la partie liquide. Le processus de purification commence par des filtrations successives en utilisant des filtres ayant une porosité décroissante de 50 à 20 pm jusqu’à 0,3 à 0,5 pm puis on ajoute 0,25 % de charbon actif (Cabot Norit SXplus) à la solution et on mélange pendant 30 minutes à 50 °C ; on élimine alors le charbon actif par filtration à 0,3 à 0,5 pm ; on ajoute 0,25 % supplémentaire de charbon actif (Cabot Norit SXplus) à la solution et on mélange pendant 30 minutes à 50 °C ; on élimine alors le charbon actif par filtration à 0,3 à 0,5 pm. On dilue alors le filtrat pour obtenir un extrait ayant entre 0,5 et 1,5 kg de matière sèche avec 30 % de butylène glycol et 2 % d’hexanediol.
On ajuste le pH de la solution entre 4 et 5 pour augmenter la stabilité de l’extrait. Après la clarification et la dilution, on stérilise le filtrat par filtration avec un filtre ayant une porosité de 0,2 pm dans des conditions stériles. On analyse l’extrait de truffe blanche en utilisant une procédure standard. Les caractéristiques de l’extrait de truffe blanche obtenu sont les suivantes : matière sèche : 1 g/kg - protéines : 0,1 g/kg - sucres : 0,70 g/kg - acides aminés : 0,01 g/kg et composés polyphénoliques : 0,1 g/kg.
On a déterminé la teneur en protéines de l'extrait de truffe blanche par dosage protéique de Lowry (Lowry OH, 1951) pour quantifier la teneur protéique totale de l’extrait. Le dosage de Lowry est un dosage biochimique visant à déterminer le niveau total de protéine dans une solution. La méthode de Lowry se base sur une réaction du Cu+, produit par l’oxydation des liaisons peptidiques, avec le réactif de Folin-Ciocalteu. L’absorbance de l’échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 550 nm. On a déterminé la teneur en protéine en utilisant une courbe d’étalonnage du BSA (sérum albumine bovine). On a déterminé la teneur en acides aminés de l'extrait à partir d'un protocole publié par Moore et al. (1948), on a évalué la teneur en acides aminés libres de l'extrait par la formation d'un complexe coloré, après la rupture des fonctions amines et carboxyliques par le réactif ninhydrine. L’absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 570 nm. On a déterminé la teneur en acides aminés totaux en utilisant une courbe d'étalonnage du pool d’acides aminés.
On a déterminé la teneur en sucres totaux par colorimétrie via une adaptation du dosage décrit par Dubois et al. (1956) (Dubois et al. “Colorimétrie Method for Détermination of Sugars and Related Substances”, Anal. Chem., 1956, 28 (3), 350-356). Cette analyse consiste en la dissolution de la matière première dans l'acide sulfurique concentré puis en la réaction avec du phénol pour former un complexe coloré. L’absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 490 nm. La teneur en sucres est déterminée en utilisant une courbe d’étalonnage du glucose.
On a déterminé la teneur en polyphénol de l'extrait de truffe blanche en utilisant le dosage de Folin-Ciocalteu (Singleton et al., «Analysis of total phénols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent», 1999, 299: 152). Les composés polyphénol dans l’échantillon réagissent avec le réactif de Folin-Ciocalteu, l’oxydation du réactif donne une couleur bleue. L’absorbance de l’échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 760 nm. On a exprimé la teneur en équivalents d'acide gallique en utilisant une courbe d'étalonnage d'acide gallique.
On a réalisé une électrophorèse SDS-PAGE pour évaluer le poids moléculaire des protéines de l’extrait. On chauffe l’extrait de truffe blanche à 70 °C pendant 10 minutes dans des conditions dénaturantes et réductrices dans un tampon d'échantillon de dénaturation. On ajoute une solution antioxydante à la chambre interne (cathode) de manière à ce que les protéines réduites ne se réoxydent pas durant l'électrophorèse. La migration des protéines est réalisée en utilisant un tampon de migration MES avec l'étalon Novex® Sharp en tant que marqueur du poids moléculaire. La coloration protéique est réalisée en utilisant la coloration à l'argent. L’extrait obtenu est composé de peptides avec une masse moléculaire inférieure à 60 kDa.
[83] Exemple 2 : préparation d’un extrait de truffe blanche (Tuber magnatum}
Brièvement, les truffes blanches (fructification) proviennent d’Alba en Italie. On place 100 g de truffe blanche congelés et broyés dans un litre d’eau distillée. On ajuste le pH de la solution à 2 avec de l’acide chlorhydrique. On chauffe la solution pendant 2 heures à une température de 80 °C. On réalise alors une filtration avec un filtre de 20 à 50 pm pour séparer le résidu de truffe solide de la partie liquide. Le processus de purification commence par des filtrations successives en utilisant des filtres ayant une porosité décroissante de 50 à 20 pm jusqu’à 0,3 à 0,5 pm puis on ajoute 1 % de charbon actif (Cabot Norit SXplus) à la solution et on mélange pendant 30 minutes à 50 °C ; on élimine alors le charbon actif par filtration à 0,3 à 0,5 pm. On obtient un filtrat de 20 g/kg de matière sèche que l’on dilue pour obtenir un extrait ayant entre 0,5 et 1,5 g/kg de matière sèche. On ajuste le pH de la solution entre 4 et 5 pour augmenter la stabilité de l’extrait. Après la clarification et la dilution, on stérilise le filtrat par filtration avec un filtre ayant une porosité de 0,2 pm dans des conditions stériles.
[84] Exemple 3 : préparation d’un extrait de truffe blanche (Tuber magnatum}
Brièvement, les truffes blanches (fructification) proviennent d’Alba en Italie. On place 100 g de truffe blanche congelés et broyés dans 1 litre d’eau distillée. On ajuste le pH de la solution à 2 avec de l’acide chlorhydrique. On chauffe la solution pendant 2 heures à une température de 80° C. On réalise alors une filtration avec un filtre de 20 à 50 pm pour séparer le résidu de truffe solide de la partie liquide. Le processus de purification commence par des filtrations successives en utilisant des filtres ayant une porosité décroissante de 50 à 20 pm jusqu’à 0,3 à 0,5 pm puis on ajoute 0,25 % de charbon actif (Cabot Norit SXplus) à la solution et on mélange pendant 30 minutes à 50 °C ; on élimine alors le charbon actif par filtration à 0,3 à 0,5 pm ; on ajoute 0,25 % supplémentaire de charbon actif (Cabot Norit SXplus) à la solution et on mélange pendant 30 minutes à 50 °C ; on élimine alors le charbon actif par filtration à 0,3 à 0,5 pm. On obtient un filtrat de 20 g/kg de matière sèche que l’on dilue pour obtenir un extrait ayant entre 0,5 et 1,5 g/kg de matière sèche. On ajuste le pH de la solution entre 4 et 5 pour augmenter la stabilité de l’extrait. Après la clarification et la dilution, on stérilise le filtrat par filtration avec un filtre ayant une porosité de 0,2 pm dans des conditions stériles.
[85] Exemple 4 : préparation d’un extrait de truffe blanche (Tuber magnatum}
Brièvement, les truffes blanches (fructification) proviennent d’Alba en Italie. On place 100 g de truffe blanche congelés et broyés dans 1 litre de solution composée de 10 mM d’EDTA tétrasodique. On chauffe la solution pendant 2 heures à une température de 50 °C. On réalise alors une filtration avec un filtre de 20 à 50 pm pour séparer le résidu de truffe solide de la partie liquide. Le processus de purification commence par des filtrations successives en utilisant des filtres ayant une porosité décroissante de 50 à 20 pm jusqu’à 0,3 à 0,5 pm puis on ajoute 0,25 % de charbon actif (Norit SXplus de Cabot) à la solution et on mélange pendant 30 minutes à 50 °C ; on élimine alors le charbon actif par filtration à 0,3 à 0,5 pm ; on ajoute 0,25 % supplémentaire de charbon actif (Cabot Norit SXplus) à la solution et on mélange pendant 30 minutes à 50 °C ; on élimine alors le charbon actif par filtration à 0,3 à 0,5 pm. On obtient un filtrat de 20 g/kg de matière sèche que l’on dilue pour obtenir un extrait ayant de 0,5 à 1,5 g/kg de matière sèche. On ajuste le pH de la solution entre 4 et 5 pour augmenter la stabilité de l’extrait. Après la clarification et la dilution, on stérilise le filtrat par filtration avec un filtre ayant une porosité de 0,2 pm dans des conditions stériles.
[86] Exemple 5 : évaluation de la truffe blanche sur le vieillissement de la peau, par évaluation de la matrice extracellulaire sur les fibroblastes
L’objectif de cette étude consiste à mettre en évidence l’effet de l’extrait de truffe blanche sur le vieillissement par évaluation de la matrice extracellulaire (MEC), relativement à l’expression du collagène I.
Protocole :
Les fibroblastes humains normaux ont été traités deux fois par jour pendant 48 heures avec une solution d’extrait de truffe blanche, selon l’exemple 1, 2, 3 ou 4, diluée à l/200eme dans le milieu de culture, conduisant à une concentration finale de 0,5 % vol/vol.
Pour l’immunomarquage par un anticorps anti-collagène I, le tapis cellulaire a été lavé et fixé avec du méthanol froid. On a alors mis les cellules à incuber en présence d’un anticorps anticollagène I spécifique (Tebu, réf. 600-401-103-0.5, polyclonal de lapin), puis un anticorps secondaire adapté, couplé à une sonde fluorescente. Après le montage dans un milieu spécifique, on a observé les lamelles avec un microscope à épifluorescence (microscope Zeiss Axiovert 200M). L”intensité de fluorescence a été quantifiée par analyse de l’image en utilisant le logiciel Volocity® 6.3 (PerkinElmer, Inc.).
Résultats :
Seuls les traitements avec l’extrait de truffe blanche selon l’exemple 1 dilué à 0,5 % pendant 48 heures ont mis en évidence une augmentation très significative (test t de Student) de l’expression du collagène I sur les fibroblastes. L’autre application de l’extrait n’a pas présenté d’efficacité.
Ces résultats sont illustrés sur la figure 1.
Conclusions :
L’extrait de truffe blanche à 0,5 %, par la stimulation du collagène I, a amélioré la matrice extracellulaire sur les fibroblastes. L’extrait selon l’exemple 1 a donné les meilleurs résultats.
[87] Exemple 6 : évaluation de l’extrait de truffe blanche sur l’éclaircissement par évaluation de la teneur en mélanine sur des biopsies de peau ex vivo
L’objectif de cette étude consiste à mettre en évidence l’effet de l’extrait de truffe blanche sur l’éclaircissement par évaluation du contenu en mélanine en utilisant la coloration de FontanaMasson. La coloration de Fontana-Masson se base sur la capacité de la mélanine à réduire des solutions de nitrate d’argent ammoniacal en argent métallique (marron) sans utiliser d’agent de réduction extérieur.
Protocole :
Des biopsies ex vivo de peau humaine normale d’un diamètre de 6 mm ont été mises en culture dans un milieu de culture spécifique (DMEM à 1 g/1, HAMF12, sérum de veau fœtal et antibiotiques) et ont été traitées deux fois par jour pendant 48 heures avec une solution d’extrait de truffe blanche, selon l’exemple 1, 2, 3 ou 4, diluée à l/200eme dans du PBS, conduisant à une concentration finale de 0,5 % vol/vol, respectivement. La condition témoin est réalisée par application de PBS IX.
Pour la coloration de Fontana-Masson, les tissus ont été fixés et inclus dans la paraffine et coupés en fines sections. Ces coupes de biopsies de peau incluses ont ensuite été déparaffmées et réhydratées. Sur chaque section a été ajoutée une solution mère contenant de l’hydroxyde d’ammonium et du nitrate d’argent. Après un lavage à l’eau distillée, les biopsies ont été mises contact avec du thiosulfate de sodium à 5 % avant de laver de nouveau. Après le montage dans un milieu spécifique, les lamelles ont été examinées en utilisant un microscope Éclipse E600 (Nikon). L’acquisition de ces photos a permis ensuite l’analyse de l’image en utilisant le logiciel ImageJ afin de quantifier le nombre de pixels marrons/foncés, caractéristiques de la mélanine.
Résultats :
Les traitements avec l’extrait de truffe blanche selon les exemples 1 et 4 dilués à 0,5 % pendant 48 heures ont présenté une réduction significative (test t de Student) de la teneur en mélanine sur des biopsies de peau ex vivo. L’autre application de l’extrait n’a pas présenté d’efficacité.
Ces résultats sont illustrés sur la figure 2. On a observé que l’extrait selon l’exemple 1 a donné de meilleurs résultats que l’extrait selon l’exemple 4.
Conclusions :
L’application d’extrait de truffe blanche à 0,5 % a présenté une efficacité d’éclaircissement par réduction de la teneur en mélanine sur des biopsies de peau ex vivo. L’extrait selon l’exemple 1 a donné les meilleurs résultats.
L’extrait préparé selon l’exemple 1 était le seul à agir à la fois sur les voies de la matrice extracellulaire et d’éclaircissement. Il a été sélectionné comme le meilleur candidat.
[88] Exemple 7 : évaluation de l’extrait de truffe blanche selon l’exemple 1 sur la voie de l’autophagie, sur les kératinocytes et des biopsies de peau ex vivo
L’objectif de cette étude consiste à mettre en évidence l’effet de l’extrait de truffe blanche sur l’autophagie. L’autophagie est un processus catabolique pour la dégradation autophagosomale-lysosomale des contenus cytoplasmiques en vrac (Cuervo AM et al. « Autophagy, nutrition and immunology », Mol Aspects Med. 33(1) :2-13, 2012). Ici, on a évalué la LC3 (Microtubule-associated protein 1A/1B-Iight chain 3) qui est une protéine structurale impliquée dans la formation des autophagosomes (Melendez A and Levine B. « Autophagy in C. elegans », WormBook. 24 : 1-26, 2009).
Protocole :
Évaluation sur des kératinocytes
Des kératinocytes humains normaux ont été traités deux fois par jour pendant 48 heures avec une solution d’extrait de truffe blanche, selon l’exemple 1, diluée à l/200eme dans le milieu de culture, conduisant à une concentration finale de 0,5 % vol/vol.
Pour l’immunomarquage par l’anticorps anti-LC3, le tapis cellulaire a été lavé et fixé avec du méthanol froid. On a alors mis les cellules à incuber en présence d’un anticorps anti-LC3 spécifique (Cell Signaling, réf. PM036, polyclonal de lapin), puis un anticorps secondaire adapté, couplé à une sonde fluorescente. Après le montage dans un milieu spécifique, on a observé les lamelles avec un microscope à épifluorescence (microscope Zeiss Axiovert 200M). L’intensité de fluorescence a été quantifiée par analyse de l’image en utilisant le logiciel Volocity® 6.3 (PerkinElmer, Inc.)
Évaluation sur biopsies cutanées ex vivo
Des biopsies ex vivo de peau humaine normale d’un diamètre de 6 mm ont été mises en culture dans un milieu de culture spécifique (DMEM à 1 g/1, HAMF12, sérum de veau fœtal et antibiotiques) et ont été traitées deux fois par jour pendant 48 heures avec une solution d’extrait de truffe blanche, selon l’exemple 1, diluée à l/200eme dans du PBS, conduisant à une concentration finale de 0,5 % vol/vol, respectivement. La condition témoin est réalisée par application de PBS IX.
Pour l’immunomarquage par l’anticorps anti-LC3, les tissus ont été fixés et inclus dans la paraffine puis coupés en fines sections. Ces coupes de biopsies de peau incluses ont ensuite été déparaffinées et réhydratées. Ensuite, les sections de peau ont été incubées avec anticorps anti-LC3 spécifique (Cell Signaling, PM036, polyclonal de lapin), puis un anticorps secondaire adapté, couplé à une sonde fluorescente. Après le montage dans un milieu spécifique, on a observé les lamelles avec un microscope à épifluorescence (microscope Zeiss Axiovert 200M) et les différences de l’intensité de fluorescence ont été quantifiées par analyse d’image en utilisant le logiciel Volocity® 6.3 (PerkinElmer, Inc.).
Résultats :
Les traitements avec une solution d’extrait de truffe blanche selon l’exemple 1 diluée à 0,5 % pendant 48 heures ont montré une augmentation significative (test t de Student) de l’expression de LC3 à la fois sur les kératinocytes et les biopsies cutanées ex vivo. Les résultats sont illustrés sur les figures 3 et 4.
Conclusion :
L’extrait de truffe blanche de l’exemple 1 à 0,5 %, par l’intermédiaire de la stimulation de LC3, a amélioré la voie de l’autophagie.
Claims (16)
- REVENDICATIONS1. Procédé d’obtention d’un extrait de truffe blanche (Tuber magnatum) comprenant :(i) l’ajout d’eau aux truffes blanches broyées pour faire un mélange, (ii) l’agitation dudit mélange en maintenant la température entre la température ambiante et 50 °C, (iii) la filtration du mélange pour éliminer la partie solide pour obtenir l'extrait.
- 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’étape (ii) est réalisée à une température de 50 °C.
- 3. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, dans lequel ledit extrait de l'étape (iii) est en outre clarifié par filtration séquentielle avec une porosité décroissante de 50 pm à 20 pm jusqu’à 0,5 pm à 0,2 pm pour obtenir l’extrait.
- 4. Procédé selon Tune des revendications 1 à 3 de matière sèche, dans lequel ledit extrait de truffe blanche selon l’étape (iii) est en outre dilué à une concentration comprise entre 0,5 g/kg et 1,5 g/kg, dans un solvant sélectionné parmi l’eau, le glycérol, l’éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les polyols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants.
- 5. Extrait de truffe blanche obtenu par le procédé de Tune des revendications 1 à 4.
- 6. Extrait de truffe blanche obtenu par le procédé de la revendication 4, dans lequel ledit extrait de truffe blanche comprend de 0,5 à 1,5 g/kg de matière sèche, de 0,05 à 0,15 g/kg de protéine, de 0,35 à 1,05 g/kg de sucre, de 0,025 à 0,075 g/kg d’acides aminés ; et de 0,05 à 0,15 g/kg de composés phénoliques.
- 7. Extrait de truffe blanche selon Tune des revendications 5 ou 6, comprenant des composés ayant une masse moléculaire inférieure à 60 kDa.
- 8. Composition cosmétique comprenant un extrait de truffe blanche obtenu conformément au procédé de Tune des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit extrait de truffe blanche comprend des composés ayant une masse moléculaire inférieure à 60 kDa et un milieu physiologiquement acceptable.
- 9. Composition cosmétique selon la revendication 8, dans laquelle ledit extrait de truffe blanche est utilisé en une concentration d’environ 0,01 % en poids à environ 20 % en poids du poids total de la composition.
- 10. Composition cosmétique selon la revendication 8, dans laquelle ledit extrait de truffe blanche est utilisé en une concentration d’environ 0,1 % en poids à environ 5 % en poids du poids total de la composition.
- 11. Composition cosmétique selon l’une des revendications 8 à 10, dans laquelle ladite composition se trouve sous une forme adaptée à une application topique.
- 12. Composition cosmétique selon l’une des revendications 8 à 11, dans laquelle ladite composition se trouve sous la forme de gels, de crèmes, de baumes, de laits ou de produits moussants.
- 13. Composition cosmétique selon l’une des revendications 8 à 12, comprenant en outre au moins un autre agent actif.
- 14. Composition cosmétique selon la revendication 13, comprenant en outre au moins un autre agent actif sélectionné parmi un agent antioxydant, un hydrolysat de plantes, un composé peptidique synthétique, un écran solaire et un agent antirides.
- 15. Procédé cosmétique de réduction et/ou de correction des signes du vieillissement et du photo-vieillissement de la peau, comprenant l’application topique à la peau, d’une composition cosmétique comprenant l’extrait de truffe blanche obtenu conformément au procédé de l’une des revendications 1 à 4.
- 16. Procédé cosmétique d'éclaircissement de la peau, comprenant l’application topique sur la peau, d’une composition cosmétique comprenant l’extrait de truffe blanche obtenu conformément au procédé de l’une des revendications 1 à 4.1/4
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