CN106800586A - 一种辣木蛋白质高效提取的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种辣木蛋白质高效提取的方法，操作步骤为：1）预处理；2）脱脂；3）酶解；4）醇沉；5）大孔树脂吸附纯化；6）超滤、干燥。有益效果为：复合酶制剂中各组分相互协作，酶的活性强，将辣木籽细胞间间质酶解，使辣木籽细胞分散开来，增大了复合酶制剂与辣木籽细胞的接触面积；复合酶制剂快速水解辣木籽细胞的细胞壁，使细胞质充分流出，提高了辣木蛋白质的提取率；最后得到的辣木蛋白质纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全，可应用于食品、医药、化妆品中。在得到辣木蛋白质的同时还可得到副产品辣木油，增加了辣木籽的经济附加值，为辣木籽的生产利用提供了一种新的途径。

Description

一种辣木蛋白质高效提取的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体是一种辣木蛋白质高效提取的方法。

背景技术

辣木籽是原产于自然条件极其恶劣的印度辣木树的种子，辣木树被称为“奇迹之树”又称为鼓槌树，含有丰富营养，高维生素 A、B、C、E，高蛋白质、高纤维。据研究，辣木籽中各成分的质量分数为辣木油 33.5%、辣木蛋白 37.9%、淀粉 6.1%、可溶性总糖 17.1%（其中辣木多糖 12.3%）、粗纤维 7.5%及丰富的宏量元素如：钙、钾、镁、钠、磷和微量元素如：锌、铜、铁等。辣木籽中的活性蛋白具有非常强的抗氧化性，可以去除自由基，起到祛斑美白抗衰老的作用。

现有技术如授权公告号为CN101508729B的中国发明专利，公开了一种从辣木种子中提取辣木蛋白质的方法，其特征在于经过下列步骤 ：按辣木仁粉∶水＝1∶12～15的质量比，在辣木仁粉中加水搅拌，调节pH值为4～8 ；按辣木仁粉∶酶＝1∶0.01～0.1 的质量比加酶，水浴中 40 ～ 70℃恒温酶解反应 12 ～ 48h，分离出辣木油脂，水相，固体饼粕 ；继续将水相pH值调至7～9，离心分离出上层清液，再把上清液 pH 值调至 10 ～ 12，离心分离，弃上清，合并两次沉淀物，干燥、冷却后得辣木蛋白质。在没有有机溶剂参与的温和条件下，即可同时得到辣木油和高品质辣木蛋白质，且安全、节能、环保。最后得到的辣木蛋白没有进行分离纯化，纯度有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取率高，提取的辣木蛋白纯度高、活性强、提取率高，无溶剂残留的辣木蛋白质高效提取的方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于以下步骤：

1）预处理：将辣木籽晒干，去皮，得到白色内子，粉碎，过筛，得到辣木籽粉末；

2）脱脂：在辣木籽粉末中加入脱脂剂，脱脂剂为石油醚-丙酮-乙醇混合液，石油醚：丙酮：乙醇体积比为1：（0.8~1.3）：（2~3），辣木籽粉：混合液体积比为1:15~19，回流提取，回流温度为65~73℃，回流时间为45~63min，重复1~4次，旋蒸干燥得到脱脂辣木籽粉末。脂肪不仅会在酶解过程中会被氧化，影响酶解液品质，还会与蛋白质乳化，影响蛋白质的提取，所以酶解前需对辣木籽粉末进行脱脂。采用上述脱脂剂对辣木籽脱脂，脱脂率高；回收回流液，旋蒸去除脱脂剂，得到辣木油；

3）酶解、提取：在脱脂辣木籽粉末中加入蒸馏水，脱脂辣木籽粉末：蒸馏水质量体积比为1g：（4~6）mL。再加入0.001~0.003%的复合酶制剂，酶解温度为45~50℃，pH为2.4~3.1，酶解时间为1.2~1.5h，酶解结束后沸水浴灭酶，调节pH，加入Tris—HCl缓冲液，酶解液：Tris—HCl缓冲液的体积比为1:14~18，Tris—HCl缓冲液浓度为1.4~1.6 mol/L，pH为8.5~8.9。超声波助溶，超声波功率为300~320W，超声时间为30~35min，过滤，取滤液。超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，使得传质的边界层部分变得极为细薄，传质速率得到了显而易见的增强。能够穿透打碗花细胞的细胞壁，让Tris—HCl缓冲液以最快的速度进入到植物细胞细胞质中，以便于溶解出其中的活性物质。超声提取能够明显的缩短其提取的时间，并且提取的条件适中温和，使得提取产率有了明显提高；辣木蛋白质在Tris—HCl缓冲液中的溶解度高，提取效果好；

4）醇沉：在滤液中加入无水乙醇，滤液：乙醇 体积比为1:4~4.6。搅拌，静置，离心，取沉淀。高浓度乙醇能使辣木蛋白质沉淀的同时不会破坏辣木蛋白质的结构，不会影响其活性，通过醇沉能使辣木蛋白质得到初步纯化；

5）大孔树脂吸附纯化：将大孔树脂装柱、平衡后，将步骤4得到的沉淀置于柱头，进行梯度洗脱。利用大孔树脂对不同极性的物质，吸附性能不同的性质，将辣木蛋白质与其他杂质分离开来。对得到的洗脱液用双缩脲试剂测试，将产生紫色反应的洗脱液合并；

6）超滤、干燥：将洗脱液旋蒸浓缩，超滤，先用15~20kDa的超滤膜超滤，取滤过液，再用4~8kDa的超滤膜过滤，取滞留液。超滤根据分子量大小对辣木蛋白进行纯化，现将分子量大于15~20kDa的杂质去除，再将分子量小于4~8kDa的杂质去除，同时可以达到去盐、浓缩的目的。将滞留液继续浓缩，冷冻干燥得到辣木蛋白质粉末。最后得到的辣木蛋白质纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全，可应用于食品、医药、化妆品中。增加了辣木籽的经济附加值，为辣木籽的生产利用提供了一种新的途径。

优选的，复合酶制剂成份及其重量份为：10~15份纤维素酶、8~12份木质素酶、3~5份果胶酶、0.003~0.005份天冬氨酸、0.2~0.6份硫酸镁、0.001~0.002份麦芽酚和0.3~0.6份磷酸二氢钙。上述复合酶制剂中各组分相互协作，酶的活性强，将辣木籽细胞间间质酶解，使辣木籽细胞分散开来，天冬氨酸和麦芽酚通过磷酸二氢钙促进复合酶制剂与辣木籽细胞接触，明显增大其接触面积，从而充分酶解，使复合酶制剂快速水解辣木籽细胞的细胞壁，使细胞质充分流出，提高了辣木蛋白质的提取率。

优选的，梯度洗脱的洗脱时间，洗脱液，流速依次为：0~5min，无水乙醇，流速为0.24~0.26BV/h；5~10min，70~75%乙醇溶液+NaCl，流速为0.24~0.26BV/h；10~25min，超纯水，流速为0.24~0.26BV/h；25~35min，60~70%食用乙醇溶液+NaCl，流速为0.24~0.26BV/h，NaCl加入量为洗脱液质量的1/12000~1/15000，乙醇溶液用超纯水作为溶剂。NaCl能够减小辣木蛋白质在水中的溶解度，提高蛋白质在大孔树脂上的挂枝率，吸附量增加，减少了辣木蛋白质的损失，提高了提取率。

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用石油醚-丙酮-乙醇混合液对辣木籽脱脂，脱脂率高；回收回流液，旋蒸去除脱脂剂，得到辣木油；超声提取能够明显的缩短其提取的时间，并且提取的条件适中温和，使得提取产率有了明显提高；辣木蛋白质在Tris—HCl缓冲液中的溶解度高，提取效果好；复合酶制剂中各组分相互协作，酶的活性强，将辣木籽细胞间间质酶解，使辣木籽细胞分散开来，增大了复合酶制剂与辣木籽细胞的接触面积；复合酶制剂快速水解辣木籽细胞的细胞壁，使细胞质充分流出，提高了辣木蛋白质的提取率；高浓度乙醇能使辣木蛋白质沉淀的同时不会破坏辣木蛋白质的结构，不会影响其活性，通过醇沉能使辣木蛋白质得到初步纯化；采用超滤，将分子量大于15~20kDa的杂质和分子量小于4~8kDa的杂质去除；最后得到的辣木蛋白质纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全，可应用于食品、医药、化妆品中。增加了辣木籽的经济附加值，为辣木籽的生产利用提供了一种新的途径。

具体实施例

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

实施例1：

1）预处理：将辣木籽晒干，去皮，得到白色内子，粉碎，过筛，得到辣木籽粉末；

2）脱脂：在辣木籽粉末中加入脱脂剂，脱脂剂为石油醚-丙酮-乙醇混合液，石油醚：丙酮：乙醇体积比为1：（0.8~1.3）：（2~3），辣木籽粉：混合液体积比为1:15~19，回流提取，回流温度为65~73℃，回流时间为45~63min，重复1~4次，旋蒸干燥得到脱脂辣木籽粉末。脂肪不仅会在酶解过程中会被氧化，影响酶解液品质，还会与蛋白质乳化，影响蛋白质的提取，所以酶解前需对辣木籽粉末进行脱脂。采用上述脱脂剂对辣木籽脱脂，脱脂率高；回收回流液，旋蒸去除脱脂剂，得到辣木油；

3）酶解、提取：在脱脂辣木籽粉末中加入蒸馏水，脱脂辣木籽粉末：蒸馏水质量体积比为1g：（4~6）mL。再加入0.001~0.003%的复合酶制剂，酶解温度为45~50℃，pH为2.4~3.1，酶解时间为1.2~1.5h，酶解结束后沸水浴灭酶，调节pH，加入Tris—HCl缓冲液，酶解液：Tris—HCl缓冲液的体积比为1:14~18，Tris—HCl缓冲液浓度为1.4~1.6 mol/L，pH为8.5~8.9。超声波助溶，超声波功率为300~320W，超声时间为30~35min，过滤，取滤液。超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，使得传质的边界层部分变得极为细薄，传质速率得到了显而易见的增强。能够穿透打碗花细胞的细胞壁，让Tris—HCl缓冲液以最快的速度进入到植物细胞细胞质中，以便于溶解出其中的活性物质。超声提取能够明显的缩短其提取的时间，并且提取的条件适中温和，使得提取产率有了明显提高；辣木蛋白质在Tris—HCl缓冲液中的溶解度高，提取效果好；

4）醇沉：在滤液中加入无水乙醇，滤液：乙醇 体积比为1:4~4.6。搅拌，静置，离心，取沉淀。高浓度乙醇能使辣木蛋白质沉淀的同时不会破坏辣木蛋白质的结构，不会影响其活性，通过醇沉能使辣木蛋白质得到初步纯化；

5）大孔树脂吸附纯化：将大孔树脂装柱、平衡后，将步骤4得到的沉淀置于柱头，进行梯度洗脱。利用大孔树脂对不同极性的物质，吸附性能不同的性质，将辣木蛋白质与其他杂质分离开来。对得到的洗脱液用双缩脲试剂测试，将产生紫色反应的洗脱液合并；

6）超滤、干燥：将洗脱液旋蒸浓缩，超滤，先用15~20kDa的超滤膜超滤，取滤过液，再用4~8kDa的超滤膜过滤，取滞留液。超滤根据分子量大小对辣木蛋白进行纯化，现将分子量大于15~20kDa的杂质去除，再将分子量小于4~8kDa的杂质去除，同时可以达到去盐、浓缩的目的。将滞留液继续浓缩，冷冻干燥得到辣木蛋白质粉末。最后得到的辣木蛋白质纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全，可应用于食品、医药、化妆品中。增加了辣木籽的经济附加值，为辣木籽的生产利用提供了一种新的途径。

复合酶制剂成份及其重量份为：10~15份纤维素酶、8~12份木质素酶、3~5份果胶酶、0.003~0.005份天冬氨酸、0.2~0.6份硫酸镁、0.001~0.002份麦芽酚和0.3~0.6份磷酸二氢钙。上述复合酶制剂中各组分相互协作，酶的活性强，将辣木籽细胞间间质酶解，使辣木籽细胞分散开来，增大了复合酶制剂与辣木籽细胞的接触面积；复合酶制剂快速水解辣木籽细胞的细胞壁，使细胞质充分流出，提高了辣木蛋白质的提取率。

梯度洗脱的洗脱时间，洗脱液，流速依次为：0~5min，无水乙醇，流速为0.24~0.26BV/h；5~10min，70~75%乙醇溶液+NaCl，流速为0.24~0.26BV/h；10~25min，超纯水，流速为0.24~0.26BV/h；25~35min，60~70%食用乙醇溶液+NaCl，流速为0.24~0.26BV/h，NaCl加入量为洗脱液质量的1/12000~1/15000，乙醇溶液用超纯水作为溶剂。NaCl能够减小辣木蛋白质在水中的溶解度，提高蛋白质在大孔树脂上的挂枝率，吸附量增加，减少了辣木蛋白质的损失，提高了提取率。

实施例2：

1）预处理：将10kg辣木籽晒干，去皮，得到白色内子，粉碎，过筛，得到辣木籽粉末；

2）脱脂：在辣木籽粉末中加入脱脂剂，脱脂剂为石油醚-丙酮-乙醇混合液，石油醚：丙酮：乙醇体积比为1：1.2：2.7，辣木籽粉：混合液体积比为1:18，回流提取，回流温度为70℃，回流时间为58min，重复3次，旋蒸干燥得到脱脂辣木籽粉末。脂肪不仅会在酶解过程中会被氧化，影响酶解液品质，还会与蛋白质乳化，影响蛋白质的提取，所以酶解前需对辣木籽粉末进行脱脂。采用上述脱脂剂对辣木籽脱脂，脱脂率高；回收回流液，旋蒸去除脱脂剂，得到辣木油；

3）酶解、提取：在脱脂辣木籽粉末中加入蒸馏水，脱脂辣木籽粉末：蒸馏水质量体积比为1g：6mL。再加入0.003%的复合酶制剂，复合酶制剂成份及其最优选重量份为：13份纤维素酶、10份木质素酶、4份果胶酶、0.002份天冬氨酸、0.4份硫酸镁、0.001份麦芽酚和0.5份磷酸二氢钙。上述复合酶制剂中各组分相互协作，酶的活性强，将辣木籽细胞间间质酶解，使辣木籽细胞分散开来，增大了复合酶制剂与辣木籽细胞的接触面积；复合酶制剂快速水解辣木籽细胞的细胞壁，使细胞质充分流出，提高了辣木蛋白质的提取率。酶解温度为48℃，pH为2.9，酶解时间为1.3h，酶解结束后沸水浴8min灭酶，调节pH，加入Tris—HCl缓冲液，酶解液：Tris—HCl缓冲液的体积比为1:15，Tris—HCl缓冲液浓度为1.5mol/L，pH为8.6。超声波助溶，超声波功率为310W，超声时间为32min，过滤，取滤液。超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，使得传质的边界层部分变得极为细薄，传质速率得到了显而易见的增强。能够穿透打碗花细胞的细胞壁，让Tris—HCl缓冲液以最快的速度进入到植物细胞细胞质中，以便于溶解出其中的活性物质。超声提取能够明显的缩短其提取的时间，并且提取的条件适中温和，使得提取产率有了明显提高；辣木蛋白质在Tris—HCl缓冲液中的溶解度高，提取效果好；

4）醇沉：在滤液中加入无水乙醇，滤液：乙醇 体积比为1:4.3。搅拌，静置，离心，取沉淀。高浓度乙醇能使辣木蛋白质沉淀的同时不会破坏辣木蛋白质的结构，不会影响其活性，通过醇沉能使辣木蛋白质得到初步纯化；

5）大孔树脂吸附纯化：将DA201-C树脂装柱、平衡后，将步骤4得到的沉淀置于柱头，进行梯度洗脱。梯度洗脱的洗脱时间，洗脱液，流速依次为：0~5min，无水乙醇，流速为0.25BV/h；5~10min，73%乙醇溶液+NaCl，流速为0.25BV/h；10~25min，超纯水，流速为0.25BV/h；25~35min，62%食用乙醇溶液+NaCl，流速为0.25BV/h，NaCl加入量为洗脱液质量的1/13000，乙醇溶液用超纯水作为溶剂。NaCl能够减小辣木蛋白质在水中的溶解度，提高蛋白质在大孔树脂上的挂枝率，吸附量增加，减少了辣木蛋白质的损失，提高了提取率。利用大孔树脂对不同极性的物质，吸附性能不同的性质，将辣木蛋白质与其他杂质分离开来。对得到的洗脱液用双缩脲试剂测试，将产生紫色反应的洗脱液合并；

6）超滤、干燥：将洗脱液旋蒸浓缩，超滤，先用18kDa的超滤膜超滤，取滤过液，再用7kDa的超滤膜过滤，取滞留液。超滤根据分子量大小对辣木蛋白进行纯化，现将分子量大于18kDa的杂质去除，再将分子量小于7kDa的杂质去除，同时可以达到去盐、浓缩的目的。将滞留液继续浓缩，冷冻干燥得到辣木蛋白质粉末。最后得到的辣木蛋白质纯度高，活性强，无溶剂残留，绿色安全，可应用于食品、医药、化妆品中。增加了辣木籽的经济附加值，为辣木籽的生产利用提供了一种新的途径。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于以下步骤：

1）预处理：将辣木籽晒干，去皮，得到白色内子，粉碎，过筛，得到辣木籽粉末；

2）脱脂：在辣木籽粉末中加入脱脂剂，回流提取，得到脱脂辣木籽粉末；

3）酶解、提取：在脱脂辣木籽粉末中加入蒸馏水和复合酶制剂，酶解结束后灭酶，调节pH加入Tris—HCl缓冲液，超声波助溶，过滤，取滤液；

4）醇沉：在滤液中加入乙醇，搅拌，静置，离心，取沉淀；

5）大孔树脂吸附纯化：将大孔树脂装柱、平衡后，将步骤4得到的沉淀置于柱头，进行梯度洗脱；

6）超滤、干燥：将洗脱液旋蒸浓缩，超滤，将滞留液继续浓缩，冷冻干燥得到辣木蛋白质粉末。

2.根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于：所述的步骤2中脱脂剂为石油醚-丙酮-乙醇混合液，石油醚：丙酮：乙醇体积比为1：（0.8~1.3）：（2~3），辣木籽粉：混合液体积比为1:15~19，回流温度为65~73℃，回流时间为45~63min，重复1~4次。

3.根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质4. 根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于：所述的步骤3中复合酶制剂成份及其重量份为：10~15份纤维素酶、8~12份木质素酶、3~5份果胶酶、0.003~0.005份天冬氨酸、0.2~0.6份硫酸镁、0.001~0.002份麦芽酚和0.3~0.6份磷酸二氢钙。

4.根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于：所述的步骤3中脱脂辣木籽粉末：蒸馏水质量体积比为1g：（4~6）mL，复合酶制剂加入量为0.001~0.003%。

5.根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于：所述的步骤3中酶解温度为45~50℃，pH为2.4~3.1，酶解时间为1.2~1.5h。

6.根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于：所述的步骤3中酶解液：Tris—HCl缓冲液的体积比为1:14~18，Tris—HCl缓冲液浓度为1.4~1.6 mol/L，pH为8.5~8.9，超声波功率为300~320W，超声时间为30~35min。

7.根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于：所述的步骤4中乙醇为无水乙醇，滤液：乙醇 体积比为1:4~4.6。

8.根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于：所述的步骤5中梯度洗脱的洗脱时间，洗脱液，流速依次为：0~5min，无水乙醇，流速为0.24~0.26BV/h；5~10min，70~75%乙醇溶液+NaCl，流速为0.24~0.26BV/h；10~25min，超纯水，流速为0.24~0.26BV/h；25~35min，60~70%食用乙醇溶液+NaCl，流速为0.24~0.26BV/h，NaCl加入量为洗脱液质量的1/12000~1/15000，乙醇溶液用超纯水作为溶剂。

9.根据权利要求1所述的一种辣木蛋白质高效提取的方法，其特征在于：所述的步骤6中先用15~20kDa的超滤膜超滤，取滤过液，再用4~8kDa的超滤膜过滤，取滞留液。