CN112250746A - 一种辣木籽球蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种辣木籽球蛋白的提取方法，以脱脂辣木籽粉为原料，通过蒸馏水浸提，冷冻离心，稀盐溶液复溶，茶多酚沉淀，透析脱盐，喷雾干燥联合处理，得到单一性纯度较高的辣木籽球蛋白，为研究辣木籽球蛋白功能、结构性质及实现工业化应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物蛋白质制备方法，具体是一种辣木籽球蛋白的提取方法。
背景技术
辣木籽蛋白是一种天然的植物蛋白质，具有良好的溶解性、乳化性、持水性、起泡性等特性，可期望用于肉制品、乳制品等多种食品的加工与品质改良。辣木籽蛋白含有丰富的氨基酸及适宜的氨基酸比例，具有降血压、降血脂、抗菌、抗病毒等作用，成为极具开发潜力的植物蛋白源。
球蛋白其多肽链盘绕形成立体结构，立体结构内的多肽链是通过氢键、二硫键、范德华力和疏水作用来维持空间结构的，其外形接近球状。在球状蛋白中，疏水性氨基酸比较容易远程接触，因此被折叠在内部，而亲水性氨基酸比较难形成远程接触，因此出现在外部。亲水性氨基酸和疏水性氨基酸在蛋白质分子结构稳定性上起着不同的作用。蛋白质晶体结构分析显示，球状蛋白质在三级结构上折叠成紧密的球状或椭球状，具有明显的折叠层次，在球状蛋白质内部含有较多的α-螺旋和β-折叠。
蛋白质在浓度低的盐溶液中溶解度增大，通过低浓度的盐溶液提取辣木籽蛋白。一方面，在盐溶液中存在的大量的正负离子会阻断蛋白质间正负电荷的相互吸引作用，从而使蛋白质溶于水中。另一方面，蛋白质在一定浓度的稀盐溶液中，其表面电荷增加，进而促进了蛋白质分子与水分子之间的相互作用，也增大了蛋白质在溶液中的溶解度。同时，在稀盐溶液中，盐离子与蛋白质有部分结合，这样的结合还能起到保护蛋白质的作用，使其不易变性。
蛋白质在浓度高的盐溶液中溶解度会降低，通过高浓度的盐溶液来沉淀辣木籽蛋白。一定浓度的茶多酚加入到蛋白质溶液中后，可夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质“失水”，破坏了蛋白质的胶体性质，蛋白质分子的疏水基团或是疏水部位之间由于疏水键的作用力就相互碰撞到一起，造成蛋白质胶粒凝结并沉淀析出的现象。另一方面，茶多酚与蛋白质通过疏水作用等非共价键进行结合，而由于各种蛋白分子颗粒大小、亲水程度不同，导致了蛋白分子之间性质的差异，因此结合不同性质的蛋白所需的茶多酚浓度不同，通过调整蛋白质溶液中茶多酚浓度可以达到对蛋白质进行沉淀的目的，沉淀需要的蛋白而将不需要的蛋白留在上清中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辣木籽球蛋白的提取方法，能够得到单一纯度较高的辣木籽球蛋白，使用的盐溶提取方法，其提取率>70％，沉淀率>42％，提取得到的辣木籽球蛋白其蛋白含量>90％。
本发明的目的通过如下技术方案实现。一种辣木籽球蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)蒸馏水浸提：将辣木籽打碎磨粉，过筛，以料液比1:2.5～4向辣木籽粉中加入正己烷脱脂，于室温下震荡2～3h，晾干后得到脱脂辣木籽粉；
(2)冷冻离心除去水溶性的清蛋白：将脱脂辣木籽粉按料液比1:20～30加入蒸馏水，于室温下磁力搅拌2～3h，离心，除去上清液；
(3)稀盐溶液复溶：将离心所得沉淀按料液比1:25～40溶于盐溶液，于室温下磁力搅拌2～3h，离心，上清液为辣木籽球蛋白提取液；
(4)茶多酚沉淀：将离心所得上清液加入茶多酚进行蛋白质沉淀，于室温下磁力搅拌2～3h，离心，取沉淀为辣木籽球蛋白；
(5)透析脱盐：将所得沉淀进行透析2～3天，后冻干得到辣木籽球蛋白粉；
(6)喷雾干燥：将脱盐后的辣木籽球蛋白喷雾干燥得到辣木籽球蛋白粉。
步骤(1)中辣木籽粉过80目筛，重复脱脂至上清液为无色，即为脱脂完全。
步骤(2)的离心速率为8000r，离心时间为30min，温度为4℃，重复2至3次。
步骤(3)所用盐溶液为0.6M的NaCl溶液，离心速率为8000r，离心时间为30min，温度为4℃。
步骤(4)用于沉淀的茶多酚浓度为2％，进行冰浴磁力搅拌，保持温度为0℃，离心速率为8000r，离心时间为30min，温度为4℃。
步骤(5)在透析时，每隔2h换一次水，检测透析水中无盐离子存在即为透析完成，透析时间为72h。
步骤(5)中所述透析脱盐用14000的透析袋，透析时间为72h。
步骤(6)中所述喷雾干燥为低温喷雾干燥。
本发明所述的液固比(liquid-said ratio)是水溶液质量与固体物料质量的比值。
除另有说明外，本发明所述的百分比均为质量百分比，各组分含量百分数之和为100％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)通过前期多次蒸馏水浸提的方式，除尽水溶性的清蛋白和其他杂质，提高了盐溶性球蛋白的单一程度。
(2)通过多次改变盐溶浓度和茶多酚浓度，沉淀出所需的单一程度较高的辣木籽球蛋白，优化出提取单一程度高的辣木籽球蛋白的条件。
(3)通过对提取方式的优化，得到了蛋白质含量较高，产量较大的辣木籽球蛋白，该方法可用于工业化制备较高纯度的辣木籽球蛋白。而以往的方法采用柱层析分离制备球蛋白，虽然有较高的纯度，但操作较为耗时，成本过高，不适合工业化生产。
(4)提取辣木籽球蛋白的蛋白提取率为70.33％，蛋白沉淀率为42.46％。
(5)提取得到的辣木籽球蛋白的含量为91.00％，提取得到的辣木籽球蛋白可用于消化性、毒理性等的研究及应用。
附图说明
图1是实施例1采用本发明所述的辣木籽球蛋白的提取方法提取得到的辣木籽球蛋白电镜图。
图2是实施例2采用本发明所述的辣木籽球蛋白的提取方法提取得到的辣木籽球蛋白电镜图。
图3是实施例3采用本发明所述的辣木籽球蛋白的提取方法提取得到的辣木籽球蛋白电镜图。
图4是对比例提取得到的辣木籽蛋白电镜图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
以下实施例中，蛋白质浓度测定方法如下：
考马斯亮蓝法：首先以牛血清蛋白为标品，用测定吸光度值法，绘制蛋白质浓度标准曲线。取0.1-0.5mL样品溶液，加入缓冲液补充至1mL，加入5.00mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置5min，于波长595nm下，测定吸光度值，同时取1mL缓冲液加入5.00mL考马斯亮蓝溶液做空白。根据标准曲线计算出蛋白质浓度。
凯氏定氮法：依据国家标准的方法，称取0.2g样品，加入0.1g硫酸铜，3g硫酸钾，10mL硫酸，放入消化炉中进行消化，消化完成后装入凯氏定氮装置进行凯氏定氮，以10mL硼酸溶液为接受液，甲基红和溴甲酚绿为混合指示剂，蒸馏10min，用0.05M HCl滴定，记录HCl用量。
实施例1
本发明所述的辣木籽球蛋白的提取方法，包括以下步骤：
(1)蒸馏水浸提：将辣木籽打碎磨粉，过80目筛，以料液比1:4向辣木籽粉中加入正己烷脱脂，于室温下震荡2.5h，晾干后得到脱脂辣木籽粉；
(2)冷冻离心：将蒸馏水浸提后的辣木籽粉溶液进行冷冻离心，离心速率为8000r，离心时间为30min，弃去上清，取沉淀；
(3)重复蒸馏水浸提：将离心后的沉淀按料液比为1:25再次溶于蒸馏水中，提取时间为2.5h，离心转速为8000r，离心时间为30min；
(3)稀盐溶液复溶：将离心得到的沉淀复溶于稀NaCl盐溶液中，NaCl溶液浓度为0.6mol/L，料液比1:40，提取时间2.5h，在离心转速为8000r，时间为30min进行离心，取上清液。并用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白质含量为1.76mg/mL；
(4)茶多酚沉淀：按照2％的茶多酚浓度，在上清蛋白溶液中加入茶多酚，保持整个沉淀过程处于0℃，沉淀时间3h，使辣木籽球蛋白沉淀，在离心速率为8000r，离心时间为30min，进行离心，取沉淀。同时用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白质浓度为0.75mg/mL；
(5)透析脱盐：将提取得到的辣木籽球蛋白进行透析脱盐处理，透析时间为72h，透析时每隔2h换一次水。
(6)喷雾干燥：将脱盐后的辣木籽球蛋白喷雾干燥48h得到辣木籽球蛋白粉存入干燥器备用。
(7)凯氏定氮法测定蛋白质含量：分别称取0.2g脱脂辣木籽粉和辣木籽球蛋白粉于消化管中消化，消化完成后装入凯氏定氮装置，完成后用0.05M HCl滴定，计算得脱脂辣木籽粉中蛋白质含量为500mg/g，辣木籽球蛋白粉的蛋白质含量为91.00％
本次实施例中提取辣木籽球蛋白的蛋白提取率为70.33％，蛋白沉淀率为42.46％，提取得到的辣木籽球蛋白的含量为91.00％。本次实施例提取得到的辣木籽球蛋白电镜图如图一所示。
实施例2
本发明所述的辣木籽球蛋白的提取方法，包括以下步骤：
(1)蒸馏水浸提：将辣木籽打碎磨粉，过80目筛，以料液比1:3向辣木籽粉中加入正己烷脱脂，于室温下震荡2.5h，晾干后得到脱脂辣木籽粉；
(2)冷冻离心：将蒸馏水浸提后的辣木籽粉溶液进行冷冻离心，离心速率为8000r，离心时间为30min，弃去上清，取沉淀；
(3)重复蒸馏水浸提：将离心后的沉淀按料液比为1:25再次溶于蒸馏水中，提取时间为2.5h，离心转速为8000r，离心时间为30min；
(3)稀盐溶液复溶：将离心得到的沉淀复溶于稀NaCl盐溶液中，NaCl溶液浓度为0.6mol/L，料液比1:30，提取时间2.5h，在离心转速为8000r，时间为30min进行离心，取上清液。并用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白质含量为1.73mg/mL；
(4)茶多酚沉淀：按照2％的茶多酚浓度，在上清蛋白溶液中加入茶多酚，保持整个沉淀过程处于0℃，沉淀时间2.5h，使辣木籽球蛋白沉淀，在离心速率为8000r，离心时间为30min，进行离心，取沉淀。同时用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白质浓度为0.70mg/mL；
(5)透析脱盐：将提取得到的辣木籽球蛋白进行透析脱盐处理，透析时间为72h，透析时每隔2h换一次水。
(6)喷雾干燥：将脱盐后的辣木籽球蛋白喷雾干燥得到辣木籽球蛋白粉存入干燥器备用。
(7)凯氏定氮法测定蛋白质含量：分别称取0.2g脱脂辣木籽粉和辣木籽球蛋白粉于消化管中消化，消化完成后装入凯氏定氮装置，完成后用0.05M HCl滴定，计算得脱脂辣木籽粉中蛋白质含量为500mg/g，辣木籽球蛋白粉的蛋白质含量为90.49％
本次实施例中提取辣木籽球蛋白的蛋白提取率为69.70％，蛋白沉淀率为43.05％，提取得到的辣木籽球蛋白的含量为90.49％。本次实施例提取得到的辣木籽球蛋白电镜图如图二所示。
实施例3
本发明所述的辣木籽球蛋白的提取方法，包括以下步骤：
(1)蒸馏水浸提：将辣木籽打碎磨粉，过80目筛，以料液比1:3向辣木籽粉中加入正己烷脱脂，于室温下震荡2.5h，晾干后得到脱脂辣木籽粉；
(2)冷冻离心：将蒸馏水浸提后的辣木籽粉溶液进行冷冻离心，离心速率为8000r，离心时间为30min，弃去上清，取沉淀；
(3)重复蒸馏水浸提：将离心后的沉淀按料液比为1:25再次溶于蒸馏水中，提取时间为2.5h，离心转速为8000r，离心时间为30min；
(3)稀盐溶液复溶：将离心得到的沉淀复溶于稀NaCl盐溶液中，NaCl溶液浓度为0.6mol/L，料液比1:25，提取时间2.5h，在离心转速为8000r，时间为30min进行离心，取上清液。并用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白质含量为1.70mg/mL；
(4)茶多酚沉淀：按照2％的茶多酚浓度，在上清蛋白溶液中加入茶多酚，保持整个沉淀过程处于0℃，沉淀时间2h，使辣木籽球蛋白沉淀，在离心速率为8000r，离心时间为30min，进行离心，取沉淀。同时用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白质浓度为0.71mg/mL；
(5)透析脱盐：将提取得到的辣木籽球蛋白进行透析脱盐处理，透析时间为72h，透析时每隔2h换一次水。
(6)喷雾干燥：将脱盐后的辣木籽球蛋白喷雾干燥得到辣木籽球蛋白粉存入干燥器备用。
(7)凯氏定氮法测定蛋白质含量：分别称取0.2g脱脂辣木籽粉和辣木籽球蛋白粉于消化管中消化，消化完成后装入凯氏定氮装置，完成后用0.05M HCl滴定，计算得脱脂辣木籽粉中蛋白质含量为500mg/g，辣木籽球蛋白粉的蛋白质含量为90.02％
本次实施例中提取辣木籽球蛋白的蛋白提取率为68.88％，蛋白沉淀率为41.70％，提取得到的辣木籽球蛋白的含量为90.02％。本次实施例提取得到的辣木籽球蛋白电镜图如图三所示。
对比例1
从辣木籽中提取辣木籽球蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)蒸馏水浸提：将辣木籽打碎、磨粉、过80目筛，正己烷脱脂后得到脱脂辣木籽粉，脱脂时，辣木籽粉与正己烷的料液比为1:3，浸提时，辣木籽粉与蒸馏水的料液比为1：25，提取时间为2.5h，温度为室温；
(2)冷冻离心：将蒸馏水浸提后的辣木籽粉溶液进行冷冻离心，在离心速率为8000r，离心时间为30min，进行离心，弃去上清，取沉淀；
(3)重复蒸馏水浸提：将离心后的沉淀再次溶于蒸馏水中，料液比1:25，提取时间为2.5h，离心转速为8000r，离心时间为30min；
(3)稀盐溶液复溶：将离心得到的沉淀复溶于稀NaCl盐溶液中，NaCl溶液浓度为0.4mol/L，料液比1:40，提取时间2.5h，并离心，离心转速为8000r，时间30min，取上清。并用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白质含量为1.80mg/mL；
(4)茶多酚沉淀：按照2％的浓度，在上清蛋白溶液中加入茶多酚，保持整个沉淀过程处于0℃，沉淀时间3h，使辣木籽球蛋白沉淀出来，在离心速率为8000r，离心时间为30min，进行离心，取沉淀。同时用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白质浓度为0.19mg/mL；
(5)透析脱盐：将提取得到的辣木籽球蛋白进行透析脱盐处理，透析时间为72h，透析时每隔2h换一次水。
(6)喷雾干燥：将脱盐后的辣木籽球蛋白喷雾干燥48h得到辣木籽球蛋白粉存入干燥器备用。
(7)凯氏定氮法测定蛋白质含量：分别称取0.2g脱脂辣木籽粉和辣木籽球蛋白粉于消化管中消化，消化完成后装入凯氏定氮装置，完成后用0.05M HCl滴定，计算得脱脂辣木籽粉中蛋白质含量为500mg/g，辣木籽球蛋白粉的蛋白质含量为93％。
本次对比例中提取辣木籽球蛋白的蛋白提取率为72.10％，蛋白沉淀率为11.32％，提取得到的辣木籽球蛋白的含量为93％，本次对比例提取得到的辣木籽蛋白电镜图如图2所示。
通过实施例1和对比例1可知，实施例和对比例的最大区别在于，实施例使用了较合适的盐溶浓度和茶多酚浓度，改变盐溶浓度和茶多酚浓度对蛋白质的提取率均有影响，但通过实施例1和对比例1的蛋白提取率和沉淀率的对比，对比例的优势不明显，而通过实施例1和对比例1提取得到的辣木籽蛋白的电镜图的对比，实施例1有较好辣木籽球蛋白度纯度，明显蛋白纯度更单一，仅有球状蛋白或近球状蛋白，而对比例提取得到的辣木籽蛋白不单一，除了目标球状蛋白，还含有大量片状、杆状、聚集状结构。
本发明通过蒸馏水浸提、盐溶液复溶、茶多酚沉淀、透析脱盐、喷雾干燥的方法，提取得到单一纯度较高的辣木籽球蛋白，为研究辣木籽球蛋白功能性质、结构性质及实现工业化应用奠定了基础。
Claims (8)
1.一种辣木籽球蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)蒸馏水浸提：将辣木籽打碎磨粉，过筛，以料液比1:2.5～4向辣木籽粉中加入正己烷脱脂，于室温下震荡2～3h，晾干后得到脱脂辣木籽粉；
(2)冷冻离心除去水溶性的清蛋白：将脱脂辣木籽粉按料液比1:20～30加入蒸馏水，于室温下磁力搅拌2～3h，离心，除去上清液；
(3)稀盐溶液复溶：将离心所得沉淀按料液比1:25～40溶于盐溶液，于室温下磁力搅拌2～3h，离心，上清液为辣木籽球蛋白提取液；
(4)茶多酚沉淀：将离心所得上清液加入茶多酚进行蛋白质沉淀，于室温下磁力搅拌3h，离心，取沉淀为辣木籽球蛋白；
(5)透析脱盐：将所得沉淀进行透析2～3天，后冻干得到辣木籽球蛋白粉；
(6)喷雾干燥：将脱盐后的辣木籽球蛋白喷雾干燥得到辣木籽球蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的辣木籽球蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(1)中辣木籽粉过80目筛，重复脱脂至上清液为无色，即为脱脂完全。
3.根据权利要求1所述的辣木籽球蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(2)的离心速率为8000r，离心时间为30min，温度为4℃，重复2至3次。
4.根据权利要求1所述的辣木籽球蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(3)所用盐溶液为0.6M的NaCl溶液，离心速率为8000r，离心时间为30min，温度为4℃。
5.根据权利要求1所述的辣木籽球蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(4)用于沉淀的茶多酚浓度为2％，进行冰浴磁力搅拌，保持温度为0℃，离心速率为8000r，离心时间为30min，温度为4℃。
6.根据权利要求1所述的辣木籽球蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(5)在透析时，每隔2h换一次水，检测透析水中无盐离子存在即为透析完成，透析时间为72h。
7.根据权利要求1所述的辣木籽球蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(5)中所述透析脱盐用14000的透析袋，透析时间为48～72h。
8.根据权利要求1所述的辣木籽球蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(6)中所述喷雾干燥为低温喷雾干燥。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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