CN113388656B - 一种碎米荠生物活性肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碎米荠生物活性肽，它是按以下方法制备得到：1)采用碱提酸沉法从碎米荠中提取蛋白；2)将提取的蛋白用水溶解成溶液，沸水浴后加入蛋白酶，调节pH为6.5‑8，在温度为40‑60℃的条件下酶解1‑5小时，加热灭活后离心，取上清液；3)将上清液用截留分子量为1‑10k的超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。本发明制备的产物对于DPPH自由基和ABTS自由基具有清除能力，并且硒含量很高，可用于制备抗氧化食品添加剂或含硒的膳食补充剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性肽，尤其是一种碎米荠生物活性肽，本发明还涉及其用途。
背景技术
自由基与内源性抗氧化系统之间的不平衡会引起细胞氧化应激，损伤细胞的各种成分，如DNA、蛋白质、脂质等。同时，氧化损伤也会导致多种慢性疾病，包括糖尿病、阿尔兹海默症、关节炎、心脏病和癌症等，而摄入富含抗氧化成分的膳食可一定程度上降低上述疾病发生的概率。目前，已有报道抗氧化肽应用于促进健康的食品补充剂和防腐剂，并有精选的生物活性肽经过临床试验进一步开发成缓解病症的治疗药物。
抗氧化肽来源广泛，其中合成抗氧化肽有着成本高、潜在毒性大等劣势，而随着生活水平的提高以及消费者消费观念的改变，安全、健康、高效益来源的抗氧化肽备受关注，而植物源抗氧化肽具备环保、可持续、成本低、毒副作用小的特点，是抗氧化膳食补充剂或药物的可发展资源。
碎米荠是生长于湖北恩施州地区的一种高富硒植物，不仅硒含量高，营养成分众多，是抗氧化化合物优质的植物资源，而且可以药食两用，其幼嫩茎叶可作蔬菜食用，也可用作药物以止咳喘、活血等。并且在2021年，国家卫健委批复堇叶碎米荠成为新型食品原料。因此，碎米荠具有极高的药理作用和开发价值，是未来医药行业和食品领域的研究热点，然而目前仅有少数研究报告了其特定的生化组成，对其活性成分、结构组成及相关功能报道较少。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种碎米荠生物活性肽，本发明的第二个目的是提供所述碎米荠生物活性肽的用途。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种碎米荠生物活性肽，是按以下方法制备得到：
1)采用碱提酸沉法从碎米荠中提取蛋白；
2)将步骤1)提取的蛋白用水溶解成浓度为1-6％的蛋白溶液，沸水浴10-30min后按蛋白重量的0.5-5％向溶液中加入蛋白酶，调节pH为6.5-8，在温度为40-60℃的条件下酶解1-5小时，加热灭活后离心，取上清液；
3)将步骤2)的上清液用截留分子量为1-10kDa的超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。
优选地，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
优选地，所述蛋白溶液的浓度为3-5％。
优选地，所述蛋白酶的加入量为蛋白重量的1-2％。
优选地，所述酶解时间为1-2小时。
进一步优选地，所述蛋白溶液的浓度为4％，所述蛋白酶的加入量为蛋白重量的1％，所述酶解时间为1小时。
优选地，所述碱提酸沉法的具体步骤为：将碎米荠植株粉碎过筛，加入0.05-0.2mol/L的氢氧化钠溶液，在温度为50-70℃的条件下浸提1-4次，每次1-5小时，将浸提液离心后用HCl溶液调节pH至3-5，静置后再次离心，将沉淀冷冻干燥即为碎米荠蛋白。
优选地，所述超滤膜的截留分子量为1kDa。
本发明制备的碎米荠生物活性肽对于DPPH自由基和ABTS自由基具有清除能力，其半数抑制率分别可达到0.435mg/mL和0.399mg/mL，并且该碎米荠抗氧化肽的硒含量高达362.378mg/kg，包含85条含硒肽段，其中SeM占硒代氨基酸总量的50.57％，SeC占硒代氨基酸总量的49.43％。因此可用来制备抗氧化食品添加剂或用来制备硒的膳食补充剂。
本发明提供的碎米荠抗氧化肽还具备水解度高，分子量小和易吸收等优点。
附图说明
图1是不同酶对碎米荠蛋白DPPH、ABTS清除率和水解度DH的影响。
图2是底物浓度对碎米荠蛋白DPPH和ABTS清除率的影响。
图3是酶解时间对碎米荠蛋白DPPH和ABTS清除率的影响。
图4是加酶量对碎米荠蛋白DPPH和ABTS清除率的影响。
图5是碎米荠肽的分子量大小对硒含量和DPPH、ABTS半数抑制率的影响。
图6是碎米荠抗氧化肽的总离子流图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
以下各实施例中，DPPH、ABTS清除率和硒含量测定的方法如下：
(1)溶液的配制
DPPH无水乙醇溶液(0.1mmol/L)：准确称取39.432mg DPPH，用无水乙醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中，配成10mmol/L的溶液，冷藏放置，用时用无水乙醇稀释100倍制成0.1mmol/L的溶液。
ABTS溶液(7mmol/L)：准确称取38.408mgABTS，用超纯水溶解并定容至10mL。
过硫酸铵溶液(2.45mmol/L)：准确称取66.284mg过硫酸铵，用超纯水溶解并定容至10mL，配成24.5mmol/L的溶液，用时用超纯水稀释10倍制成2.45mmol/L的溶液。
(2)DPPH自由基清除率的测定
样品溶于超纯水中得到2mg/mL的样品溶液。取100μLDPPH无水乙醇溶液，分别加入100μL超纯水和100μL样品溶液，另取100μLDPPH无水乙醇溶液，加入100μL样品，每个做3个平行，将每种混合液均加至96孔酶标板中，在室温下避光静置30min，随后在517nm处测其吸光值。
其中，A1：样品液与DPPH无水乙醇溶液混合液的吸光值；A2：样品液与无水乙醇混合液的吸光值；A0：DPPH无水乙醇与超纯水混合液的吸光值。
(3)ABTS自由基清除率的测定
样品溶于超纯水中得到2mg/mL的样品溶液。将ABTS和过硫酸铵溶液等体积混合，避光放置12-16h后用PBS对该混合液稀释20倍后使用。依次在96孔板内加入20μL样品溶液和200μL稀释液，30℃下孵育6min，随后在734nm下测其吸光值，以PBS作为空白对照，每个样品做3个平行。
(4)硒含量的测定
采用氢化物发生-荧光光谱法(HG-AFS)，参考GB/T 21729-2008。
实施例1：碎米荠蛋白的提取
将干燥的碎米荠植株粉碎，过80目筛，取40g碎米荠粉末，加入1800mL 0.1mol/LNaOH溶液，在60℃的条件下浸提2次，每次3h，将提取液在38000r/min转速下离心，用HCl调节上清液pH至4.0，静置后再次离心，沉淀冷冻干燥后即为碎米荠蛋白。
实施例2：酶的筛选
(1)取4g碎米荠蛋白，加入100mL去离子水，沸水浴加热40min。
(2)加1mol/L NaOH调至各酶最适pH值，在各酶的最适温度下加入蛋白酶，记录水解过程中NaOH的体积消耗量。
(3)酶解3h后，取出灭酶10min，冷却至室温后再次离心，上清液即为碎米荠蛋白的酶解液，冷冻干燥后备用。
(4)测定不同酶作用下碎米荠酶解物的硒含量，并将冻干后的碎米荠蛋白酶解物溶解，测定不同酶作用下碎米荠蛋白酶解液的DPPH、ABTS自由基清除率，比较各个酶对碎米荠蛋白清除自由基能力的影响。
如图1所示，从水解度来看，碱性蛋白酶的水解度最高，为15.58％，木瓜蛋白酶水解度最低，仅为1.10％；从DPPH自由基清除能力来看，碱性蛋白酶的清除率最高，为84.86％，中性蛋白酶的清除能力最差；从ABTS自由基能力来看，碱性蛋白酶的清除率最高，为67.16％，木瓜蛋白酶最差。综上，选取碱性蛋白酶来制备碎米荠抗氧化肽是最合适的。
实施例3：碎米荠抗氧化肽制备单因素试验
确定好最佳用酶后，通过单因素试验，考察不同底物浓度(w/w)、不同酶添加量(w/w)、不同酶解时间对碎米荠蛋白DPPH、ABTS自由基清除率以及硒含量的影响。具体实施如下：
(1)将碎米荠蛋白加入到去离子水中形成一定浓度的蛋白溶液，沸水浴30min使碎米荠蛋白的一级结构断裂。
(2)调节碎米荠蛋白溶液的pH值至8.0，温度为55℃，按照不同酶底比加入碱性蛋白酶，在酶解过程中加入1mol/L NaOH使酶解pH恒为8.0，并记录水解过程中消耗NaOH的体积。
(3)酶解一定时间后，灭酶10min，冷却后离心20min，上清液即为碎米荠蛋白的酶解液，冷冻干燥后备用。
(4)以DPPH、ABTS自由基清除率为主要指标，硒含量为辅，从而确定碎米荠蛋白的酶解条件。
由图2可知，当底物浓度为4％时，其自由基清除率最高。当底物浓度处于2-3％时，自由基清除率逐渐升高，当底物浓度大于4％后，自由基清除率逐渐降低并最终趋于平缓。因此底物浓度为4％时能使碎米荠肽呈现出更好的抗氧化效果。
由图3可知，随着水解时间的增加，蛋白酶的作用时间越长，水解度越高，但碎米荠蛋白酶解物的自由基清除率却有所降低，故而选择1h作为最佳的酶解时间。
由图4可知，加酶量在0.5-5％这个范围内，碎米荠蛋白酶解物自由基清除能力变化不大，而加酶量为1％时，自由基清除率最高，故而酶解的加酶量选择1％最佳。
实施例4：碎米荠蛋白酶解液的分级
(1)按实施例3方法得到碎米荠蛋白酶解液。
(2)蛋白酶解液分别过截留分子量为5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行膜分离，最终得到三种不同级分的酶解液。
(3)测定三种级分的硒含量以及DPPH、ABTS自由基的清除率，比较不同级分碎米荠肽的硒含量及抗氧化能力。
由图5可知，经膜分离后的碎米荠肽的抗氧化能力和硒含量均有所提高。虽然在三种级分中，分子量<3kDa的级分对DPPH自由基的清除能力最佳(IC50＝0.416mg/mL)，但与分子量<1kDa的级分对DPPH自由基清除能力并无显著差异(p<0.05)，并且分子量<1kDa的级分对ABTS自由基的清除能力最佳(IC50＝0.399mg/mL)。三种级分的碎米荠肽的硒含量随着分子量的减小而增加，但三种级分之间的硒含量并无显著性差异(p<0.05)。因此，分子量<1kDa级分的碎米荠肽更适合应用于抗氧化产品和/或硒膳食补充剂的制备。
采用液质联用(UPLC-ESI-MS/MS)对分子量低于1kDa的碎米荠肽进行结构鉴定。UPLC条件：色谱柱：Accucore 100*2.1mm,2.6μm；流动相A：0.1％甲酸-乙腈；B：0.1％甲酸水溶液。质谱条件：离子源ESI+MS，喷雾电压3800V，毛细管温度275℃。借助Xcalibur软件对液质结果进行解析，通过与UniPort蛋白数据库中碎米属蛋白序列比对，吻合度为100％的含硒肽段共85条，经计算，85条含硒肽段中共有硒肽氨基酸87个，其中SeM44个，SeC43个，各占硒代氨基酸总量的50.57％、49.43％。
实施例5
(1)将干燥的碎米荠植株粉碎，过80目筛，取40g碎米荠粉末，加入1500mL0.15mol/L NaOH溶液，在50℃的条件下浸提两次，每次3h，提取液离心，用HCl调节上清液pH至5.0，静置后再次离心，沉淀冷冻干燥得碎米荠蛋白。
(2)将步骤1)提取的蛋白用水溶解成浓度为4％的蛋白溶液，沸水浴30min后按蛋白重量的1％向溶液中加入碱性蛋白酶，调节pH为7.0，在温度为50℃的条件下酶解1小时，加热灭活后离心，取上清液；
(3)将步骤2)的上清液用截留分子量为1k的超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。
实施例6
(1)将干燥的碎米荠植株粉碎，过80目筛，取40g碎米荠粉末，加入2500mL0.08mol/L NaOH溶液，在55℃的条件下浸提三次，每次2h，提取液离心，用HCl调节上清液pH至3.5，静置后再次离心，沉淀冷冻干燥得碎米荠蛋白。
(2)将步骤1)提取的蛋白用水溶解成浓度为4％的蛋白溶液，沸水浴30min后按蛋白重量的1％向溶液中加入碱性蛋白酶，调节pH为6.5，在温度为60℃的条件下酶解1小时，加热灭活后离心，取上清液；
(3)将步骤2)的上清液用截留分子量为1k的超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。
实施例7
(1)将干燥的碎米荠植株粉碎，过80目筛，取40g碎米荠粉末，加入2200mL0.12mol/L NaOH溶液，在60℃的条件下浸提四次，每次1h，提取液离心，用1mol/L的HCl调节上清液pH至4.0，静置后再次离心，沉淀冷冻干燥得碎米荠蛋白。
(2)将步骤1)提取的蛋白用水溶解成浓度为4％的蛋白溶液，沸水浴30min后按蛋白重量的1％向溶液中加入碱性蛋白酶，调节pH为8.0，在温度为55℃的条件下酶解1小时，加热灭活后离心，取上清液；
(3)将步骤2)的上清液用截留分子量为1k的超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。
实施例5、6、7中，40g原料碎米荠，共得到产物肽分别为1.75g、1.63g、1.89g，实施例7的产率更高。
Claims (1)
1.一种碎米荠抗氧化生物活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将干燥的碎米荠植株粉碎，过80目筛，取40g碎米荠粉末，加入2200mL0.12mol/LNaOH溶液，在60℃的条件下浸提四次，每次1h，提取液离心，用1mol/L的HCl调节上清液pH至4.0，静置后再次离心，沉淀冷冻干燥得碎米荠蛋白。
(2)将步骤1)提取的蛋白用水溶解成浓度为4％的蛋白溶液，沸水浴30min后按蛋白重量的1％向溶液中加入碱性蛋白酶，调节pH为8.0，在温度为55℃的条件下酶解1小时，加热灭活后离心，取上清液；
(3)将步骤2)的上清液用截留分子量为1k的超滤膜过滤，冻干后即为生物活性肽。
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