CN112479881B - 一种朝鲜蓟提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种朝鲜蓟提取物的制备方法。本发明可从朝鲜蓟中，首先将绿原酸从菜蓟苦素和木犀草素的混合体系中分离出来，再通过简单的pH调节，将菜蓟苦素和木犀草素分离，最终同时分离提取出了绿原酸、菜蓟苦素和木犀草素。本发明充分利用了朝鲜蓟中的有效成分，提高了朝鲜蓟的综合开发水平，具有良好的经济和社会效益。其中绿原酸提取率≥92.31％，纯度≥93.05％，菜蓟苦素提取率≥83.25％，纯度≥90.10％，木犀草素提取率≥84.98％，纯度≥94.25％。

Description

一种朝鲜蓟提取物的制备方法
技术领域
本发明属于植物提取领域，具体涉及一种朝鲜蓟提取物的制备方法。
背景技术
朝鲜蓟作为一种多年生草药，早在古罗马时期就被用作保肝和治疗消化不良，近年来朝鲜蓟的种植面积也在不断扩大。朝鲜蓟的可食用部分主要为未开放的花蕾、花托和花苞基部，而作为副产品的叶片则被废弃或作为饲料。
研究表明，朝鲜蓟，甚至常常废弃的朝鲜蓟叶片中含有大量具有药用价值的酚类化合物和苦味成分，例如每克朝鲜蓟叶中，含有0.35～18.34mg绿原酸、0.04～10.65mg的木犀草素和0.06～22.6mg的菜蓟苦素。其中绿原酸具有抗菌，消炎，利胆，利尿，降脂，降压，抗氧化，抗肿瘤等作用；木犀草素具有抗肿瘤、心脏保护作用、呼吸系统影响、免疫调节、抗炎等作用；菜蓟苦素具有抗痉挛、促凋亡、抗炎等作用。
已有技术公开了以金银花为原料同时分离提取绿原酸和木犀草素，或者以花生壳为原料单独提取木犀草素。也有技术公开了以朝鲜蓟为原料单独提取纯化绿原酸或菜蓟苦素；或同时分离提取木犀草素和菜蓟苦素。
综上，常用技术中，未同时分离提取绿原酸、菜蓟苦素和木犀草素；对朝鲜蓟的提取利用也仅限于绿原酸、菜蓟苦素和木犀草素中的一种或两种，这造成了朝鲜蓟原料的浪费，也制约了朝鲜蓟的进一步发展。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种朝鲜蓟提取物的制备方法。
一种朝鲜蓟提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1.采用酸性乙醇水溶液提取朝鲜蓟原料，过滤后得提取液；
S2.将所述提取液过非极性树脂，并依次用酸性水、乙醇水溶液a进行洗脱，收集酸性水洗脱液，得纯化液A1，收集乙醇水洗脱液，得纯化液B1；
S3.将所述纯化液A1过非极性树脂，并依次用纯水、乙醇水溶液b进行洗脱，收集乙醇水洗脱液，得纯化液A2；
S4.将所述纯化液A2减压浓缩后，加入乙醇水溶液c，搅拌并冷却结晶，晶体干燥后，即为绿原酸；
S5.将所述纯化液B1减压浓缩后，调节pH至碱性，固液分离，分别收集固体和上清液，所述固体为粗品菜蓟苦素；
S6.将所述粗品菜蓟苦素以乙醇水溶液d溶解，冷却结晶，晶体干燥后即为菜蓟苦素；
S7.调节所述上清液pH至酸性，静置后固液分离，收集渣，所述渣水洗至中性后，得粗品木犀草素；
S8.以乙醇水溶液e溶解所述粗品木犀草素，冷却结晶，晶体干燥后即为木犀草素。
根据本发明的一种实施方式，步骤S1中，所述朝鲜蓟原料为朝鲜蓟叶、花蕾、叶柄中的至少一种。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S1中，所述朝鲜蓟原料为朝鲜蓟叶粉，粒径为5～40目。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S1中，所述朝鲜蓟原料为朝鲜蓟叶粉，粒径为5～10目。
所述朝鲜蓟叶粉，粒径为5～40目，可增大朝鲜蓟叶粉与所述酸性乙醇水溶液的接触面积，提升朝鲜蓟叶有效成分的充分提取。
根据本发明的一种实施方式，步骤S1中，所述提取，为连续逆流超声提取，超声功率为200～400W，频率为25～40kHz。
根据本发明的一种实施方式，步骤S1中，所述提取，温度为20～65℃。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S1中，所述提取，温度为30～55℃。
根据本发明的一种实施方式，步骤S1中，所述提取，时间为20～40min。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S1中，所述提取，时间为30min。
根据本发明的一种实施方式，步骤S1中，所述酸性乙醇水溶液，pH为4～6，乙醇的体积浓度为40～60％。
根据本发明的一种实施方式，步骤S1中，所述酸性乙醇水溶液，添加量为：每克朝鲜蓟原料，添加6～10ml所述酸性乙醇水溶液。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S1中，所述酸性乙醇水溶液，添加量为：每克朝鲜蓟原料，添加8ml所述酸性乙醇水溶液。
根据本发明的一种实施方式，步骤S1中，所述过滤，为压滤或抽滤中的一种。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S1中，所述过滤，为板框过滤。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，所述非极性树脂，为D101型大孔非极性树脂。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，所述酸性水，pH为5～6。
由于绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚，因此，步骤S1采用酸性乙醇溶液提取，步骤S2采用酸性水洗脱，目的是保护绿原酸，防止绿原酸水解。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，所述乙醇水溶液a，乙醇的体积浓度为50～80％。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S2中，所述乙醇水溶液a，乙醇的体积浓度为70％。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，所述纯化液A1，主要成分为绿原酸。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，所述纯化液B1，主要成分为木犀草素和菜蓟苦素。
25℃水中，溶解度为4％，而木犀草素和菜蓟苦素仅微溶于水，因此纯水洗脱可将绿原酸分离出来。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，所述提取液，以0.5～1.5BV/h的流速过非极性树脂。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，所述乙醇水溶液a和所述酸性水，均以0.5～1.5BV/h的流速进行洗脱。
根据本发明的一种实施方式，步骤S3中，所述非极性树脂为AB-8型大孔非极性树脂。
根据本发明的一种实施方式，步骤S3中，所述乙醇水溶液b，乙醇的体积浓度为40～60％。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S3中，所述乙醇水溶液b，乙醇的体积浓度为40％。
根据本发明的一种实施方式，步骤S3中，所述纯化液A1，以1.5～2.5BV/h的流速过非极性树脂。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S3中，所述纯化液A1，以2BV/h的流速过非极性树脂。
根据本发明的一种实施方式，步骤S3中，所述乙醇水溶液b和所述纯水，均以1.5～2.5BV/h的流速进行洗脱。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S3中，所述乙醇水溶液b和所述纯水，均以2BV/h的流速进行洗脱。
绿原酸与D101型大孔非极性树脂的结合强度，小于与AB-8型大孔非极性树脂的结合强度。
根据本发明的一种实施方式，步骤S4中，所述乙醇水溶液c，乙醇体积浓度为85～95％。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S4中，所述乙醇水溶液c，乙醇体积浓度为90％。
根据本发明的一种实施方式，步骤S4中，所述乙醇水溶液c，加入后，体系乙醇体积浓度为75～85％，固体与液体质量比为1:1～1:5。
绿原酸在乙醇-水混合体系中的溶解度：当乙醇体积浓度小于60％时，随乙醇浓度提高而提高，当乙醇浓度大于60％时，随乙醇浓度提高而降低。因此在步骤S2中，可以用酸性水将绿原酸洗脱下来；步骤S3中可以以水洗脱，除去绿原酸中水溶性杂质；步骤S4中，可以调节乙醇体积浓度为75～85％，使绿原酸析出。
根据本发明的一种实施方式，步骤S5中，所述碱性，pH为8～10。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S5中，所述碱性，pH为9。
根据本发明的一种实施方式，步骤S5中，所述调节pH，试剂为1M氢氧化钠水溶液。
根据本发明的一种实施方式，步骤S5中，所述固液分离，方法为离心或过滤。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S5中，所述固液分离，方法为离心。
木犀草素为黄酮类化合物，具有内酯环结构，碱性条件下可水解开环，在酸性条件下又闭环恢复；而菜蓟苦素为愈创木烷类倍半萜类化合物，无内酯环结构。因此步骤S5可以通过调节pH，将木犀草素和菜蓟苦素分离。
根据本发明的一种实施方式，所述减压浓缩，浓缩至无醇味时停止。
根据本发明的一种实施方式，所述无醇味，是以酒精计检测体系酒精度，测试值约为0。
根据本发明的一种实施方式，步骤S6中，所述乙醇水溶液d，乙醇浓度为55～65％，添加质量与所述粗品菜蓟苦素的质量比为1:1～5:1。
根据本发明的一种实施方式，步骤S7中，所述酸性，pH为3～6。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S7中，所述酸性，pH为3～4。
根据本发明的一种实施方式，步骤S7中，所述pH，调节试剂为稀盐酸、柠檬酸或维生素C中的至少一种。
根据本发明的一种优选的实施方式，步骤S7中，所述pH，调节试剂为稀盐酸。
根据本发明的一种实施方式，步骤S7中，所述静置，时间为25～35min。
根据本发明的一种实施方式，步骤S7中，所述固液分离，方法为过滤或离心。
根据本发明的一种实施方式，步骤S8中，所述乙醇水溶液e，乙醇浓度为85～95％，添加质量与所述粗品木犀草素的质量比为1:1～5:1。
根据本发明的一种实施方式，所述冷却结晶，温度为-10～5℃。
根据本发明的一种优选的实施方式，所述冷却结晶，温度为-5～0℃。
本发明所用大孔非极性树脂均可重生、循环利用，具体重生方法为：首先以蒸馏水淋洗树脂层至无醇味，然后以1～2BV/h的流速，用4％质量浓度的氢氧化钠溶液淋洗树脂层，最后以2～3BV/h的流速，用蒸馏水淋洗树脂层至中性。
本发明所用乙醇均可通过减压浓缩操作进行蒸出回收。
本发明所提供的方法，还可以金银花、花生壳等为原料，进行绿原酸、菜蓟苦素、木犀草素的同时分离提取。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明从朝鲜蓟原料中，同时分离提取出了绿原酸、菜蓟苦素和木犀草素，充分利用了朝鲜蓟的有效成分，提高了朝鲜蓟的综合开发水平，具有良好的经济和社会效益。
(2)本发明提供的制备方法，绿原酸提取率≥92.31％，纯度≥93.05％，菜蓟苦素提取率≥83.25％，纯度≥90.10％，木犀草素提取率≥84.98％，纯度≥94.25％。
(3)本发明提供的制备方法，用到的主要试剂为乙醇、水和酸碱调节剂，生产过程无毒性挥发物，安全性高。
(4)本发明中，朝鲜蓟原料提取温度＜65℃，减免了朝鲜蓟原料中有效成分的破坏、变性；较低的提取温度，节约了能源。
(5)本发明中，朝鲜蓟的提取中，溶剂用量少，可大幅缩短提取和浓缩时间。
(6)工艺过程简单，该工艺过程中所用的树脂、溶剂均可以重复使用，工艺成本很低，适合工业化生产。
附图说明
图1是本发明的流程示意图。
图2是实施例1所得绿原酸的高效液相色谱图。
图3是实施例1所得木犀草素的高效液相色谱图。
图4是实施例1所得菜蓟苦素的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本实施例提供一种朝鲜叶提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.取1000g干燥的朝鲜蓟叶粉碎，取10目筛下物1000g；
S2.在40℃下，以8000ml的酸性乙醇水溶液(乙醇体积浓度为50％，pH＝5)连续逆流超声提取步骤S1所得1000g筛下物30min，其中超声功率为200W，频率为25kHz，提取后过滤，得提取液；
S3.将所述提取液以1BV/h的流速，过D101型大孔非极性树脂，并以1BV/h的流速依次用pH＝5.5的酸性水、体积浓度为70％的乙醇水溶液洗脱，收集酸性水洗脱液，和乙醇水洗脱液；
S4.将所述酸性水洗脱液以2BV/h流速过AB-8型大孔非极性树脂，并以2BV/h的流速依次用纯水、体积浓度为40％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水洗脱液；
S5.减压浓缩步骤S4所得乙醇水洗脱液至无醇味，之后加入体积浓度为90％乙醇水溶液，使乙醇体积浓度为85％，体系固液重量比为1:3，于-5℃下冷却结晶，过滤，晶体干燥后，得到绿原酸。
S6.减压浓缩步骤S3得乙醇水洗脱液至无醇味，调节pH＝9后离心，分别收集固体和上清液；
S7.以体积浓度为60％的乙醇水溶液溶解步骤S6所得固体，其中乙醇水溶液的质量是固体质量的3倍，于-5℃下冷却结晶，过滤，晶体干燥后，得菜蓟苦素；
S8.调节步骤S6所得上清液pH＝3.5，静置30min后过滤，滤渣水洗至中性后，得粗品木犀草素；
S9.以体积浓度为90％的乙醇水溶液溶解粗品木犀草素，其中乙醇水溶液的质量是固体质量的3倍，于-5℃下冷却结晶，过滤，晶体干燥后，得木犀草素。
本发明的流程示意图如图1所示。
实施例2
本实施例提供一种朝鲜叶提取物的制备方法，具体步骤与实施例1的区别是：
步骤S2中，在50℃下，连续逆流超声提取。
实施例3
本实施例提供一种朝鲜叶提取物的制备方法，具体步骤与实施例1的区别是：
步骤S2中，在60℃下，连续逆流超声提取。
对比例1
本对比例提供一种朝鲜叶提取物的制备方法，具体步骤与实施例1的区别是：
步骤S2中，乙醇体积浓度为70％，未调节pH。
对比例2
本对比例提供一种朝鲜叶提取物的制备方法，具体步骤与实施例1的区别是：
步骤S5中，固液重量比为1:6；
步骤S7中，乙醇水溶液的质量是固体质量的6倍；
步骤S9中，乙醇水溶液的质量是固体质量的6倍。
对比例3
本对比例提供一种朝鲜叶提取物的制备方法，具体步骤与实施例1的区别是：
步骤S5中，于8℃下冷却结晶。
步骤S7中，于8℃下冷却结晶。
步骤S9中，于8℃下冷却结晶。
测试例
本例检测了实施例1～3和对比例1，步骤S2所得提取液中，绿原酸、菜蓟苦素以及木犀草素的含量及提取率；以及实施例1、对比例2～3中，产物绿原酸、木犀草素和菜蓟苦素的纯度。具体的测试方法为：以HPLC法，首先检测绿原酸、木犀草素和菜蓟苦素的标准对照液，再测试步骤S2所得提取液配置的测试液，或三种产物分别配置的样品液，最后以标准对照法进行计算可得相应结果。
测试方法
标准对照液配置方法：
绿原酸：称取2～3mg绿原酸对照品，以体积浓度为50％的甲醇水溶液定容至25ml，并过0.45μm滤膜，记录称量质量。
木犀草素/菜蓟苦素：称取2～3mg绿原酸木犀草素或菜蓟苦素对照品，以甲醇定容至25ml，得木犀草素或菜蓟苦素的对照液，并过0.45μm滤膜，记录称量质量。
步骤S2所得提取液配置测试液的方法：
采用移液管移取5-10mL提取液，以体积浓度为50％的甲醇水溶液定容至25ml，并过0.45μm滤膜。记录移取提取液的体积。
样品液的配置方法：
绿原酸：称取2～3mg绿原酸实施例样品，以体积浓度为50％的甲醇水溶液定容至25ml，并过0.45μm滤膜，记录称量质量。
木犀草素/菜蓟苦素：称取2～3mg绿原酸木犀草素或菜蓟苦素样品，以甲醇定容至25ml，并过0.45μm滤膜，得木犀草素或菜蓟苦素的样品液，记录称量质量。
不同成分的测试条件如表1所示。
表1 不同成分的检测条件。
Figure BDA0002785966250000091
步骤S2所得提取液中，有效成分含量计算如式(1)所示：
含量％＝A测×ρ提取液×V提取液×1000×V测×K/(A对×W对×V对)×N×100％ (1)。
步骤S2所得提取液中，各成分提取率的计算如式(2)所示：
提取率％＝含量％×ρ提取液×V提取液/(原料含量％×W原料)×100％ (2)。
其中，A测表示测试测试液时，样品显示的峰面积；
A对表示测试对照液时，对照品显示的峰面积；
ρ提取液表示提取液密度，单位为g/mL；
V提取液表示量取的提取液体积，单位为mL；
W对表示配置对照液时，称取对照品的质量，单位为mg；
V测表示配置的样品液的体积，本测试例中，V样＝25ml；
V对表示配置的对照液的体积，本测试例中，V对＝25ml；
W原料表示原料质量。
K表示对照品的纯度。
N表示提取液稀释倍数。
产物纯度的计算公式如式(3)所示：
纯度％＝A样×W对×V样×K/(A对×W样×V对)×100％ (3)。
其中，A样表示测试样品液时，样品显示的峰面积；
A对表示测试对照液是，对照品显示的峰面积；
V样表示配置的样品液的体积，本测试例中，V样＝25ml。
为确保实验的精确度，本测试例中，各样品的纯度均为2次测试的平均值。
测试结果
依照式(1)～(2)的计算方法，步骤S2所得提取液中，三种有效物质的含量及提取率测试结果如表2所示。
表2 提取液中绿原酸、木犀草素和菜蓟苦素的含量及提取率测试结果。
实施例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
绿原酸含量/％ 6.48 6.37 6.32 5.50
木犀草素含量/％ 3.45 3.40 3.41 3.12
菜蓟苦素含量/％ 7.51 7.36 7.43 7.11
绿原酸提取率/％ 92.50 92.42 92.31 83.43
木犀草素提取率/％ 85.54 85.00 84.98 83.42
菜蓟苦素提取率/％ 83.45 83.31 83.25 82.51
表2结果说明，在本发明提供的参数范围内(实施例1～3)，变化连续逆流超声提取的温度，基本不影响三种有效成分的提取率，其中绿原酸提取率≥92.31％，木犀草素提取率≥84.98％，菜蓟苦素提取率≥83.25％。但是若乙醇水溶液未调节pH，则在提取过程中会破坏绿原酸的结构，进而使其提取率降低至83.43％，降幅约9％，同时也会降低另两种有效成分的提取率，使木犀草素的提取率至83.42％，菜蓟苦素的提取率低至82.51％。
实施例1中，所得绿原酸的高效液相色谱图如图2所示，木犀草素的高效液相色谱图如图3所示，菜蓟苦素的高效液相色谱图如图4所示。
依照式(3)的计算方法，产物绿原酸、木犀草素和菜蓟苦素纯度的测试结果如表3所示。
表3 产物绿原酸、木犀草素和菜蓟苦素纯度的测试结果。
实施例 实施例1 实施例1a 实施例1b 实施例1c 对比例2 对比例3
绿原酸/％ 93.08 93.15 93.15 93.05 90.89％ 86.89％
木犀草素 95.10 95.03 94.81 94.25 92.12％ 87.49％
菜蓟苦素 90.24 90.33 90.12 90.10 88.13％ 81.66％
其中实施例1a～1c是实施例1的平行试验，从上述四组试验结果可知，(1)本发明提供的实施方案具有良好的可重复性；(2)在本发明提供的实施参数范围内，产物绿原酸纯度≥93.05％，木犀草素纯度≥94.25％，菜蓟苦素纯度≥90.10％。
由对比例2所得试验结果可知，若在降温重结晶前固液重量比为1:6，产物纯度分别为：绿原酸90.89％，木犀草素92.12％，菜蓟苦素88.13％，略低于固液重量比为1:3时的产物纯度。由对比例3所得实验结果可知，若重结晶温度为8℃，产品纯度分别为：绿原酸86.89％，木犀草素87.49％，菜蓟苦素81.66％，各产物纯度大幅降低。
综上，本发明提供的朝鲜蓟提取物的制备方法，可同时分离提取绿原酸、木犀草素和菜蓟苦素。提取率为绿原酸≥92.31％，木犀草素≥84.98％，菜蓟苦素≥83.25％；产品纯度为绿原酸≥93.05％，木犀草素≥94.25％，菜蓟苦素≥90.10％。
上面结合实施例对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (8)

1.一种朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.采用酸性乙醇水溶液提取朝鲜蓟原料，过滤后得提取液；
S2.将所述提取液过非极性树脂，并依次用酸性水、乙醇水溶液a进行洗脱，收集酸性水洗脱液，得纯化液A1，收集乙醇水洗脱液，得纯化液B1；
S3.将所述纯化液A1过非极性树脂，并依次用纯水、乙醇水溶液b进行洗脱，收集乙醇水洗脱液，得纯化液A2；
S4.将所述纯化液A2减压浓缩后，加入乙醇水溶液c，搅拌，冷却结晶，晶体干燥后，即为绿原酸；
S5.将所述纯化液B1减压浓缩后，调节pH至碱性，固液分离，分别收集固体和上清液，所述固体为粗品菜蓟苦素；
S6.将所述粗品菜蓟苦素以乙醇水溶液d溶解，冷却结晶，晶体干燥后即为菜蓟苦素；
S7.调节所述上清液pH至酸性，静置后固液分离，收集渣，所述渣水洗至中性后，得粗品木犀草素；
S8.以乙醇水溶液e溶解所述粗品木犀草素，冷却结晶，晶体干燥后即为木犀草素；
步骤S2中，所述酸性水，pH为5～6；
步骤S7中，所述酸性，pH为3～6。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述酸性乙醇水溶液，pH为4～6，乙醇的体积浓度为40～60％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述提取为连续逆流超声提取，温度为20～65℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液c，乙醇体积浓度为85～95％，加入所述乙醇水溶液c后，体系乙醇体积浓度为75～85％，固体与液体质量比为1:1～1：5。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述碱性，pH为8～10。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中，所述乙醇水溶液d，乙醇体积浓度为55～65％，添加质量与所述粗品菜蓟苦素的质量比为1:1～5:1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷却结晶，温度为-10～5℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S8中，所述乙醇水溶液e，乙醇体积浓度为85～95％，添加质量与所述粗品木犀草素的质量比为1:1～5:1。
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