CN114436838B

CN114436838B - 一种朝鲜蓟提取物的制备方法

Info

Publication number: CN114436838B
Application number: CN202210009627.8A
Authority: CN
Inventors: 贺玉婷
Original assignee: Hunan Langlin Biological Resources Co ltd
Current assignee: Hunan Langlin Biological Resources Co ltd
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114436838A

Abstract

本发明公开了一种朝鲜蓟提取物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：S1、将朝鲜蓟原料采用双频超声提取，制得提取液；S2、将吸附剂添加至步骤S1制得的提取液中反应，固液分离，收集液相；S3、将步骤S2制得的液相采用聚酰胺层析柱洗脱，洗脱剂依次为水和乙醇水溶液，收集洗脱液；其中，步骤S1中所述双频超声提取的提取剂为酸性乙醇溶液；步骤S2中所述吸附剂为壳聚糖改性硅藻土‑活性炭。本发明的制备工艺简单、安全，得到的朝鲜蓟提取物天然健康、风味纯正，且收率高，制备成本低，能实现工业化生产。

Description

一种朝鲜蓟提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及植物加工提取技术领域，具体涉及一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

背景技术

朝鲜蓟(Cynara scolymus L.)是菊科(Comopsite)菜蓟属多年生大型草本植物，别名洋蓟、球蓟、菜蓟和法国百合，又被称为“蔬菜之皇”等。但长期以来，人们只食用它的花蕾部分，大量的茎叶被弃之不用。

朝鲜蓟叶中含有多种酚类化合物，分别为咖啡酰奎宁酸衍生物、羟基桂皮酸衍生物、槲皮素衍生物、香豆素衍生物、毛地黄黄酮衍生物和芹菜素衍生物等，总多酚占干物质质量分数的3.27％～4.23％，其中咖啡酰奎宁酸类化合物为总多酚中最主要的成分，约占总多酚的60％～90％，而绿原酸占咖啡酰奎宁酸类化合物的质量分数约为18％～39％和洋蓟酸占咖啡酰奎宁酸类化合物的质量分数约为12％～25％，是朝藓蓟中咖啡酰奎宁酸衍生物最主要的两种成分。

咖啡酰奎宁酸衍生物是一类由奎宁酸与数目不等的咖啡酸通过酯化反应缩合而成的酚酸类物质。所以在植物体内会有多种咖啡酰奎宁酸类化合物存在。根据所结合的咖啡酸数目的不同，咖啡酰奎宁酸包括单咖啡酰奎宁酸、双咖啡酰奎宁酸、三咖啡酰奎宁酸和多咖啡酰奎宁酸。这类化合物广泛存在于植物界。朝鲜蓟中的咖啡酰奎宁酸衍生物主要有9种，如下：1-咖啡酰奎尼酸、3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、1,3-二咖啡酰奎尼酸、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸、1,5-二咖啡酰奎尼酸和4,5-二咖啡酰奎尼酸。

咖啡酰奎宁酸衍生物具有抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、调节血糖和血脂以及保肝等多种生物活性，对某些慢性疾病和心血管疾病也有治疗作用。

咖啡酰奎宁酸衍生物中存在酯键、不饱和双键、邻二酚羟基和羟基等，使这类化合物容易发生化合反应，如在提取的过程中，酯基容易发生水解、异构化，邻二酚羟基容易发生氧化。故在提取过程中需要严格控制工艺参数，确保有效成分的充分提取以及降低其在提取过程中的损耗。

洋蓟酸，又称洋蓟素，朝鲜蓟素，分子式为C₂₅H₂₄O₁₂，分子量为516.45，微溶于冷水，较易溶于沸水，溶于冰醋酸和醇类。洋蓟素具有利胆、保肝和降胆固醇作用。临床用于治疗由肝功能不足引起的各种疾病；还可作为利胆药；能增强胆汁降低脂肪，肝脏解毒，预防脂肪肝；能有效抑制LDL(低密度脂蛋白)胆固醇氧化，降低胆固醇；有护肝作用，能修复受损肝细胞。国外用于减肥降脂配方，护肝及解酒药等。

相关技术中，朝鲜蓟提取物多以总酚酸或者单一成分绿原酸和/或洋蓟酸为考察指标。相关技术中采用微波预处理朝鲜蓟鲜叶辅助溶剂在50℃到100℃的条件下浸提，减压浓缩得5％～15％的多酚浸膏，其多酚收率约为35.56％(收率＝提取物的含量*重量/原料重量*原料含量*100，其中新鲜原料多酚含量以0.56％计)，而提取温度过高，而咖啡酰奎宁酸类化合物为热敏性成分，在提取过程中分解严重。

相关技术中还采用50％～70％乙醇水溶液或丙酮60℃～80℃热回流提取新鲜原料，浓缩、水沉、粗滤、微滤及透析液盐酸或硫酸溶液调pH＝3～5后过大孔柱层析纯化，梯度洗脱，50％～70％乙醇水溶液为洋蓟酸富集液；减压浓缩，粗结晶后活性炭脱色再重结晶。该专利粗晶体洋蓟素20％以上，重结晶晶体80％以上。该技术使用了盐酸和硫酸等合成酸，且属于易制毒溶剂，安全性不高，此外在提取过程中采用溶剂提取法，提取步骤简单，提取率不高。

相关技术中将朝藓蓟原料100℃～120℃蒸4h～8h，晾干切碎至反应釜加4倍90℃～95℃热水回流提取3次，过0.45μm滤膜除杂，浓缩，50％醇沉，滤液过0.45μm滤膜，大孔树脂吸附(AB-8、D101和聚酰胺)，15％、45％和95％乙醇洗脱，过0.22μm滤膜除杂，醇溶液浓缩干燥，紫外法得咖啡酸衍生物9.11％。该专利长时高温蒸制以及热回流提取，整个工艺未对温度进行控制，会导致热敏性有效成分大量降解，且工艺复杂，制备得到的咖啡酸衍生物纯度不高。

相关技术中采用乙醇溶液回流提取忍冬叶，初提液加水制成悬浮液后用正丁醇萃取，萃取物采用聚酰胺填料富集分离，10％～20％乙醇水溶液洗脱得到质量纯度为65％～75％的咖啡酰奎宁酸。该方法热回流提取，未对热敏性咖啡酰奎宁酸类物质进行保护，收率低，其次使用到正丁醇有毒、易燃溶剂，不环境不友好。目前国际市场上朝鲜蓟叶提取物洋蓟素的含量主要集中在2.5％～10％规格，朝鲜蓟叶提取物绿原酸的含量主要集中在1.2％～2.5％，其主要有效成分含量低，且具有农残超标的风险，限制了应用范围，而对朝藓蓟提取物的高含量、低农残需求日欲俱增。

综上，需要开发一种朝鲜蓟提取物的制备方法，该制备方法制得的朝鲜蓟提取物的纯度高。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种朝鲜蓟提取物的制备方法，该制备方法制得的朝鲜蓟提取物的纯度高。

具体如下：本发明公开了一种朝鲜蓟提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将朝鲜蓟原料采用双频超声提取，制得提取液；

S2、将吸附剂添加至所述提取液中反应，固液分离，收集液相；

S3、采用聚酰胺层析柱对所述液相进行洗脱，洗脱剂依次为水和乙醇水溶液，收集洗脱液；

其中，步骤S1中所述双频超声提取的提取剂为酸性乙醇溶液；

步骤S2中所述吸附剂为壳聚糖改性硅藻土-活性炭。

根据本发明朝鲜蓟的制备方法中的一个技术方案，至少具备如下有益效果：

本发明的制备方法采用双频超声辅助乙醇提取，通过选用乙醇溶剂，结合双拼超声辅助提取，有效的提高了有效成分的提取率，且缩短了加工时间，还降低了后续有效成分的纯化分离的难度，最大程度上保护了咖啡酰奎宁酸衍生物的活性与风味。

本发明通过采用壳聚糖改性硅藻土-活性炭为吸附剂，确保了农残等杂质被吸附的同时减少有效物质被吸附，这是由于吸附剂表面仍具有丰富的孔结构，且表面被大量改性物覆盖，粗糙度增加，比表面积变大，更有利于杂质被吸附去除。

在弱酸性(在提取过程中加入酸性乙醇溶液，同时制得的提取液中的主要物质在溶液中呈酸性，其pH在5～6之间)条件下，H⁺一方面会使吸附剂表面的负电荷发生中和，另一方面吸附剂内部分子发生静电排斥现象导致产生扩展分子现象，增强了其分子链的伸展，最终大部分咪唑杂环化合物类农残、颗粒物及其他杂质被吸附剂伸展的分子链捕集而被去除；溶液pH过低，会引起部分聚合物分子链的破坏，质子化的官能团带正电荷，与杂质静电吸引力弱，且H⁺与杂质对吸附位点竞争，阻碍了杂质的吸附。

本发明仅使用到了乙醇等有机溶剂，其他试剂均属于天然有机化合物，得到的咖啡酰奎宁酸类化合物风味且水溶性好，可应用的范围更广。

根据本发明的一些实施方式，所述朝鲜蓟原料为朝鲜蓟叶。

根据本发明的一些实施方式，所述朝鲜蓟原料粉碎处理。

根据本发明的一些实施方式，所述粉碎处理后的细度为40目～60目。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声提取的频率分为第一频段和第二频段。

根据本发明的一些实施方式，所述第一频段的频率范围为15kHz～29kHz。

根据本发明的一些实施方式，所述第二频段的频率范围为30kHz～40kHz。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声提取的温度为30℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声提取的次数为1次～2次。

根据本发明的一些实施方式，单次所述双频超声提取的时间为30min～60min。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声提取过程中，所述第一频段和所述第二频段交替出现。

根据本发明的一些实施方式，所述第一频段单次处理的时间为30s～60s。

根据本发明的一些实施方式，所述第二频段单次处理的时间为30s～60s。

根据本发明的一些实施方式，所述第一频段单次处理的时间与所述第二频段单次处理的时间相同。

根据本发明的一些实施方式，所述酸性乙醇溶液的pH为3～4。

根据本发明的一些实施方式，所述酸性乙醇溶液的pH调节剂包括有机酸。

根据本发明的一些实施方式，所述有机酸包括天然有机酸。

根据本发明的一些实施方式，所述天然有机酸为柠檬酸或苹果酸。

根据本发明的一些实施方式，所述酸性乙醇溶液中乙醇的体积分数为60％～80％。

通过乙醇浓度控制多糖或蛋白质等亲水性杂质被提取出来。

多糖或蛋白质等亲水性杂质极易被水提取出来，干扰朝鲜蓟原料中有效成分的溶出，其次增大分离难度；乙醇浓度过高，极性较小的杂质溶出，增大了分离难度。

根据本发明的一些实施方式，所述酸性乙醇溶液与所述朝鲜蓟原料的体积比为12～15:1。

根据本发明的一些实施方式，所述酸性乙醇溶液中还添加有抗氧化剂。

根据本发明的一些实施方式，所述抗氧化剂包括维生素C(VC)。

通过在酸性乙醇溶解中加入天然有机酸与抗氧化剂，对咖啡酰奎宁酸衍生物进行多重保护，有效的防止了咖啡酰奎宁酸衍生物在提取过程中发生降解和氧化。

根据本发明的一些实施方式，所述抗氧化剂与所述朝鲜蓟原料的质量比为0.3～0.6：1000。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述提取液需减压浓缩。

根据本发明的一些实施方式，所述减压浓缩的温度为30℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，所述减压浓缩的压力为30mmHg～100mmHg。

根据本发明的一些实施方式，所述减压浓缩后的固含体积浓度为10％～15％。

根据本发明的一些实施方式，所述减压浓缩的pH值为5～6。

根据本发明的一些实施方式，所述壳聚糖改性硅藻土-活性炭的制备方法，包括以下步骤：制备硅藻土-活性炭分散液和壳聚糖溶液，将所述硅藻土-活性炭分散液和所述壳聚糖溶液混合后在65℃～75℃下反应。

根据本发明的一些实施方式，所述硅藻土-活性炭分散液的制备原料包括硅藻土和活性炭。

根据本发明的一些实施方式，所述硅藻土和所述活性炭的质量比为2:2～5。

根据本发明的一些实施方式，所述硅藻土-活性炭分散液的制备原料还包括水。

根据本发明的一些实施方式，所述壳聚糖溶液的制备原料包括壳聚糖和乙酸溶液。

根据本发明的一些实施方式，所述硅藻土和所述活性炭的总质量与所述壳聚糖的质量比为10:0.2～0.5。

根据本发明的一些实施方式，所述壳聚糖和所述乙酸溶液的质量体积比为0.2g～0.5g:500mL。

根据本发明的一些实施方式，所述乙酸溶液的体积分数为1.5％～2.5％。

根据本发明的一些实施方式，所述乙酸溶液的体积分数为2％。

根据本发明的一些实施方式，所述反应的时间为2h～3h。

根据本发明的一些实施方式，所述反应后固液分离，收集固相，洗涤，干燥，研磨和过筛。

根据本发明的一些实施方式，所述干燥的温度为60℃～70℃。

根据本发明的一些实施方式，所述干燥的时间为12h～14h。

根据本发明的一些实施方式，所述过筛中的筛网为100目筛。

根据本发明的一些实施方式，所述壳聚糖改性硅藻土-活性炭的制备方法，包括以下步骤：

制备硅藻土-活性炭分散液和壳聚糖分散液，将硅藻土-活性炭分散液和壳聚糖分散液混合后在65℃～75℃下反应2h～3h，过滤，水洗至中性，在60℃～70℃干燥12h～14h，研磨过100目筛，制得所述壳聚糖改性硅藻土-活性炭。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述反应的温度为25℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述反应的时间为45min～60min。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述吸附剂与所述朝鲜蓟原料的质量比为0.3～0.8:100。

吸附剂过少，脱除效果不理想；吸附剂过多，对有效物质存在较大吸附。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述液相的pH为2～3。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述液相中添加酸。

根据本发明的一些实施方式，所述酸包括氯化氢、硫酸、柠檬酸和苹果酸中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述酸为柠檬酸或苹果酸。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述液相与所述柠檬酸的质量比为100:1～2。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述液相与所述苹果酸的质量比为100:1～2。

本发明通过对吸附剂处理后的溶液调节pH，将其pH调节至2～3，有效提高了聚酰胺树脂对咖啡酰奎宁酸衍生物的吸附效果，缩短了生产时间从而降低生产成本，且提高l目标产物含量。

这是因为从单咖啡酰奎宁酸和双咖啡酰奎宁酸分子状态考虑：单咖啡酰奎宁酸和双咖啡酰奎宁酸为多元有机酸，其电离常数pKa1范围在2.58～4.07，主要集中在3～4之间，故当pH≤3时，几乎所有咖啡酰奎宁酸衍生物呈分子态，有利于聚酰胺树脂氢键的形成，当pH＞3时，随着pH增大，咖啡酰奎宁酸衍生物电离度增大，形成氢键能力随之减弱，吸附量随之锐减。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述水的体积数为2BV～3BV。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述乙醇水溶液由第一乙醇水溶液和第二乙醇水溶液组成。

根据本发明的一些实施方式，所述第一乙醇水溶液的体积分数为10％～20％。

根据本发明的一些实施方式，所述第一乙醇水溶液的体积数为0.75BV～1BV。

根据本发明的一些实施方式，所述第二乙醇水溶液的体积分数为60％～80％。

根据本发明的一些实施方式，所述第二乙醇水溶液的体积数为3BV～4BV。

水与10％～20％乙醇水溶液起到进一步除杂的效果，再采用高浓度乙醇水溶液洗脱，增大了洗脱溶液的解析能力，更有利于将有效成分进行富集纯化，明显提高了咖啡酰奎宁酸衍生物的收率。

同时上样前通过控制溶液pH，增强了聚酰胺树脂对咖啡酰奎宁酸的吸附力，原因是酰胺基在未质子化的酸性条件下与分子态咖啡酰奎宁酸氢键作用力最强，大于静电吸附作用力，不易被低浓度乙醇洗脱，需要较高浓度乙醇才能被解析完全。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述洗脱液需浓缩后干燥；所述浓缩的温度为30℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述聚酰胺层析柱洗脱为梯度洗脱。

根据本发明的一些实施方式，所述梯度洗脱的程序依次为2BV～3BV的水、0.75BV～1BV的10％～20％的乙醇水溶液和3BV～4BV的60％-80％乙醇水溶液。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述洗脱的流速为1BV/h～1.5BV/h。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述聚酰胺层析柱的上样流速为1BV/h～1.5BV/h。

根据本发明的一些实施方式，所述浓缩的温度为30℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，所述浓缩的压力为30mmHg～100mmHg。

根据本发明的一些实施方式，所述干燥的温度为30℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，所述干燥的压力为30mmHg～100mmHg。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的朝鲜蓟提取物的液相色谱检测图谱。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面详细描述本发明的具体实施例。

本发明实施方式中选用的朝鲜蓟原料为朝鲜蓟叶，本发明实施方式中朝鲜蓟叶的咖啡酰奎宁酸衍生物总质量分数为2.46％(UV)，绿原酸的质量分数为0.92％(HPLC)和洋蓟酸的质量分数为0.46％(HPLC)。

本发明实施方式中总咖啡酰奎宁酸衍生物UV检测法，包括以下步骤：

1.对照品溶液的制备：

精密称取绿原酸对照品2.85mg置于25mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，配制成绿原酸溶液。

2.供试品溶液的制备：

精密称取提取物适量，加体积分数为50％甲醇水溶液于25mL容量瓶中，超声溶解，放置至室温，滴加50％甲醇水溶液至25mL摇匀，根据吸光度进行相应的稀释，作为提取物的供试品溶液。

3.测定波长的选择：

将对照品溶液和供试品溶液在200nm～400nm进行扫描，其均在327nm波长处有最大吸收，故检测波长选择为327nm。

4.标准曲线的绘制及线性范围：

精密吸取绿原酸对照品溶液0.2mL、1mL、2mL、3mL和4mL分别置于25mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，配置成不同浓度的绿原酸溶液在327nm处测吸收度。

5.检测与计算：

用50％甲醇作空白，在分光光度计上，327nm处测量样品溶液吸光度。

计算：含量％＝C*V/M。

C：样品浓度；V：样品的体积；M：样品的称样量。

本发明实施方式中绿原酸和洋蓟酸HPLC检测方法测试条件见表1-2：

表1液相测定条件

色谱柱	WONDASILTM C18柱(250mm×4.6mm，5μm)
		进样量	20μL
流速	1.0mL/min
		柱温	30℃
波长	327nm
		进样盘温度	临用现配
流动相	乙腈：质量分数为0.1％磷酸水(梯度洗脱)

表2液相检测流动相梯度洗脱

时间(min)	A：乙腈(％，体积分数)	B:水(％，体积分数)
			0～10	13	87
10～15	20	80
			25～30	70	30

实施例1

本实施例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、双频超声提取：

朝鲜蓟原料500g，粉碎至40目，加入12倍体积分数为60％酸性乙醇水溶液(pH为3，采用柠檬酸调节pH；该溶剂中还含有VC，VC的添加量相对于朝鲜蓟原料质量的0.2％)；采用双频超声波辅助低温提取，提取后固液分离，收集提取液。

其中，双频超声波辅助低温提取的参数如下：

低频15kHz，高频30kHz(低频与高频交替进行，每次时间为30s；即先低频下提取30s，再转换为高频提取30s)，50℃提取1次，提取时间60min。

S2、减压浓缩：

将步骤S1制得的提取液在50℃和压力为100mmHg下减压浓缩至固含浓度12.5％，固液分离，收集浓缩液。

S3、吸附：

将吸附剂添加至步骤S2制得的浓缩液(吸附剂与步骤S1中朝鲜蓟原料的质量比为0.3:100)，在50℃下保温搅拌60min，固液分离，收集清液。

其中，吸附剂的制备方法如下：

按硅藻土：活性炭的质量比为2：5称取总质量为10g的硅藻土和活性炭，放入500mL超纯水中超声分散均匀，制得硅藻土-活性炭分散液；

取0.2g壳聚糖溶解于500mL体积分数为2％的冰乙酸溶液中，制得壳聚糖溶液；

将完全溶解后的壳聚糖溶液倒入硅藻土-活性炭分散液中搅拌均匀，70℃水浴反应2h，过滤，用超纯水洗至中性，置于烘箱65℃真空干燥12h，研磨过100目筛，制得吸附剂。

S4、洗脱：

将步骤S3制得的清液采用柠檬酸调节pH为2，过聚酰胺层析柱(蓝深LS-900)，上样流速和洗脱流速均为1BV/h，依次用2BV纯水、1BV的体积分数为20％乙醇水溶液、3BV的体积分数为80％乙醇水溶液依次洗脱，收集体积分数为80％乙醇水洗脱液。

S5、干燥：

将步骤S4制得的洗脱液，在50℃减压浓缩至膏状，压力为100mmHg。在50℃真空干燥，压力为100mmHg，得到11.78g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，朝鲜蓟提取物中绿原酸的质量含量为34.74％，洋蓟酸的质量含量为17.46％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为94.35％，总收率90.35％。

实施例2

本实施例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、双频超声提取：

朝鲜蓟原料500g，粉碎至40目，加入15倍体积分数为80％酸性乙醇水溶液(pH为4，采用柠檬酸调节pH；该溶剂中还含有VC，VC的添加量相对于朝鲜蓟原料质量的0.4％)；采用双频超声波辅助低温提取，提取后固液分离，收集提取液。

其中，双频超声波辅助低温提取的参数如下：

低频29kHz，高频40kHz(低频与高频交替进行，每次时间为30s)，30℃提取2次，单次提取时间30min。

S2、减压浓缩：

将步骤S1制得的提取液在30℃和压力为30mmHg下减压浓缩至固含浓度15％，固液分离，收集浓缩液。

S3、吸附：

将吸附剂添加至步骤S2制得的浓缩液(吸附剂与步骤S1中朝鲜蓟原料的质量比为0.8:100)，在30℃下保温搅拌90min，固液分离，收集清液。

其中，吸附剂的制备方法如下：

按硅藻土：活性炭的质量比为1：1称取总质量为10g的硅藻土和活性炭，放入500mL超纯水中超声分散均匀，制得硅藻土-活性炭分散液；

取0.5g壳聚糖溶解于500mL体积分数为2％的冰乙酸溶液中，制得壳聚糖溶液；

S4、洗脱：

将步骤S3制得的清液采用柠檬酸调节pH为3，过聚酰胺层析柱(蓝深LS-900)，上样流速和洗脱流速均为1.5BV/h，依次用3BV纯水、2BV的体积分数为10％乙醇水溶液、4BV的体积分数为60％乙醇水溶液依次洗脱，收集体积分数为60％乙醇水洗脱液。

S5、干燥：

将步骤S4制得的洗脱液，在30℃减压浓缩至膏状，压力为30mmHg。在30℃真空干燥，压力为30mmHg，得到11.83g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为34.42％，洋蓟酸的质量含量为17.34％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为93.68％，总收率90.08％。

实施例3

本实施例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、双频超声提取：

朝鲜蓟原料500g，粉碎至40目，加入12倍体积分数为70％酸性乙醇水溶液(pH为4，采用苹果酸调节pH；该溶剂中还含有VC，VC的添加量相对于朝鲜蓟原料质量的0.3％)；采用双频超声波辅助低温提取，提取后固液分离，收集提取液。

其中，双频超声波辅助低温提取的参数如下：

低频20kHz，高频35kHz(低频与高频交替进行，每次时间为30s)，40℃提取2次，单次提取时间45min。

S2、减压浓缩：

将步骤S1制得的提取液在40℃和压力为60mmHg下减压浓缩至固含浓度10％，固液分离，收集浓缩液。

S3、吸附：

将吸附剂添加至步骤S2制得的浓缩液(吸附剂与步骤S1中朝鲜蓟原料的质量比为0.5:100)，在50℃下保温搅拌60min，固液分离，收集清液。

其中，吸附剂的制备方法如下：

按活性炭：硅藻土的质量比为2：1称取总质量为10g的硅藻土和活性炭，放入500mL超纯水中超声分散均匀，制得硅藻土-活性炭分散液；

取0.4g壳聚糖溶解于500mL体积分数为2％的冰乙酸溶液中，制得壳聚糖溶液；

S4、洗脱：

将步骤S3制得的清液采用柠檬酸调节pH为2.5，过聚酰胺层析柱(蓝深LS-900)，上样流速和洗脱流速均为1.5BV/h，依次用2.5BV纯水、1BV的体积分数为20％乙醇水溶液、3BV的体积分数为70％乙醇水溶液依次洗脱，收集体积分数为70％乙醇水洗脱液。

S5、干燥：

将步骤S4制得的洗脱液，在40℃减压浓缩至膏状，压力为60mmHg。在40℃真空干燥，压力为40mmHg，得到12.00g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为34.21％，洋蓟酸的质量含量为17.19％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为92.99％，总收率90.73％。

对比例1

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：本对比例未使用吸附剂除杂处理。

本对比例得到11.36g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为27.98％，洋蓟酸的质量含量为13.99％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为75.68％，总收率69.87％。

对比例2

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：本对比例的吸附剂为活性炭。

本对比例得到11.46g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为28.41％，洋蓟酸的质量含量为14.22％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为77.82％，总收率72.53％。

对比例3

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：本对比例的吸附剂为活性炭-硅藻土。

本对比例得到12.07g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为29.54％，洋蓟酸的质量含量为14.95％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的含量为80.67％，总收率79.16％。

对比例4

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：吸附剂中壳聚糖与活性炭-硅藻土的质量比为5：25，活性炭与硅藻土的质量比为2：5。

本对比例得到11.44g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为30.50％，洋蓟酸的质量含量为15.44％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为83.31％，总收率77.48％。

对比例5

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：步骤S4中过聚酰胺树脂的清液未调酸外。

本对比例得到10.50g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为31.68％，洋蓟酸的质量含量为15.92％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为86.12％，总收率73.49％。

对比例6

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：步骤S4中过聚酰胺树脂的清液调节pH为4。

本对比例得到10.57g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为33.78％，洋蓟酸的质量含量为16.98％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为91.82％，总收率78.93％。

对比例7

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：步骤S4中过聚酰胺树脂的清液调节pH为1(pH调节剂为质量分数为35％的盐酸)。

本对比例得到10.73g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为34.05％，洋蓟酸的质量含量为17.11％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为92.57％，总收率80.75％。

对比例8

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：本对比例步骤S1中采用单频超声辅助提取，本对比例中超声频率为20kHz。

本对比例得到10.51g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为31.72％，洋蓟酸的质量含量为15.98％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为86.69％，总收率74.10％。

对比例9

本对比例为一种朝鲜蓟提取物的制备方法。

与实施例3的差异在于：本对比例步骤S1中采用单频超声辅助提取，本对比例中超声频率为35kHz。

本对比例得到9.71g朝鲜蓟提取物。

经HPLC检测，绿原酸的质量含量为32.20％，洋蓟酸的质量含量为16.43％。

经UV检测，总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量为89.17％，总收率70.40％。

本发明实施例1中制得的朝鲜蓟提取物的液相色谱图见图1；7min以前出峰为杂质峰；9min～10min为绿原酸(保留时间为9.225min)；14min～15min为洋蓟酸(保留时间为14.350min)。

对比例1～4和实施例3的差异在于：实施例3选用壳聚糖改性活性炭-硅藻土复合吸附剂(壳聚糖：活性炭-硅藻土＝1：25，活性炭：硅藻土＝2：1)，对比例1～4分别选用无吸附剂、单一活性炭、硅藻土-活性炭复合、壳聚糖改性硅藻土-活性炭比例不一致(壳聚糖：活性炭-硅藻土＝5：25，活性炭：硅藻土＝2：5)，由对比例1～4和实施例3的对比得知：(壳聚糖：活性炭-硅藻土＝1：25，活性炭：硅藻土＝2：1)壳聚糖改活性炭-硅藻土吸附剂具有如下显著效果：有效脱除了农残，提高了总咖啡酰奎宁酸含量，由于显著改变了总咖啡酰奎宁酸上样前浓度，通过调酸显著提高了聚酰胺树脂的吸附效果。

对比例5～7和实施例3的差异在于：实施例3聚酰胺树脂上样液PH＝2.5，对比例5～7聚酰胺树脂上样液pH分别为5～6(未调酸)、4和1，由对比例5～7和实施例3的对比得知：上样液pH＝2.5具有如下显著效果：聚酰胺树脂对总咖啡酰奎宁酸酰吸附量最大，吸附力最强，可缩短生产时间，可提高收率。

对比例8～9和实施例3的差异在于：实施例3选用双频超声辅助提取，对比例8～9选用单频超声辅助提取，由对比例8～9和实施例3的对比得知：双频超声辅助提取具有如下显著效果：缩短了加工时间，降低了提取温度，对热敏性成分最大程度保证生物活性。双频优于单频的原因是双频超声波的空化产额大于单频超声波空化产额。

本发明实施例1～3和对比例1～5中制得的朝鲜蓟提取物的农残测试检测方法采用欧洲农残方法：BS EN 15662:2008，测试结果见表1。

表1本发明实施例1～3和对比例1～5中制得的朝鲜蓟提取物的农残检测结果

从上表中得知，本发明实施例1～3制得的朝鲜蓟提取物中农残含量低。

本发明的制备方法采用双频超声辅助乙醇低温提取，且加入天然有机酸与抗氧化剂对咖啡酰奎宁酸衍生物进行多重保护；有效的防止了咖啡酰奎宁酸衍生物在提取过程中发生降解和氧化。

通过控制酸性乙醇溶液中乙醇浓度，控制多糖等亲水性杂质被提出，结合双拼超声辅助提取，有效提高了有效成分的提取率，且缩短了加工时间，还降低了后续有效成分的纯化分离的难度，最大程度上保护了咖啡酰奎宁酸衍生物的活性与风味。

本发明通过多次实验摸索，发现采用壳聚糖改性活性炭-硅藻土复合吸附剂(壳聚糖：活性炭-硅藻土＝2～5：100，活性炭：硅藻土＝2～5：2)，能够确保农残等杂质被吸附的同时减少有效物质被吸附；这是由于复合吸附剂表面仍具有丰富的孔结构，且表面被大量改性物覆盖，粗糙度增加，比表面积变大，更有利于杂质被吸附去除；同时在弱酸性条件下，H⁺一方面会使复合吸附剂表面的负电荷发生中和，另一方面吸附剂内部分子发生静电排斥现象导致产生扩展分子现象，增强了其分子链的伸展，最终大部分咪唑杂环化合物类农残、颗粒物及其他杂质被吸附剂伸展的分子链捕集而被去除，溶液过酸会引起部分聚合物分子链的破坏，质子化的官能团带正电荷，与杂质静电吸引力弱，且H⁺与杂质对吸附位点竞争，阻碍了杂质的吸附。

本发明经过多次实验摸索，确定复合剂处理后的溶液通过进一步调pH至2～3，能够有效提高聚酰胺树脂对咖啡酰奎宁酸衍生物的吸附效果，缩短了生产时间从而降低了生产成本，且提高了目标产物含量。这是因为从单咖啡酰奎宁酸和双咖啡酰奎宁酸分子状态考虑：单咖啡酰奎宁酸和双咖啡酰奎宁酸为多元有机酸，其电离常数pKa1范围在2.58～4.07，主要集中在3～4之间，故当pH≤3时，几乎所有咖啡酰奎宁酸类化合物呈分子态，有利于聚酰胺树脂氢键的形成，pH＞3时，随着pH增大，咖啡酰奎宁酸电离度增大，形成氢键能力随之减弱，吸附量随之锐减。

本发明通过乙醇水溶液梯度洗脱，发现纯水与10％～20％乙醇水溶液起到进一步除杂的效果，再采用高浓度乙醇水溶液洗脱，增大了洗脱溶液的解析能力，更有利于将有效成分进行富集纯化，明显提高了咖啡香奎宁酸类化合物的收率；这是由于上样前通过控制溶液pH(清液)，增强了聚酰胺树脂对咖啡酰奎宁酸的吸附力，原因是酰胺基在未质子化的酸性条件下与分子态咖啡酰奎宁酸氢键作用力最强，大于静电吸附作用力，不易被低浓度乙醇洗脱，需要较高浓度乙醇才能被解析完全。

本发明仅使用到了乙醇等有机溶剂，其他试剂均属于天然有机化合物，得到的咖啡酰奎宁酸类化合物风味、水溶性好，可应用的范围更广。

综上所述，本发明的总咖啡酰奎宁酸衍生物的质量含量大于92％，其中绿原酸的质量含量大于30％，洋蓟酸的质量含量大于15％，总收率大于90％。本发明制备工艺简单、安全，得到的朝鲜蓟提取物天然健康、风味纯正，且收率高，制备成本低，能实现工业化生产。

上面结合具体实施方式对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将朝鲜蓟原料采用双频超声提取，制得提取液；

步骤S2中所述吸附剂为壳聚糖改性硅藻土-活性炭；

所述双频超声提取的频率分为第一频段和第二频段；

所述第一频段的频率范围为15kHz~29kHz；

所述第二频段的频率范围为30kHz~40kHz；

所述酸性乙醇溶液的pH为3~4，酸性乙醇溶液的pH调节剂为柠檬酸或苹果酸，所述酸性乙醇溶液中乙醇的体积分数为60%~80%。

2.根据权利要求1所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述双频超声提取的温度为30℃~50℃。

3.根据权利要求1所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述酸性乙醇溶液中还添加有抗氧化剂。

4.根据权利要求1所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖改性硅藻土-活性炭的制备方法，包括以下步骤：制备硅藻土-活性炭分散液和壳聚糖溶液，将所述硅藻土-活性炭分散液和所述壳聚糖溶液混合后在65℃~75℃下反应。

5.根据权利要求1所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述吸附剂与所述朝鲜蓟原料的质量比为0.3~0.8:100。

6.根据权利要求1所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述液相的pH为2~3。

7.根据权利要求1所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述乙醇水溶液由第一乙醇水溶液和第二乙醇水溶液组成。

8.根据权利要求7所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述第一乙醇水溶液的体积分数为10%~20%。

9.根据权利要求7所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述第一乙醇水溶液的体积数为0.75BV~1BV。

10.根据权利要求7所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述第二乙醇水溶液的体积分数为60%~80%。

11.根据权利要求7所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述第二乙醇水溶液的体积数为3BV~4BV。

12.根据权利要求1所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述洗脱液需浓缩后干燥；所述浓缩的温度为30℃~50℃。

13.根据权利要求12所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述浓缩的压力为30mmHg~100mmHg。

14.根据权利要求12所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述干燥的温度为30℃~50℃。

15.根据权利要求12所述的朝鲜蓟提取物的制备方法，其特征在于：所述干燥的压力为30mmHg~100mmHg。