CN113599405A - 一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法及其应用，该方法包括：将短梗五加果清洗干燥后粉碎过筛，采用超临界CO2萃取得到短梗五加果油和萃余物；将萃余物置于乙醇水溶液中加热回流后，固液分离得到滤液和滤渣；将滤渣加水超声提取后过滤并浓缩得到水提物，随后将水提物依次经盐析去蛋白、超滤除小分子和树脂脱色后浓缩干燥，即得短梗五加果多糖；进一步将滤液纯化后可得到短梗五加果多酚。本发明所提供的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，对短梗五加果起到了一个综合利用的效果，与一批原料提取一类成分相比，明显缩短了工艺所需时间、减少了植物原料的损耗，从而大大降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于植物活性成分的提取技术领域，更具体地，涉及一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法及其应用。
背景技术
短梗五加又名乌鸦子、无梗五加，野生种主要产于我国东北地区的高山密林之中，华北地区、朝鲜半岛和俄罗斯亦有分布。短梗五加果具有药食两用作用，活性成分较为丰富，含有挥发油、酚酸、黄酮、多糖、苷类及其他有效成分，这些成分在短梗五加果中的含量高，药理作用广泛，具有抗炎镇痛、抗衰老、抗肿瘤、抗血小板凝集、降血压和免疫调节作用。
在现有技术中，对短梗五加果中的有效活性成分的提取技术均仅限于对其中的一类或者一种成分进行提取，而提取后的剩余物中仍然有其他的具有较高价值的成分，这就造成了资源的浪费。
具体而言，对于短梗五加果挥发油的开发，目前报道的主要有水蒸气蒸馏法和溶剂法。其中，水蒸气蒸馏法操作简单，但是高温会破坏挥发油有效成分，而且没有较高的出油率，一般只适合于实验室研究使用；在溶剂法中，用乙醚和乙醇等溶剂直接提取，虽然提取率会高于压榨法，但是，提取得到的挥发油类成分里面会含有大量杂质而影响品质，且大量溶剂残留在药渣内难以被除尽，影响药渣进一步利用。
具体而言，对于短梗五加果多糖的去蛋白纯化，目前报道的主要有sevag试剂法、三氯乙酸法和酶法，上述三种方法对蛋白均有较好的去除效果，但也均有各自的局限性。其中，sevag试剂由氯仿和正丁醇组成，氯仿为剧毒溶剂且有刺激性气味，且此法去除蛋白需要重复5次以上才能去除完全；三氯乙酸虽然低毒，但是其具有刺激性气味且酸性容易破坏部分多糖的结构；酶法操作简便，但是会引入新的杂质蛋白且需要专一的作用条件。
综上所述，需要研究开发一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，可以提高短梗五加果原料的利用度，获得得率较高的短梗五加果挥发油，同时提高做得到的短梗五加果多糖和短梗五加果多酚的纯度。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，包括：
S1、将短梗五加果清洗干燥后粉碎过筛，采用超临界CO2萃取得到短梗五加果油和萃余物；
S2、将步骤S1中的萃余物置于乙醇水溶液中加热回流后，固液分离得到滤液和滤渣；
S3、将步骤S2中的滤渣加水超声提取后过滤并浓缩得到水提物，随后将水提物依次经盐析去蛋白、超滤除小分子和树脂脱色后浓缩干燥，即得短梗五加果多糖。
在上述技术方案中，步骤S3中，还包括，
将步骤S2中的滤液浓缩回收乙醇后，加水稀释后过滤掉不溶物并用大孔树脂层析分离，水洗除杂后用乙醇水溶液洗脱，即得短梗五加果多酚。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中，所述洗脱过程的乙醇水溶液的浓度为60-70v％。
在上述技术方案中，步骤S2中，所述乙醇水溶液中乙醇的含量为75-88v％。
在上述技术方案中，步骤S2中，所述加热回流的温度和时间分别为66-75℃和1-3h。
在本发明的具体实施方式中，步骤S2中，所述加热回流的次数为1-3次，将多次加热回流的回流液合并后再进行过滤，得到滤液。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，
所述超临界CO2萃取的工艺条件为：萃取压力15-50MPa，萃取温度为30-60℃，萃取时间1-6h。
具体地，在上述技术方案中，步骤S3中，
所述盐析具体为，往水提物中按质量体积比为1g：20-40mL的比例加入氯化钙，控制pH为5-6，沉淀30-60min。
具体地，在上述技术方案中，步骤S3中，所述超滤具体为，采用超滤膜截留分子量大于40000道尔顿的分子，收集截留液。
再进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中，在所述超声提取过程中，对应于1g滤渣，水的加入量为10-25mL。
再进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中，所述超声提取的功率和时间分别为100-600W和10-30min。
在本发明的具体实施方式中，步骤S3中，所述超声提取的次数为1-3次，超声后过滤，并将滤液合并后再进行浓缩得到水提物。
详细地，步骤S3中，所述浓缩具体为，控制水提物体积为浓缩前的0.1-0.2倍。
本发明另一方面还提供了上述方法在综合提取短梗五加果中的多种有效成分中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明所提供的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，充分发挥了超临界萃取高效率的特点，能高效提取短梗五加果中的挥发性成分和脂溶性成分，产物的收率高，本提取方法与水蒸气蒸馏法相比，能够避免高温导致的热敏性物质在加热过程中的损失；与溶剂法相比，得到的产物纯度高、质量好，且产物中没有有机溶剂残留；
(2)本发明所提供的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，超临界萃取流程中没有添加任何的夹带剂，因此萃取产物不含有任何杂质；
(3)发明所提供的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，从超临界CO2萃余物中提取多糖类成分，先用高浓度乙醇回流，既可以使水提粗多糖中的非糖类杂质更少，减轻后续纯化多糖时的难度，又可以将高浓度乙醇回流液回收乙醇后加水稀释，上大孔树脂柱纯化，从而得到高纯度的短梗五加果多酚；
(4)发明所提供的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，分离提纯多糖不采用传统的醇沉方法，多糖损失低，盐析去除蛋白质，而超滤后可去除小分子的物质和低聚糖等杂质；
(5)本发明所提供的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，对短梗五加果起到了一个综合利用的效果，与一批原料提取一类成分相比，明显缩短了工艺所需时间、减少了植物原料的损耗，从而大大降低了生产成本。
附图说明
图1为本发明实施例中从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法的工艺流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例中所用的短梗五加干果为市售产品。
实施例1
本发明实施例提供了一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，具体包括以下步骤：
S1、取短梗五加果清洗干净后，于50℃条件下干燥至恒重，粉碎后过20目筛，取1kg装入超临界萃取釜中，萃取压力40MPa，温度50℃，采用二氧化碳流体进行萃取，萃取时间120min，解析器压力5MPa，温度55℃，得到42.55g短梗五加果萃取物(短梗五加果油)和萃余物；
S2、将超临界CO2萃取后的萃余物用10L的80v％乙醇水溶液在70℃温度下回流1.5h，重复两次，合并两次回流液后，固液分离得到滤液和滤渣；
S3、往步骤S2中的滤渣按照1g滤渣加入12.5mL水的量加入10L水，在300W的功率下超声提取20min，按同样工艺条件重复超声提取2次后过滤并将滤液合并，随后将滤液浓缩得到2L水提物，再往水提物中加入60g氯化钙，调节pH为5.5，反应沉淀60min后离心过滤得到上清液，再将上清液采用以上相同的工艺条件再次盐析得到脱蛋白的液体，过截留分子量为4万道尔顿的超滤膜并收集截留液，截留液过脱色树脂，洗脱液浓缩后喷雾干燥，得到短梗五加果多糖38.62g。
实施例2
本发明实施例提供了一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，具体包括以下步骤：
S1、取短梗五加果清洗干净后，于50℃条件下干燥至恒重，粉碎后过30目筛，取2kg装入超临界萃取釜中，萃取压力35MPa，温度45℃，采用二氧化碳流体进行萃取，萃取时间90min，解析器压力5MPa，温度50℃，得到73.55g短梗五加果萃取物(短梗五加果油)和萃余物；
S2、将超临界CO2萃取后的萃余物用10L的85v％乙醇水溶液在70℃温度下回流1.5h，重复两次，合并两次回流液后，固液分离得到滤液和滤渣；
S3、往步骤S2中的滤渣按照1g滤渣加入12mL水的量加入20L水，在400W的功率下超声提取30min，按同样工艺条件重复超声提取2次后过滤并将滤液合并，随后将滤液浓缩得到4L水提物，再往水提物中加入130g氯化钙，调节pH为5.0，反应沉淀60min后离心过滤得到上清液，再将上清液采用以上相同的工艺条件再次盐析得到脱蛋白的液体，过截留分子量为4万道尔顿的超滤膜并收集截留液，截留液过脱色树脂，洗脱液浓缩后喷雾干燥，得到短梗五加果多糖82.93g。
实施例3
本发明实施例提供了一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，具体包括以下步骤：
S1、取短梗五加果清洗干净后，于50℃条件下干燥至恒重，粉碎后过20目筛，取10kg装入超临界萃取釜中，萃取压力45MPa，温度50℃，采用二氧化碳流体进行萃取，萃取时间120min，解析器压力5MPa，温度55℃，得到435.67g短梗五加果萃取物(短梗五加果油)和萃余物；
S2、将超临界CO2萃取后的萃余物用120L的80v％乙醇水溶液在80℃温度下回流1.0h，重复两次，合并两次回流液后，固液分离得到滤液和滤渣；
S3、往步骤S2中的滤渣按照1g滤渣加入12.8mL水的量加入120L水，在400W的功率下超声提取30min，按同样工艺条件重复超声提取2次后过滤并将滤液合并，随后将滤液浓缩得到24L水提物，再往水提物中加入700g氯化钙，调节pH为5.0，反应沉淀50min后离心过滤得到上清液，再将上清液采用以上相同的工艺条件再次盐析得到脱蛋白的液体，过截留分子量为4万道尔顿的超滤膜并收集截留液，截留液过脱色树脂，洗脱液浓缩后喷雾干燥，得到短梗五加果多糖429.93g；将步骤S2中的滤液加热浓缩回收乙醇后，加水稀释2-4倍后，用大孔树脂层析分离，水洗除杂后用浓度为60-70v％的乙醇水溶液洗脱，得到短梗五加果多酚384.54g。
对比例1
本发明对比例提供了一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，具体包括以下步骤：
S1、取短梗五加果清洗干净后，于50℃条件下干燥至恒重，粉碎后过20目筛，取1kg装入超临界萃取釜中，萃取压力40MPa，温度50℃，采用二氧化碳流体进行萃取，萃取时间120min，解析器压力5MPa，温度55℃，得到42.55g短梗五加果萃取物(短梗五加果油)和萃余物；
S2、将超临界CO2萃取后的萃余物用10L的92.5v％乙醇水溶液在75℃温度下回流1.5h，重复两次，合并两次回流液后，固液分离得到滤液和滤渣；S3、往步骤S2中的滤渣按照1g滤渣加入13.0mL水的量加入10L水，在300W的功率下超声提取20min，按同样工艺条件重复超声提取2次后过滤并将滤液合并，随后将滤液浓缩得到2L水提物，再往水提物中加入60g氯化钙，调节pH为5.5，反应沉淀60min后离心过滤得到上清液，再将上清液采用以上相同的工艺条件再次盐析得到脱蛋白的液体，过截留分子量为4万道尔顿的超滤膜并收集截留液，截留液过脱色树脂，洗脱液浓缩后喷雾干燥，得到短梗五加果多糖37.86g。
对比例2
本发明对比例提供了一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，具体包括以下步骤：
S1、取短梗五加果清洗干净后，于50℃条件下干燥至恒重，粉碎后过30目筛，取2kg装入超临界萃取釜中，萃取压力75MPa，温度75℃，采用二氧化碳流体进行萃取，萃取时间90min，解析器压力5MPa，温度50℃，得到79.38g短梗五加果萃取物(短梗五加果油)和萃余物；
S2、将超临界CO2萃取后的萃余物用10L的85v％乙醇水溶液在70℃温度下回流1.5h，重复两次，合并两次回流液后，固液分离得到滤液和滤渣；
S3、往步骤S2中的滤渣按照1g滤渣加入12.5mL水的量加入20L水，在400W的功率下超声提取30min，按同样工艺条件重复超声提取2次后过滤并将滤液合并，随后将滤液浓缩得到4L水提物，再往水提物中加入130g氯化钙，调节pH为6.5，反应沉淀60min后离心过滤得到上清液，再将上清液采用以上相同的工艺条件再次盐析得到脱蛋白的液体，过截留分子量为4万道尔顿的超滤膜并收集截留液，截留液过脱色树脂，洗脱液浓缩后喷雾干燥，得到短梗五加果多糖80.58g。
分别采用以下方法测量所制得的短梗五加果多糖中的蛋白残余和多糖含量：
(1)蛋白含量测定方法(考马斯亮蓝法)
标准曲线绘制：取9支试管，分别加入0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL的1mg/mL标准蛋白质溶液，补水至2.0mL；另取9支试管，分别加入0.1mL以上溶液，然后各加入5mL考马斯亮蓝试剂，充分振荡混合，10min后于波长595nm处，以0号管为空白，测定各管的吸光度值；以标准蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
样品含量测定：取样品溶液0.1mL于试管中，各加入5mL考马斯亮蓝试剂，充分混合，放置10min，以试剂空白为对照，波长595nm处比色，测定吸光度值。
(2)多糖含量测定方法(苯酚-硫酸法)
标准曲线绘制：称量50mg的葡萄糖于100ml的容量瓶中，加水稀释到刻度，制得0.5mg/ml的标准溶液，分别吸取2ml、4ml、6ml、8ml、10ml、12ml的标准溶液至50ml的容量瓶中，加水稀释到刻度，稀释至浓度为0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.12mg/ml吸取2ml以上的各浓度的标准对照品于10ml的具塞试管中，加入5％的苯酚试液1ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5ml，振摇2分钟，置于沸水浴中加热15分钟后取出，冷却，加水至刻度，再冷却。5％的苯酚和浓硫酸比为1∶5加入到10ml的容量瓶中加水至刻度为对照溶液；在585nm下测定吸光度，以吸光度A为横坐标，浓度C为正坐标绘制标准曲线。
多糖含量测定：取2ml溶解的多糖溶液于10ml的具塞试管中，加入5％的苯酚试液1ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5ml，振摇2分钟，置于沸水浴中加热15分钟，取出，冷却，加水至刻度，再冷却，在585nm下测定吸光度，计算多糖含量。
采用上述方法分别检测实施例1-3和对比例1-2中的短梗五加果多糖中的蛋白残余和多糖含量，结果如下表1所示。
表1短梗五加果多糖中的蛋白残余和多糖含量的检测结果
| 蛋白残余 | 多糖含量 | |
| 实施例1 | 1.23wt％ | 84.29wt％ |
| 实施例2 | 1.07wt％ | 81.89wt％ |
| 实施例3 | 1.12wt％ | 82.34wt％ |
| 对比例1 | 1.28wt％ | 75.84wt％ |
| 对比例2 | 2.57wt％ | 77.57wt％ |
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
包括：
S1、将短梗五加果清洗干燥后粉碎过筛，采用超临界CO2萃取得到短梗五加果油和萃余物；
S2、将步骤S1中的萃余物置于乙醇水溶液中加热回流后，固液分离得到滤液和滤渣；
S3、将步骤S2中的滤渣加水超声提取后过滤并浓缩得到水提物，随后将水提物依次经盐析去蛋白、超滤除小分子和树脂脱色后浓缩干燥，即得短梗五加果多糖。
2.根据权利要求1所述的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
步骤S3中，还包括，
将步骤S2中的滤液浓缩回收乙醇后，加水稀释后过滤掉不溶物并用大孔树脂层析分离，水洗除杂后用乙醇水溶液洗脱，即得短梗五加果多酚。
3.根据权利要求2所述的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
步骤S3中，所述洗脱过程的乙醇水溶液的浓度为60-70v％。
4.根据权利要求1所述的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
步骤S2中，
所述乙醇水溶液中乙醇的含量为75-88v％；
和/或，所述加热回流的温度和时间分别为66-75℃和1-3h。
5.根据权利要求1或4所述的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
步骤S1中，
所述超临界CO2萃取的工艺条件为：萃取压力15-50MPa，萃取温度为30-60℃，莘取时间1-6h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
步骤S3中，
所述盐析具体为，往水提物中按质量体积比为1g∶20-40mL的比例加入氯化钙，控制pH为5-6，沉淀30-60min。
7.根据权利要求1-5任一项所述的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
步骤S3中，
所述超滤具体为，采用超滤膜截留分子量大于40000道尔顿的分子，收集截留液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
步骤S3中，在所述超声提取过程中，
对应于1g滤渣，水的加入量为10-25mL；
和/或，所述超声提取的功率和时间分别为100-600W和10-30min。
9.根据权利要求8所述的从短梗五加果中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，
步骤S3中，所述浓缩具体为，控制水提物体积为浓缩前的0.1-0.2倍。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在综合提取短梗五加果中的多种有效成分中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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