CN111440218A - 一种植物多酚的制备方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明公开了一种植物多酚的制备方法，包括以下步骤：S1将植物原料在复合酶的作用下，用一定量的溶剂超声或加热提取，收集提取液；S2向步骤S1的提取液中加入天然澄清剂进行澄清处理后过滤，收集滤液；S3将步骤S2的滤液用吸附树脂柱层析进行纯化；S4将纯化后的滤液进行超滤，然后纳滤，所得纳滤截留液去除溶剂后，即得植物多酚。该方法特别适合各种植物鞣质、黄烷醇、黄酮苷元、酚酸等不含糖基的多酚类成分的提取纯化，而制备含有糖基的多酚(如黄酮苷、二苯乙烯苷)得率较低。制备方法包括复合酶辅助提取、澄清、柱层析、超滤、纳滤五个步骤。利用本发明所述方法制备的植物多酚纯度高、颜色浅、稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分的提取技术，属于植物提取技术领域，具体涉及一种植物多酚的制备方法，尤其涉及一种植物多酚的提取、纯化方法。
背景技术
广义的植物多酚是存在于植物体内、含有多元酚羟基结构的化学成分的总称，包括鞣质(也叫做单宁，分为缩合单宁和水解单宁)、黄酮、黄烷醇、芪类、酚酸等成分。植物多酚具有抗氧化、抗衰老、抑菌、抗病毒、抗癌等多种生理活性，已广泛应用于医药、保健食品和化妆品等领域。尤其在日用化妆品领域，因植物多酚能够有预防或效缓解紫外线照射引起的各种皮肤问题(如光老化、皮肤损伤、变黑、过敏等)，越来越多的护肤品将其作为一种重要的功能性原料。常见的富含植物多酚的护肤品原料有茶多酚、葡萄籽提取物、金缕梅提取物、芦荟提取物、银杏叶提取物等。
目前，植物多酚常规的制备方法是植物原料用一定的方法提取后，提取液经简单地离心除杂质或大孔树脂柱层析后回收溶剂，如专利文献CN105348331A、CN109691673A和CN103585207A公开的方法。常规方法制备的植物多酚纯度不够高、稳定性差，尤其是植物多酚的水溶液，容易变色、析出沉淀，严重影响植物多酚在日用化妆品领域的应用范围。
膜分离技术是采用具有选择性分离功能的无机或高分子材料为分离介质,借助外界能量的推动,对气体或液体组分进行分离、分级和富集的技术。植物提取液在一定压力下流经膜表面时，小分子物质透过薄膜，大分子物质被截留，从而实现大小分子的分离。在植物提取中，膜分离技术常用于脱色、脱盐、富集有效部位(如纯化多糖、单宁)。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种植物多酚的制备方法。利用本发明所述方法制备的植物多酚纯度高、颜色浅、稳定性好。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种植物多酚的制备方法，制备方法包括以下步骤：
S1将植物原料在复合酶的作用下，用一定量的溶剂超声或加热提取，收集提取液；
S2向步骤S1的提取液中加入天然澄清剂进行澄清处理后过滤，收集滤液；
S3将步骤S2的滤液用吸附树脂柱层析进行纯化；
S4将纯化后的滤液进行超滤，然后纳滤，所得纳滤截留液去除溶剂后，即得植物多酚。
优选地，步骤S1中，所述复合酶选自纤维素酶和果胶酶，所述复合酶的加入量为2.1-5.5g/kg植物原料干重；所述纤维素酶和果胶酶的重量比为2-5:0.1-0.5。
优选地，所述纤维素酶活力≥30U/mg，果胶酶活力60000U/ml。
优选地，步骤S1中，所述溶剂为水或醇，溶剂的用量为植物原料干重的5-20倍量；所述醇的浓度不高于50％。
优选地，步骤S1中，所述加热提取时的提取温度不高于50℃，提取1-3次，每次0.5-2小时；
所述超声提取时的温度30-50℃，提取时间10-40分钟。
优选地，步骤S2中，所述的澄清剂为II型ZTC1+1天然澄清剂(按说明书配制)，澄清剂用量为提取液体积的1％-10％。本发明采用的澄清剂对不同分子量的蛋白、胶体有很好的絮凝效果，一方面降低提取液的黏度，易于过滤(提取植物的果实时表现出的优势尤为明显)；另一方面可大大降低植物多酚产品里小分子蛋白的残留量，使植物多酚(尤其是鞣质类多酚)的溶液更稳定。不用澄清剂处理时，制备的皱皮木瓜总多酚，水溶液放置10天左右会有微量的沉淀析出。
更优选地，所述澄清剂用量为提取液体积的2％-6％。使用的澄清剂对鞣质也有絮凝作用，为保证总多酚的高得率，最优选澄清剂用量为2％-4％。优选地，所述加入澄清剂进行澄清处理的具体步骤为：先向提取液中加入IIB型澄清剂，搅拌均匀后再加入等量的IIA型澄清剂，再次搅拌均匀，室温下静置4-6小时。
优选地，步骤S3中，所述吸附树脂层析柱中采用的树脂填料选自大孔吸附树脂、离子交换树脂和聚酰胺中的至少一种。
更优选地，所述树脂填料选自大孔吸附树脂和聚酰胺中的至少一种，所述大孔吸附树脂选自AB-8、D-101、DM-301、及HPD-100型大孔吸附树脂中的一种。
最优选所述树脂填料为聚酰胺。利用聚酰胺进行柱层析时，植物提取液可直接加样于聚酰胺填料中，不需要除去溶液里面的醇，工艺简单。
所述吸附树脂层析柱进行纯化时采用的洗脱液为小分子醇与水按不同比例组成的溶液。所述小分子醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇和丁二醇，小分子醇与水的比例为0:1-9:1(v/v)。
优选地，步骤S3中，所述吸附树脂层析柱进行纯化时采用的洗脱液中含有质量含量为0.05％-2％的碱性物质，更优选含量为0.1％-1.5％，最优选0.2％-0.6％。加入碱性物质可提高植物多酚的得率。
所述的碱性物质选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和尿素中的至少一种，更优选碱性物质选自氨水和尿素中的至少一种；更优选尿素。
本发明发现，利用含尿素的洗脱液制备的植物多酚，尤其是鞣质类的多酚，经超滤和纳滤后水溶液的稳定性最好，可能是因为尿素的氢键破坏作用能够防止鞣质分子聚集。
本发明采用层析柱的创新之处还在于：优选利用聚酰胺制备高纯度的多酚。聚酰胺常用来去除多酚(尤其是鞣质)，未见有专利文献报道用聚酰胺制备多酚。用聚酰胺制备多酚，所得产品的纯度比常规的大孔树脂层析法纯度高。
优选地，步骤S4中，所述超滤采用的滤膜的截留分子量为3K-30K道尔顿，更优选滤膜的截留分子量为5K-10K道尔顿；
所述超滤在0.05-0.2Mpa的压力下进行直至超滤截留液/超滤滤过液的体积为1:5-1:10(v/v)时，收集超滤滤过液。
优选地，步骤S4中，所述纳滤采用的滤膜的截留分子量为200道尔顿，纳滤将溶液浓缩至原体积的1/3左右，收集截留液。
优选地，所述植物多酚包括鞣质、黄酮、黄烷醇、芪类、酚酸中的至少一种。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明提供了一种植物多酚的制备方法，提取过程中使用纤维素酶破坏植物细胞的细胞壁，提高有效成分的提取率，利用果胶酶酶解提取液中的果胶类成分，降低提取液的黏度，利于后处理。
2、与常规方法相比，本发明通过采用树脂填料尤其是聚酰胺柱色谱尿素洗脱法制备的植物多酚纯度高，福林酚比色法测得的总多酚含量大于95％；超滤联合纳滤技术将色素、大分子物质和金属离子去除后，植物多酚颜色更浅、稳定性更好。利用本发明所述方法制备的植物多酚，水溶液室温避光放置3个月不变色，无沉淀析出。
3、本发明所述的方法工艺简单，可实现工业化生产，适合各种植物中鞣质、黄烷醇、黄酮苷元、酚酸等不含糖基的多酚类成分的提取纯化，而不适和制备含有糖基的多酚(如黄酮苷、二苯乙烯苷)，其得率较低。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
一种皱皮木瓜总多酚的制备方法：
1、取干燥的片状皱皮木瓜(Chaenomeles speciosa)饮片1kg，用5L去离子水室温下浸泡半小时后，加入纤维素酶2g，果胶酶0.3g，于45℃水浴中提取两次，每次1h，合并两次提取液(共7.2L)。400r/min搅拌条件下加入配制好的ZTC-Ⅱ澄清剂(先加IIB型100ml，后加IIA型100ml，IIB和IIA澄清剂用量均为提取液体积的1.39％)，搅拌均匀后静置5h，依次用200目滤布和布氏漏斗过滤，得滤液7L。
2、上述7L滤液浓缩至约2L后加样至聚酰胺色谱柱(55*450mm)中，控制色谱柱下端液体的流出速度约20ml/min。加样后先用2倍柱体积的水洗脱，再用4倍柱体积的70％甲醇洗脱，最后用含0.2％尿素的90％甲醇洗脱至流出液无颜色。收集90％甲醇洗脱部位(约3.4L)。
3、在Millipore Labscale TFF超滤系统上，用截留分子量为10K的纤维素滤膜对90％甲醇洗脱部位(约3.4L)进行超滤，收集滤过液约3L，再进行纳滤，溶液浓缩至1L左右后，收集截留液，50℃下减压回收溶剂，总多酚17.1g，福林酚法(Foin-Ciocalteu法)测试，总多酚的纯度为97.4％。所得总多酚中主要成分为鞣质。
实施例2
用不同比例的碱性洗脱液制备皱皮木瓜总多酚：
取干燥的片状皱皮木瓜饮片2kg，用20L去离子水室温下浸泡半小时后，加入纤维素酶4g，果胶酶0.5g，于50℃水浴中提取1h，得提取液16.2L。400r/min搅拌条件下加入配制好的ZTC-Ⅱ澄清剂(先加IIB型180ml，后加IIA型180ml，IIB和IIA澄清剂用量均为提取液体积的1.1％)，搅拌均匀后静置4h，依次用200目滤布和布氏漏斗过滤，得滤液16.1L。
上述16.1L滤液浓缩至约6L后平均分成6份，分别加样至6个聚酰胺色谱柱(30*300mm)中，控制色谱柱下端液体的流出速度约为10ml/min。加样后先用2倍柱体积的水洗脱，再用4倍柱体积的70％甲醇洗脱。最后，6个色谱柱分别用90％甲醇、90％甲醇(含0.3％尿素)、90％甲醇(含0.6％尿素)、90％甲醇(含0.9％尿素)、90％甲醇(含0.3％NaOH)、90％甲醇(含0.3％氨水)洗脱至流出液无颜色，收集最后一步洗脱液。为消除超滤和纳滤对总多酚得率的影响，最后一步洗脱液不再进行超滤和纳滤，于50℃下减压回收溶剂，得皱皮木瓜总多酚。不同比例的碱性洗脱液制备的总多酚重量、颜色、纯度及水溶液室温下的稳定性如表1所示。
表1不同比例的碱性洗脱液制备的皱皮木瓜总多酚
实施例3
一种皱皮木瓜总多酚的制备方法：
采用与实施例2基本相同的方法，不同之处仅在于：将实施例2相同方法制备的滤液取6.8L，浓缩至约1.5L后加样至D101大孔吸附树脂柱(55*450mm)中，控制色谱柱下端液体的流出速度约15ml/min。加样后先用2倍柱体积的水洗脱，再用3倍柱体积的30％甲醇洗脱，最后用90％甲醇洗脱至流出液无颜色。收集90％甲醇洗脱部位(约2.9L)。
所得皱皮木瓜总多酚重量14.1g，福林酚法测试，总多酚的纯度为58.3％。
实施例4
一种石榴果皮总鞣质的制备方法：
取干燥的石榴(Punica granatum)果皮0.5kg，粉碎，过80目筛。用5L去离子水室温下浸泡15分钟后，加入纤维素酶1g，果胶酶0.2g，超声提取30分钟，收集提取液(约4.2L)。400r/min搅拌条件下加入配制好的ZTC-Ⅱ澄清剂(先加IIB型60ml，后加IIA型60ml，两种澄清剂用量均为提取液体积的1.43％)，搅拌均匀后静置4h，依次用200目滤布和布氏漏斗过滤，得滤液3.9L。
上述3.9L滤液浓缩至约1L后加样至聚酰胺色谱柱(30*300mm)中，控制色谱柱下端液体的流出速度约10ml/min。加样后先用2倍柱体积的水洗脱，再用4倍柱体积的70％乙醇洗脱，最后用含0.3％尿素的90％乙醇洗脱至流出液无颜色。收集90％乙醇洗脱部位(约1.4L)。
在Millipore Labscale TFF超滤系统上，用截留分子量为5K的纤维素滤膜对90％乙醇洗脱部位(约1.4L)进行超滤，收集滤过液约1.2L，再进行纳滤，溶液浓缩至400ml左右后，收集截留液，50℃下减压回收溶剂，得石榴皮总多酚6.8g，福林酚法测试，总多酚的纯度为96.7％。总多酚中主要成分为鞣质。
实施例5
一种酸橙总多酚的制备方法：
取干燥的酸橙(Citrus aurantium)果皮0.5kg，粉碎，过80目筛。用8L去离子水室温下浸泡10分钟后，加入纤维素酶2g，果胶酶0.2g，超声提取40分钟，收集提取液(约7L)。400r/min搅拌条件下加入配制好的ZTC-Ⅱ澄清剂(先加IIB型70ml，后加IIA型70ml，IIB型和IIA型用量均为提取液体积的1％)，搅拌均匀后静置4h，依次用200目滤布和布氏漏斗过滤，得滤液6.8L。
上述6.8L滤液浓缩至约1.5L后加样至聚酰胺色谱柱(30*300mm)中，控制色谱柱下端液体的流出速度约10ml/min。加样后先用2倍柱体积的水洗脱，再用4倍柱体积的60％乙醇洗脱，最后用含0.2％尿素的90％乙醇洗脱至流出液无颜色。收集90％乙醇洗脱部位(约1.5L)。
在Millipore Labscale TFF超滤系统上，用截留分子量为5K的纤维素滤膜对90％乙醇洗脱部位(约1.5L)进行超滤，收集滤过液约1.3L，再进行纳滤，溶液浓缩至400ml左右后，收集截留液，50℃下减压回收溶剂，得酸橙总多酚4.8g，福林酚法测试，总多酚的纯度为97.1％。
实施例6
一种黄芩总多酚的制备方法：
取干燥的黄芩(Scutellaria baicalensis)饮片1kg，用5L 40％的乙醇室温下浸泡半小时后，加入纤维素酶3g，果胶酶0.3g，于45℃水浴中提取两次，每次1h，合并两次提取液(共7.4L)。400r/min搅拌条件下加入配制好的ZTC-Ⅱ澄清剂(先加IIB型100ml，后加IIA型100ml，IIB和IIA澄清剂用量均为提取液体积的1.35％)，搅拌均匀后静置4h，依次用200目滤布和布氏漏斗过滤，得滤液7.2L。
上述7.2L滤液浓缩至约2L后加样至聚酰胺色谱柱(55*450mm)中，控制色谱柱下端液体的流出速度约20ml/min。加样后先用2倍柱体积的水洗脱，再用4倍柱体积的60％甲醇洗脱，最后用含0.2％尿素的90％甲醇洗脱至流出液无颜色。收集90％甲醇洗脱部位(约2.9L)。
在Millipore Labscale TFF超滤系统上，用截留分子量为5K的纤维素滤膜对90％甲醇洗脱部位(约2.9L)进行超滤，收集滤过液约2.5L，再进行纳滤，溶液浓缩至800ml左右后，收集截留液，50℃下减压回收溶剂，得黄芩总多酚4.1g，福林酚法测试，总多酚的纯度为96.6％。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种植物多酚的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将植物原料在复合酶的作用下，用一定量的溶剂超声或加热提取，收集提取液；
S2向步骤S1的提取液中加入天然澄清剂进行澄清处理后过滤，收集滤液；
S3将步骤S2的滤液用吸附树脂柱层析进行纯化；
S4将纯化后的滤液进行超滤，然后纳滤，所得纳滤截留液去除溶剂后，即得植物多酚。
2.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述复合酶选自纤维素酶和果胶酶，所述复合酶的加入量为2.1-5.5g/kg植物原料干重，所述纤维素酶和果胶酶的重量比为2-5:0.1-0.5。
3.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述溶剂为水或醇，溶剂的用量为植物原料干重的5-20倍量；所述醇的浓度不高于50％。
4.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述加热提取时的提取温度不高于50℃，提取1-3次，每次0.5-2小时；
所述超声提取时的温度30-50℃，提取时间10-40分钟。
5.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述的澄清剂为II型ZTC1+1天然澄清剂；所述澄清剂用量为提取液体积的1％-10％。
6.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述吸附树脂层析柱中采用的树脂填料选自大孔吸附树脂、离子交换树脂和聚酰胺中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述吸附树脂层析柱进行纯化时采用的洗脱液中含有质量含量为0.05％-2％的碱性物质。
8.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述超滤采用的滤膜的截留分子量为3K-30K道尔顿。
9.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述纳滤采用的滤膜的截留分子量为200道尔顿。
10.根据权利要求1所述的植物多酚的制备方法，其特征在于，所述植物多酚包括鞣质、黄酮、黄烷醇、芪类、酚酸中的至少一种。
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