CN101973984A - 一种提取竹叶总黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提取竹叶总黄酮的方法,该方法由以下步骤组成:取竹叶干燥、粉碎后加入10~20倍的质量浓度为0.05%~0.15%的复合酶溶液,再将溶液的pH值调至4.5~6,然后在40~60℃下超声处理0.5~1.5小时后迅速升温至85~90℃,保持5min灭酶,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度为1.12;其中,所述的复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物,二者的质量配比为1∶1;于60℃条件下,先按80mL壳聚糖胶体溶液/1000mL浓缩液的比例往浓缩液中加入壳聚糖,充分搅拌,再按80mL 101果汁澄清剂水溶液/1000mL浓缩液的比例加入101果汁澄清剂水溶液,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液;将上清液过D101树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥即得竹叶总黄酮。
Description
技术领域
本发明涉及杂环化合物,具体涉及杂环不氢化的杂环化合物,特别是涉及黄酮类化合物的制备。
背景技术
我国素有“竹子王国”之称,竹叶来源丰富,分布地域广。竹叶为禾本科竹亚科刚竹属毛竹Phyllostachys heterocycla vat.pubescens的叶。竹叶中含有丰富的黄酮类化合物,具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、调节血脂和血胆固醇、调节免疫、抗菌、抗病毒等作用。且安全无毒,在功能食品和医药保健品、药品等方面有着十分广阔的应用前景。
竹叶中的黄酮类化合物以碳苷黄酮为主,四种主要的竹叶碳苷黄酮分别是荭草苷(Orientin),异荭草苷(Homoorientin),牡荆苷(Vitexin),异牡荆苷(Isoviextin),黄酮碳苷的生物活性已经被报道,但其在水和乙醇中的溶解度都不是很大,目前使用的主要提取溶剂有乙醇、水,提取方法多采用煎煮法,回流法等,都是在完整植物细胞存在的情况下,通过浸润、渗透、溶剂进入组织细胞,溶解细胞内物质而使其扩散到溶剂中,提取过程中存在巨大的传质阻力,致使提取率普遍偏低。如“一种从竹叶中提取竹叶黄酮的生产方法”(公开号为CN1907994),系采用6~8倍量水,加热到80~100℃,持续0.5~1.5小时。又如“竹叶黄酮提取物的制备方法”(公开号为CN101391060),系采用C1-C3的醇提取,成本高,且竹叶中含有大量叶绿素,给后续操作带来一定困难。再如“从竹叶中提取竹叶黄酮类系列产品的生产工艺”(公开号为CN 1923828),系采用水提取结合膜分离技术制得,工序较复杂,宜发生膜堵塞现象,不适宜工业化大生产,且无法去除一些重金属杂质。
植物的有效成分往往包裹在细胞壁内,酶处理法可以水解破坏细胞壁结构,使有效成分直接暴露出来,溶解、混悬或胶溶于提取溶剂中,以提高总黄酮的提取率。酶解法具有反应温和、得率高、成本低廉、操作简单等优点。超声波的空化作用,能加速植物细胞壁破裂,促进活性物质的释放,提取效率高,时间短,杂质少,广泛用于植物活性成分的提取。上述酶解和超声破壁的现代工艺已被引入提取植物总黄酮的技术方案中,但尚存在一些有待改进的不足。
如公开号为CN 101486745A的专利申请,该申请公开了“一种富含黄酮类活性成分的木豆叶提取物的诱导提取方法”,所述方法的技术方案是采用匀浆破碎酶解、恒温酶解、负压空化提取、溶剂除杂和富集等技术,但操作复杂,提取率并不高,且在提取过程中应用了多种易燃易爆有机试剂,不适合大生产使用。
又如公开号为CN101524458的专利申请,该申请公开了“土茯苓皂甙、黄酮类提取物及其制备方法”,所述方法的技术方案包括以下步骤:(1)土茯苓原料药材的处理,包括对原料药材进行真空干燥、粉碎和酶解;(2)土茯苓皂甙和黄酮类化合物的提取,在超声波辅助下用乙醇回流提取后合并浓缩,用石油醚脱脂后分别用氯仿和乙酸乙酯萃取,回收溶剂后真空干燥得到的土茯苓黄酮类提取物。上述专利申请方案所得提取物中含黄酮类化合物30-80%,但在酶解之后使用了大量易燃易爆有毒挥发性有机溶剂进行纯化,不利于工业化大生产。
再如公开号为CN101020720的专利申请,该申请公开了“葛根多糖提取工艺”,所述工艺方法的技术方案是,将葛根磨浆,在浆液中加入纤维素酶和蛋白酶进行酶解反应,同时进行低强度超声波处理,并用加入VC和木糖护色,然后滤除纤维,滤液进行离心分离出淀粉,离心液真空浓缩后加入乙醇,再经离心分离出湿葛根多糖,再经干燥得到含葛根黄酮的葛根多糖。该方法采用的是乙醇沉淀去除杂质的方法,成本高,提取物中黄酮等有效成分损失大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的竹叶总黄酮的提取方法,该方法显著提高了竹叶总黄酮的提取率和纯度。
本发明解决上述问题的技术方案如下:
一种提取竹叶总黄酮的方法,该方法由以下步骤组成:
(1)超声酶解:取竹叶干燥、粉碎后加入10~20倍(质量体积倍)的质量浓度为0.05%~0.15%的复合酶溶液,再将溶液的pH值调至4.5~6,然后在40~60℃下超声(50KHZ,160W)处理0.5~1.5小时后迅速升温至85~90℃,保持5min灭酶,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度为1.12(60℃);其中,所述的复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物,二者的质量配比为1∶1;
(2)絮凝除杂:于60℃条件下,先按80mL壳聚糖胶体溶液/1000mL浓缩液的比例往浓缩液中加入壳聚糖,充分搅拌,再按80mL 101果汁澄清剂水溶液/1000mL浓缩液的比例加入101果汁澄清剂水溶液,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液;其中,所述的壳聚糖胶体溶液是体积浓度为1%的醋酸溶液与壳聚糖混合制成的壳聚糖质量浓度为1%的醋酸溶液,所述的101果汁澄清剂水溶液是水与101果汁澄清剂混合制成的的101果汁澄清剂质量浓度为5%的水溶液。
(3)过大孔树脂柱:将上清液过D101树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥即得竹叶总黄酮。
本发明上述方法中,所述的超声酶解的最佳条件为:复合酶溶液的加入量为竹叶干粉的15倍(质量体积倍);复合酶溶液的质量浓度为1%;竹叶干粉与复合酶溶液混合的溶液的pH值调至5;超声处理的温度为50℃,时间为1小时。
本发明方法较现有技术具有下列优点:
(1)众所周知,竹叶内含有纤维素和木质素,而叶片的表面则含有果胶质;纤维素和木质素与果胶质是两类特性不同的物质,而不同的酶的降解作用又不相同。本发明所述的复合酶正是基于上述因素而设计的,利用纤维素酶充分降解竹叶内的纤维素和木质素,利用果胶酶充分降解叶片表面的果胶质,同时结合超声波的作用,既能激活酶的活性又能加速黄酮的溶出,从而使竹叶总黄酮的提取率显著提高。
(2)由于竹叶经过超声酶解后,提取液中存在颗粒较大的悬浮颗粒、重金属离子及各种鞣质和色素等大分子不稳定性杂质而严重影响提取物的纯度和品质。因此,本发明先加入壳聚糖,利用其吸附架桥和对负电荷的中和作用,除去中药提取液中悬浮颗粒重金属离子,然后加入101果汁澄清剂,利用101果汁澄清剂的吸附和聚凝的双重作用,使所述的大分子杂质快速聚凝沉淀;同时,所述的101果汁澄清剂对溶液中的残留壳聚糖也同样具有吸附和聚凝作用,进一步消除了残留的壳聚糖对提取物品质的影响。
(3)此外,本发明所述方法还具有过程操作简单、耗时少、成本低和安全无毒的优点。
附图说明
图1为异荭草苷标准曲线。
具体实施方式
例1
1、提取竹叶总黄酮
(1)先做前期的准备工作,即,将竹叶干燥并粉碎成粗粉;取等量的纤维素酶和果胶酶加入水制备成浓度为0.1%的复合酶溶液;取壳聚糖0.8g,加入到80mL浓度为1%醋酸溶液中配成壳聚糖浓度为1%的壳聚糖胶体溶液,备用;取101果汁澄清剂4g,加入到80mL蒸馏水中配成101果汁澄清剂浓度为5%的101果汁澄清剂水溶液,备用。
(2)取竹叶粗粉1000g,加入15倍的复合酶溶液,再将溶液的pH值调到5.0,然后在50℃下超声(50KHZ,160W)处理1.0h后迅速升温至90℃,保持5min灭酶,滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)。
(3)于60℃时条件下,先加入壳聚糖胶体溶液80mL,充分搅拌,再加入101果汁澄清剂水溶液80mL,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液。
(4)将上清液过D101大孔树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥,称重,得竹叶总黄酮粗品22g。
2、竹叶总黄酮的纯度测定
(1)对照品储备溶液的制备:精密称取异荭草苷对照品15mg,加入50%乙醇制成浓度为0.15mg异荭草苷/1mL50%乙醇的溶液作为对照品备用。
(2)标准曲线的绘制:准确吸取对照品0.5mL,1.0mL,,2.0mL,3.0mL,4.0mL,5.0mL分别置于6个10mL的容量瓶中,再向每个容量瓶中加入浓度为5%的NaNO2溶液0.3mL摇匀,放置6min后加浓度为10%的Al(NO3)3溶液0.3mL摇匀,再放置6min后加入浓度为4%的NaOH溶液4mL,然后用50%乙醇定容至10mL并摇匀,放置10min后置比色皿中在波长400~600nm之间测定吸收光谱,在最大吸收波长为505nm条件下分别测得每个容量瓶中对照品的吸光度。以对照品的浓度为横坐标(X)值,吸光度为纵坐标(Y)值,在直角坐标系中绘制出6个对应点的坐标,然后进行线性回归得到相关系数为r=0.9997的标准曲线为Y=13.34X+0.008,标准曲线见图1。
(3)样品中总黄酮的含量测定:精密称取竹叶总黄酮粗品20mg置于25mL量瓶中,加浓度为50%的乙醇定容,滤过;精密量取续滤液1mL置于10mL量瓶中,加浓度为50%的乙醇定容;然后从10mL的量瓶中精密量取5mL,并按上述步骤(2)所述的方法,依次加入NaNO2、Al(NO3)3和NaOH溶液,再用50%乙醇定容至10mL得到待测样品并测定吸光度(本例的测定结果为0.403);最后,将所测得的吸光度值代入方程Y=13.34X+0.008,再根据待测样品的制备过程计算出待测样品中总黄酮的量(本例所得22g竹叶总黄酮粗品中含总黄酮的量为[(0.403-0.008)/13.34]×2×10×25×22000/20=16285.6mg),即得竹叶总黄酮粗品中总黄酮的含量。本例所得22g竹叶总黄酮粗品的总黄酮含量为16.2856/22=74%。
例2
(1)将竹叶干燥并粉碎成粗粉;取等量的纤维素酶和果胶酶加入水制备成浓度为0.15%的复合酶溶液;按例1相同的方法配制出壳聚糖浓度为1%的壳聚糖胶体溶液和101果汁澄清剂浓度为5%的101果汁澄清剂水溶液,备用。
(2)取竹叶粗粉1000g,加入10倍的复合酶溶液,再将溶液的pH值调到4.5,然后在40℃下超声(50KHZ,160W)处理0.5h后迅速升温至90℃,保持5min灭酶,滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)。
(3)于60℃时条件下,先加入壳聚糖胶体溶液80mL,充分搅拌,再加入101果汁澄清剂水溶液80mL,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液。
(4)将上清液过D101大孔树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥,称重,得竹叶总黄酮粗品18g,按例1所述的竹叶总黄酮的纯度测定方法,测得所得18g竹叶总黄酮粗品的总黄酮含量为68%。
例3
(1)将竹叶干燥并粉碎成粗粉;取等量的纤维素酶和果胶酶加入水制备成浓度为0.05%的复合酶溶液;按例1相同的方法配制出壳聚糖浓度为1%的壳聚糖胶体溶液和101果汁澄清剂浓度为5%的101果汁澄清剂水溶液,备用。
(2)取竹叶粗粉1000g,加入20倍的复合酶溶液,再将溶液的pH值调到6.0,然后在60℃下超声(50KHZ,160W)处理1.5h后迅速升温至85℃,保持5min灭酶,滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)。
(3)于60℃时条件下,先加入壳聚糖胶体溶液80mL,充分搅拌,再加入101果汁澄清剂水溶液80mL,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液。
(4)将上清液过D101大孔树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥,称重,得竹叶总黄酮粗品20g,按例1所述的竹叶总黄酮的纯度测定方法,测得所得20g竹叶总黄酮粗品的总黄酮含量为70%。
例4(比较例)
(1)将竹叶干燥并粉碎成粗粉;取等量的纤维素酶和果胶酶加入水制备成浓度为0.1%的复合酶溶液。
(2)取竹叶粗粉1000g,加入15倍的复合酶溶液,再将溶液的pH值调到5.0,然后在50℃下超声(50KHZ,160W)处理1.0h后迅速升温至90℃,保持5min灭酶,滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)。
(3)加入适量乙醇,使含醇量达60~80%,静置冷藏12小时,取上清液回收乙醇,浓缩,滤过,取上清液。
(4)将上清液过D101大孔树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥,称重,得竹叶总黄酮粗品15g,按例1所述的竹叶总黄酮的纯度测定方法,测得所得15g竹叶总黄酮粗品的总黄酮含量为30%。
将本例与例1相比可见,超声酶解和大孔树脂纯化的步骤完全相同,只是将絮凝除杂改用乙醇沉淀去除杂质,所得粗品的纯度就明显降低。
例5(比较例)
(1)将竹叶干燥并粉碎成粗粉;取等量的纤维素酶和果胶酶加入水制备成浓度为0.1%的复合酶溶液;按例1相同的方法配制出壳聚糖浓度为1%的壳聚糖胶体溶液,备用。
(2)取竹叶粗粉1000g,加入15倍的复合酶溶液,再将溶液的pH值调到5.0,然后在50℃下超声(50KHZ,160W)处理1.0h后迅速升温至90℃,保持5min灭酶,滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)。
(3)于60℃时条件下,加入壳聚糖胶体溶液80mL,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液。
(4)将上清液过D101大孔树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥,称重,得竹叶总黄酮粗品25g,按例1所述的竹叶总黄酮的纯度测定方法,测得所得25g竹叶总黄酮粗品的总黄酮含量为38%。
将本例与例1相比可见,超声酶解和大孔树脂纯化的步骤完全相同,只是将絮凝除杂步骤中的101果汁澄清剂澄清的步骤略去,所得粗品的纯度也明显降低。
例6(比较例)
(1)将竹叶干燥并粉碎成粗粉;取等量的纤维素酶和果胶酶加入水制备成浓度为0.1%的复合酶溶液。按例1相同的方法配制出101果汁澄清剂浓度为5%的101果汁澄清剂水溶液,备用。
(2)取竹叶粗粉1000g,加入15倍的复合酶溶液,再将溶液的pH值调到5.0,然后在50℃下超声(50KHZ,160W)处理1.0h后迅速升温至90℃,保持5min灭酶,滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)。
(3)于60℃时条件下,加入101果汁澄清剂水溶液80mL,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液。
(4)将上清液过D101大孔树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥,称重,得竹叶总黄酮粗品26g,按例1所述的竹叶总黄酮的纯度测定方法,测得所得26g竹叶总黄酮粗品的总黄酮含量为33%。
将本例与例1相比可见,超声酶解和大孔树脂纯化的步骤完全相同,只是将絮凝除杂步骤中的壳聚糖澄清的步骤略去,所得粗品的纯度也明显降低。
例7(比较例)
(1)将竹叶干燥并粉碎成粗粉;取纤维素酶加入水制备成浓度为0.1%的复合酶溶液;按例1相同的方法配制出壳聚糖浓度为1%的壳聚糖胶体溶液和101果汁澄清剂浓度为5%的101果汁澄清剂水溶液,备用。
(2)取竹叶粗粉1000g,加入15倍的酶溶液,再将溶液的pH值调到5.0,然后在50℃下超声(50KHZ,160W)处理1.0h后迅速升温至90℃,保持5min灭酶,滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)。
(3)于60℃时条件下,先加入壳聚糖胶体溶液80mL,充分搅拌,再加入101果汁澄清剂水溶液80mL,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液。
(4)将上清液过D101大孔树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥,称重,得竹叶总黄酮粗品12g,按例所述的竹叶总黄酮的纯度测定方法,测得所得12g竹叶总黄酮粗品的总黄酮含量为62%。
将本例与例1相比可见,絮凝除杂和大孔树脂纯化的步骤完全相同,只是将超声酶解步骤中的复合酶改用单一的纤维素酶,竹叶总黄酮的得率就明显降低。
例8(比较例)
(1)将竹叶干燥并粉碎成粗粉;取果胶酶加入水制备成浓度为0.1%的复合酶溶液;按例1相同的方法配制出壳聚糖浓度为1%的壳聚糖胶体溶液和101果汁澄清剂浓度为5%的101果汁澄清剂水溶液,备用。
(2)取竹叶粗粉1000g,加入15倍的酶溶液,再将溶液的pH值调到5.0,然后在50℃下超声(50KHZ,160W)处理1.0h后迅速升温至90℃,保持5min灭酶,滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)。
(3)于60℃时条件下,先加入壳聚糖胶体溶液80mL,充分搅拌,再加入101果汁澄清剂水溶液80mL,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液。
(4)将上清液过D101大孔树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥,称重,得竹叶总黄酮粗品10g,按例1所述的竹叶总黄酮的纯度测定方法,测得所得10g竹叶总黄酮粗品的总黄酮含量为60%。。
将本例与例1相比可见,絮凝除杂和大孔树脂纯化的步骤完全相同,只是将超声酶解步骤中的复合酶改用单一的果胶酶,竹叶总黄酮的得率也明显降低。
Claims (2)
1.一种提取竹叶总黄酮的方法,该方法由以下步骤组成:
(1)超声酶解:取竹叶干燥、粉碎后加入10~20倍的质量浓度为0.05%~0.15%的复合酶溶液,再将溶液的pH值调至4.5~6,然后在40~60℃下超声处理0.5~1.5小时后迅速升温至85~90℃,保持5min灭酶,滤过,收集滤液,减压浓缩至相对密度为1.12;其中,所述的复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物,二者的质量配比为1∶1;
(2)絮凝除杂:于60℃条件下,先按80mL壳聚糖胶体溶液/1000mL浓缩液的比例往浓缩液中加入壳聚糖,充分搅拌,再按80mL 101果汁澄清剂水溶液/1000mL浓缩液的比例加入101果汁澄清剂水溶液,充分搅拌,静置过夜,离心分离,取上清液;其中,所述的壳聚糖胶体溶液是体积浓度为1%的醋酸溶液与壳聚糖混合制成的壳聚糖质量浓度为1%的醋酸溶液,所述的101果汁澄清剂水溶液是水与101果汁澄清剂混合制成的的101果汁澄清剂质量浓度为5%的水溶液。
(3)过大孔树脂柱:将上清液过D101树脂柱,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥即得竹叶总黄酮。
2.根据权利要求1所述的一种提取竹叶总黄酮的方法,其特征在于,所述的超声酶解的最佳条件为:复合酶溶液的加入量为竹叶干粉的15倍;复合酶溶液的质量浓度为1%;竹叶干粉与复合酶溶液混合的溶液的pH值调至5;超声处理的温度为50℃,时间为1小时。
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