CN114159487A - 一种艾叶总黄酮的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于艾叶有效活性成分提取技术领域，公开一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，包括以下步骤：将艾叶干燥后粉碎，获得艾叶粉末，备用；将艾叶粉末置于水溶剂中，并于50～70℃的温度下浸泡20～60min，获得第一混合物，随后对第一混合物进行超声微波处理，离心后用微孔膜进行过滤，获得艾叶总黄酮提取液；将所述艾叶总黄酮提取液稀释后经色谱柱进行柱层析纯化，浓缩后冷冻干燥，即获得提取纯化后的艾叶总黄酮。本发明将超声波提取法和微波提取法结合，同时采用微孔膜过滤与新型HPD722树脂进行层析纯化，技术具有提高效率，大大缩短提取时间、降低能耗等优点，对艾叶总黄酮提取的研究具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及艾叶有效活性成分提取技术领域，尤其涉及一种艾叶总黄酮的提取纯化方法。
背景技术
艾草(Artemisia argyi)，又称艾蒿、香艾、冰台等，为菊科多年生草本植物，在我国境内分布广泛；艾草与中国人的饮食文化有着密切的关系，在我国作为药食同源植物已有两千余年使用历史。艾草作为具有明显特色的保健蔬菜，有降血脂、降胆固醇等食疗功效；民间有将艾草制作成青团、糍粑、米果、糕点等食品，以及将鲜嫩艾草炒菜煮粥、将艾根煲汤，制作艾茶艾酒等饮品的做法。艾草在食品工业中多用于保健食品的开发和食品生产中的添加剂，如艾草阿胶红糖保健食品已经面世；有研究将艾草作为添加剂加入火腿肠、马铃薯粉丝中改善产品品质、降低产品蒸煮损失并且提高了产品的抗菌抗氧化能力。
艾草主要化学成分包括挥发油类、黄酮类、三萜类、多糖以及微量元素等。黄酮类物质是艾草主要成分，天然植物中黄酮类物质抗炎特性目前已有报道，黄酮类物质作为有效的抗氧化剂，能够清除机体内的各类自由基并抑制其形成。目前研究也发现艾草水提液具有抗菌消炎、镇痛、保肝利胆、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力、对大鼠有抗肝纤维化作用等功效。
常见的艾草总黄酮传统提取工艺包括加压溶剂法、浸提法、索氏抽提法等，但是制备得到的水提液艾草总黄酮提取率相对较低(提取率≤6％)，且提取时间较长，成本也较高。
为此，本发明提供一种艾叶总黄酮的提取纯化方法。
发明内容
为了解决上述现有技术中的不足，本发明提供一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，本发明将超声波提取法和微波提取法结合，同时采用微孔膜过滤与新型HPD722树脂进行层析纯化，技术具有提高效率，大大缩短提取时间、降低能耗等优点，对艾叶总黄酮提取的研究具有非常重要的意义，对艾叶中的生物活性物质的充分利用提供一种新思路。
本发明的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法是通过以下技术方案实现的：
一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将艾叶干燥至含水量为5％～6％后，粉碎至粒径为50～70目，获得艾叶粉末，备用；
步骤2，将艾叶粉末置于水溶剂中，并于50～70℃的温度下浸泡20～60min，获得第一混合物，随后对第一混合物进行超声微波处理，离心后用微孔膜进行过滤，获得艾叶总黄酮提取液；
步骤3，将所述艾叶总黄酮提取液经色谱柱进行柱层析纯化，浓缩后冷冻干燥，即获得提取纯化后的艾叶总黄酮。
进一步地，所述浓缩是将柱层析后获得的提取液置于旋转蒸发仪中，于30～40℃温度下以15～20r/s的速率将柱层析后提取液中的醇溶液挥发完全，即获得浓缩后的提取液。
进一步地，所述冷冻干燥的温度为-90～-70℃，时间为24～60h。
进一步地，所述微孔膜为硝酸纤维素微孔膜，且所述微孔膜的孔径为30～50μm。
进一步地，步骤3中，所述色谱柱为HPD722树脂柱，且所述HPD722树脂柱是通过以下步骤制得的：
将HPD722大孔树脂先用乙醇浸泡12～36h，随后使用蒸馏水洗至无醇味后，再用质量浓度为3％～7％的HCl浸泡2～6h，随后使用蒸馏水洗至中性，再用质量浓度为3％～7％的的NaOH浸泡2～6h，然后用蒸馏水水洗至中性，获得活化后的HPD722大孔树脂；
将活化后的HPD722大孔树脂与水混合均匀后填充于柱子中得到HPD722大孔树脂柱。
进一步地，所述HPD722大孔树脂与水的用量比为1:8～12。
进一步地，步骤3中，柱层析纯化时，艾叶总黄酮提取液的上样量与所述色谱柱中HPD722树脂的填充量之比为8～12mL:1g。
进一步地，步骤3中，柱层析纯化时，洗脱液包括第一洗脱液和第二洗脱液；
先用第一洗脱液洗至无色后再用第二洗脱液进行洗脱。
进一步地，所述第一洗脱液为水，以除去残存的色素和杂质；
所述第二洗脱液为质量浓度为50％～70％的乙醇，以获得较纯的洗脱目标物。
进一步地，所述第一洗脱液和第二洗脱液的洗脱速率为1～2mL/min。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明以干燥艾叶为原料，利用超声-微波协同仪辅助水溶液提取获得艾叶总黄酮粗提液，采用HPD722大孔树脂纯化后经真空浓缩和冷冻干燥得到高纯度的艾叶总黄酮粉末。本发明提供的技术从艾叶总黄酮提取率和抗氧化活性出发，确定一种艾叶总黄酮提取率较高，同时对自由基清除效果较好的提取工艺，以期为艾叶黄酮进一步的应用研究提供新思路。
本发明采用超声和微波协同辅助技术，从艾叶中提取总黄酮，具有较高的创新性，解决了传统生产工艺艾叶黄酮提取率低、耗时长等问题，确定了超声-微波协同辅助提取的最佳工艺条件，有效提升了艾叶总黄酮的提取效率。本发明中考虑到艾叶粉碎后颗粒性较大的特点，采用预先水浴浸泡再提取，可大大提高艾叶总黄酮的提取效率。
本发明中采用30-50μm的微孔膜过滤器过滤提取液，高效去除了提取液中其他杂质，有效提高了产品纯度。
本发明中采用HPD722大孔树脂进行总黄酮的纯化，HPD722树脂吸附及解吸率高，产品纯度好，并可活化反复使用，明显降低生产成本。
附图说明
图1为以芦丁作为标准品绘制的总黄酮含量标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例提供一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，包括以下步骤：
步骤1，将艾叶干燥至含水量为6％后，粉碎至粒径为60目，获得艾叶粉末，备用。
步骤2，将1g艾叶粉末置于水溶剂中，并于60℃的温度下浸泡40min，获得第一混合物，将第一混合物进行置于微波光波超声波萃取仪中进行超声微波处理，随后使用双层纱布过滤，收集滤液进行离心处理，然后收集离心处理后的上清液用微孔膜进行过滤，获得艾叶总黄酮提取液；
其中，艾叶粉末与水溶液的用量比为1g:30mL；
超声微波处理的条件为：超声功率340W，超声27min，微波功率600W，微波时间120s，使得超声微波同时进行；
离心处理的速率为5000r/min，离心时间为10min；
所述微孔膜的孔径为40μm，以进一步去除提取液中的悬浮物、砂粒、杂质。
步骤3，将艾叶总黄酮提取液经柱层析，浓缩后冷冻干燥，即获得提取纯化后的艾叶总黄酮：
将HPD722大孔树脂先用乙醇浸泡24h，随后使用蒸馏水洗至无醇味后，再用质量浓度为5％的HCl浸泡4h，随后使用蒸馏水洗至中性，再用质量浓度为5％的NaOH浸泡4h，然后用蒸馏水水洗至中性，获得活化后的HPD722大孔树脂；
将活化后的HPD722大孔树脂与水按1:10的质量比混合均匀后填充于柱子中得到HPD722大孔树脂柱，备用；
将步骤2得到的艾叶总黄酮提取液以2.0mL/min的流速加入到上述HPD722大孔树脂柱中；艾叶总黄酮提取液的上样量与色谱柱中HPD722树脂的填充量之比为10mL:1g；
先使用蒸馏水洗脱，直至洗脱液无色，然后用60％乙醇洗脱，洗脱速率为1.5mL/min，用紫外分光光度计测洗脱液吸光度，达到510nm开始收集目标洗脱液至洗脱液无色停止收集，得到目标洗脱液；
将目标洗脱液置于真空旋蒸发仪中，于36℃温度下以18r/s的速率将目标洗脱液中的醇溶液挥发完全，获得浓缩后的提取液，随后将浓缩后的提取液于-80℃温度下干燥48h，得到高纯度的艾叶总黄酮粉末。
本实施例中，目标洗脱液收集完毕之后，HPD722树脂进行重新进行活化，实现柱子的再次利用。
本实施例中，真空浓缩步骤完毕后，收集旋蒸出的乙醇，将其用于下次浸提，实现乙醇的再次利用。
实施例2
本实施例提供一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，包括以下步骤：
步骤1，将艾叶干燥至含水量为6％后，粉碎至粒径为50目，获得艾叶粉末，备用。
步骤2，将1g艾叶粉末置于水溶剂中，并于50℃的温度下浸泡60min，获得第一混合物，将第一混合物进行置于微波光波超声波萃取仪中进行超声微波处理，随后使用双层纱布过滤，收集滤液进行离心处理，然后收集离心处理后的上清液用微孔膜进行过滤，获得艾叶总黄酮提取液；
其中，艾叶粉末与水溶液的用量比为1g:20mL；
超声微波处理的条件为：超声功率320W，超声30min，微波功率500W，微波时间150s，使得超声微波同时进行；
离心处理的速率为4000r/min，离心时间为15min；
所述微孔膜的孔径为30μm，以进一步去除提取液中的悬浮物、砂粒、杂质。
步骤3，将艾叶总黄酮提取液经柱层析，浓缩后冷冻干燥，即获得提取纯化后的艾叶总黄酮：
将HPD722大孔树脂先用乙醇浸泡24h，随后使用蒸馏水洗至无醇味后，再用质量浓度为5％的HCl浸泡4h，随后使用蒸馏水洗至中性，再用质量浓度为5％的NaOH浸泡4h，然后用蒸馏水水洗至中性，获得活化后的HPD722大孔树脂；
将活化后的HPD722大孔树脂与水按1:8的质量比混合均匀后填充于柱子中得到HPD722大孔树脂柱，备用；
将步骤2得到的艾叶总黄酮提取液以2.0mL/min的流速加入到上述HPD722大孔树脂柱中；艾叶总黄酮提取液的上样量与所述色谱柱中HPD722树脂的填充量之比为8mL:1g；
先使用蒸馏水洗脱，直至洗脱液无色，然后用50％乙醇洗脱，洗脱速率为1mL/min，用紫外分光光度计测洗脱液吸光度，达到510nm开始收集目标洗脱液至洗脱液无色停止收集，得到目标洗脱液；
将目标洗脱液置于真空旋蒸发仪中，于30℃温度下以20r/s的速率将目标洗脱液中的醇溶液挥发完全，获得浓缩后的提取液，随后将浓缩后的提取液于-90℃温度下干燥60h，得到高纯度的艾叶总黄酮粉末。
实施例3
本实施例提供一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，包括以下步骤：
步骤1，将艾叶干燥至含水量为5％后，粉碎至粒径为70目，获得艾叶粉末，备用。
步骤2，将1g艾叶粉末置于水溶剂中，并于70℃的温度下浸泡20min，获得第一混合物，将第一混合物进行置于微波光波超声波萃取仪中进行超声微波处理，随后使用双层纱布过滤，收集滤液进行离心处理，然后收集离心处理后的上清液用微孔膜进行过滤，获得艾叶总黄酮提取液；
其中，艾叶粉末与水溶液的用量比为1g:40mL；
超声微波处理的条件为：超声功率360W，超声20min，微波功率700W，微波时间90s，使得超声微波同时进行；
离心处理的速率为6000r/min，离心时间为5min；
所述微孔膜的孔径为50μm，以进一步去除提取液中的悬浮物、砂粒、杂质。
步骤3，将艾叶总黄酮提取液经柱层析，浓缩后冷冻干燥，即获得提取纯化后的艾叶总黄酮：
将HPD722大孔树脂先用乙醇浸泡24h，随后使用蒸馏水洗至无醇味后，再用质量浓度为5％的HCl浸泡4h，随后使用蒸馏水洗至中性，再用质量浓度为5％的NaOH浸泡4h，然后用蒸馏水水洗至中性，获得活化后的HPD722大孔树脂；
将活化后的HPD722大孔树脂与水按1:12的质量比混合均匀后填充于柱子中得到HPD722大孔树脂柱，备用；
将步骤2得到的艾叶总黄酮提取液稀释至2.5mg/mL，得到稀释后的艾叶总黄酮提取液，随后将稀释后的艾叶总黄酮提取液以2.0mL/min的流速加入到上述HPD722大孔树脂柱中；其中，艾叶总黄酮提取液的上样量与所述色谱柱中HPD722树脂的填充量之比为12mL:1g；
先使用蒸馏水洗脱，直至洗脱液无色，然后用60％乙醇洗脱，洗脱速率为1.5mL/min，用紫外分光光度计测洗脱液吸光度，达到510nm开始收集目标洗脱液至洗脱液无色停止收集，得到目标洗脱液；
将目标洗脱液置于真空旋蒸发仪中，于40℃温度下以15r/s的速率将目标洗脱液中的醇溶液挥发完全，获得浓缩后的提取液，随后将浓缩后的提取液于-70℃温度下干燥24h，得到高纯度的艾叶总黄酮粉末。
对比例1
本对比例与实施例1的不同仅在于，不用超声微波萃取处理，而替换为传统煎煮法提取，其他操作与实施例1相同。
本对比例的传统传统煎煮法是依据文献(田秀红,黎梅,张慧姣,高文玲,田文轩.河北酸枣总黄酮提取工艺研究[J].食品研究与开发,2015,36(13):76-78)中的方法进行的。
对比例2
本对比例与实施例1的不同仅在于，不用超声微波萃取处理，而替换为传统水浴加热提取法提取，其他操作与实施例1相同。
本对比例的传统水浴加热提取法是依据文献(乌兰托雅.枸杞山楂共水提取工艺研究[J].内蒙古医学志,2004(12):1040-1041)中的方法进行的。
对比例3
本对比例与实施例1的不同仅在于，不用采用微孔膜进行过滤处理，其他操作与实施例1相同。
试验部分
为了验证本发明的提取纯化效果，本发明对实施例1和实施例2提取纯化的样品进行了以下测试。
(一)艾草总黄酮含量测试
本发明以芦丁作为标准品绘制标准曲线(见图1)，测定本发明实施例1和对比例1-3提取纯化的样品中艾草总黄酮含量，结果如表1所示。
由表1可以看出，本发明的提取纯化方法得到的艾叶总黄酮粉末，其中艾叶总黄酮提取量可达87.93mg/g，均显著优于传统方法提取的艾叶总黄酮含量，表明采用本发明方法可有效提升艾叶总黄酮的提取率。
表1艾草总黄酮含量测试结果
注：表1中，a、b、c、d表示差异显著(p＜0.05)。
(二)抗氧化活性测试
本发明对实施例1和对比例1-2提取纯化样品的相关抗氧化指标进行评价，结果如表1所示，可以看出本发明实施例1艾叶总黄酮粉末的羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力分别为77.92％、80.84％，均显著优于传统方法提取的艾叶总黄酮抗氧化能力，表明采用本发明技术提纯的艾叶总黄酮具有较强的抗氧化活性。
表2抗氧化活性测试结果
| 试验例 | 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 |
| DPPH清除率(％) | 80.84±0.45<sup>a</sup> | 80.62±0.15<sup>a</sup> | 78.14±0.25<sup>b</sup> |
| ·OH清除率(％) | 77.92±1.92<sup>a</sup> | 66.17±3.97<sup>b</sup> | 71.38±1.99<sup>c</sup> |
注：表1中，a、b、c表示差异显著(p＜0.05)。
需要说明的是，本发明对于艾叶总黄酮粉末的DPPH自由基清除能力是依据文献(Blois MS.Antioxidant determination by the use of a stable freeradical.Nature,1958,26:1199-1200)中的方法进行测试的。
本发明对于艾叶总黄酮粉末的羟自由基清除能力是依据文献(SmimoffN,CumbesQ J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes.Pbytochemistr,1989,28:1057-1060.)中的方法进行测试的。
显然，上述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将艾叶干燥后粉碎，获得艾叶粉末，备用；
步骤2，将艾叶粉末置于水溶剂中，并于50～70℃的温度下浸泡20～60min，获得第一混合物，随后对第一混合物进行超声微波处理，离心后用微孔膜进行过滤，获得艾叶总黄酮提取液；
步骤3，将所述艾叶总黄酮提取液稀释后经色谱柱进行柱层析纯化，浓缩后冷冻干燥，即获得提取纯化后的艾叶总黄酮。
2.如权利要求1所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述微孔膜的孔径为30～50μm。
3.如权利要求1所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，步骤3中，所述色谱柱为HPD722树脂柱。
4.如权利要求3所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，步骤3中，柱层析纯化时，艾叶总黄酮提取液的上样量与所述色谱柱中HPD722树脂的填充量之比为8～12mL:1g。
5.如权利要求1所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，步骤3中，柱层析纯化时，洗脱液包括第一洗脱液和第二洗脱液；
先用第一洗脱液洗至无色后再用第二洗脱液进行洗脱。
6.如权利要求5所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述第一洗脱液为水；
所述第二洗脱液为质量浓度为50％～70％的乙醇。
7.如权利要求5所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述第一洗脱液和第二洗脱液的洗脱速率为1～2mL/min。
8.如权利要求1所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述艾叶粉末与水溶液的用量比为1g:20～40mL。
9.如权利要求1所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述超声微波处理的条件为：
超声功率为320～360W，超声时间为20～30min；
微波功率为500～700W，微波时间为90～150s。
10.如权利要求1所述的一种艾叶总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述离心的速率为4000～6000r/min，离心时间为5～15min。
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