CN111358821A - 一种响应面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法 - Google Patents

一种响应面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药提取技术领域，尤其是一种响应面法优化酶解超声辅助提取艾叶总黄酮的方法，包括以下步骤：(1)原料处理：将艾叶干燥、粉碎，制得艾叶粉末；(2)酶解：向阿艾叶粉末中加入酶、缓冲液进行酶解，利用响应面法优化的酶解工艺条件，酶解过后，液过滤，获得滤渣和酶解滤液；(3)提取：滤渣中加入乙醇超声提取，获得醇提取液；(4)浓缩干燥。本发明通过对艾叶进行酶解辅助超声法提取，并对提取过程中的酶用量、酶解pH值、酶解时间、酶解温度等工艺参数进行合理的确定和选择，使得艾叶总黄酮产率高达10.99mg/g以上，超声提取时间为20min。达到了高效提取艾叶总黄酮的目的。

Description

一种响应面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法
技术领域
本发明涉及中药提取技术领域，尤其是一种响应面法优化酶解超声辅助提取艾叶总黄酮的方法。
背景技术
艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi Lévl.Et Vant)的干燥叶，具有温经止血、散寒止痛、祛湿止痒的功效。艾叶中含挥发油、倍半萜类及黄酮类化合物等成分，其中黄酮类是主要活性物质。药理研究表明艾叶黄酮类成分具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等作用。
植物细胞由纤维素、果胶等成分构成的致密结构，阻碍溶剂的渗透和有效成分的释放。而酶具有专一性，故可针对细胞壁成分，选用适宜的酶，使细胞壁产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，从而降低有效成分从细胞内向提取介质扩散的阻力，提高溶出效率。超声波技术是利用超声空化作用引起的湍动效应、微波效应、界面效应、聚能效应等，产生的强大剪切力能使植物细胞壁破裂，使细胞更容易释放内容物，同时促进溶剂进入提取物细胞，加速成分进入溶剂。
响应面法是工艺优化常用的有效方法。响应面法是以非线性拟合的回归方程为函数计算的工具，对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并进行优化。它是一种优化反应条件和工艺参数的有效方法。正交设计法可同时考虑多种因素，寻求最佳因素组合，但是无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。响应面法克服了正交设计只能处理离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。
目前，酶辅助提取、超声辅助提取、响应面法已被研究用于艾叶黄酮提取技术。如文献《响应曲面法优化超声波辅助提取艾叶中总黄酮的工艺研究》(山西化工，2018)中以艾叶为原料，采用单因素实验与相应曲面分析法相结合，研究了超声辅助提取艾叶中总黄酮的影响因素及最佳工艺条件。结果表明，超声辅助提起艾叶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数60％，提取时间为60min，液固比为20:1(mL/g),提取温度为40℃,艾叶中总黄酮的提取率为9.15％。
又如公开号为CN107595915A专利中公开了一种艾草提取物的生产方法：先将新鲜艾叶切碎匀浆，加入纤维素酶粉酶解，制得酶解液；然后将酶解液经水蒸气蒸馏提取、过滤、第一次喷雾干燥处理，制得艾叶油粗提液(馏出液)、蒸馏液、滤出液、原料粗粉，原料粗粉经醇提、抽滤、超滤、第二次喷雾干燥处理制得艾草黄酮提取物粗粉；再将艾草黄酮粗粉经AB-8大孔树脂吸附、第三次喷雾干燥，制得艾草黄酮提取物干粉。
上述文献或专利都是采用单独的酶法辅助提取法、超声辅助提取法提取艾叶中的总黄酮。目前将酶法—超声辅助提取艾叶总黄酮的研究尚未见报道；本研究者对酶法和超声法结合应用于艾叶总黄酮提取进行探索，为艾叶总黄酮提取提供了一种新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种响应面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，与现有技术相比，大大缩短了提取时间，提高了提取效率。
具体通过以下技术方案实现的：
一种响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)原料处理：将艾叶干燥、粉碎，制得艾叶粉末；
(2)酶解：向阿艾叶粉末中加入酶、缓冲液进行酶解，利用响应面法优化的酶解工艺条件，酶解过后，液过滤，获得滤渣和酶解滤液；
(3)提取：滤渣中加入乙醇超声提取，获得醇提取液；
(4)浓缩干燥：将醇提取液和酶解滤液合并，采用旋转蒸发仪浓缩后，真空干燥箱烘干，制得艾叶总黄酮。
优选地，所述艾叶粉末的粒度为60目。
优选地，所述复合酶是由纤维素酶和果胶酶按2:1的质量比组成。
优选地，所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。
优选地，所述步骤(2)，利用响应面法优化酶解工艺参数，包括以下步骤：
a、单因素实验：确定艾叶黄酮提取条件：复合酶是由由纤维素酶和果胶酶按2:1的质量比组成，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，超声提提取条件：超声功率为200W，15倍60％乙醇、超声提取20min；对酶用量、酶解温度、酶解pH值、酶解时间进行单因素实验，以艾叶总黄酮产率为考察指标，确定4个因素在四个因素在其他因素不变前提下的最优水平；
b、响应面法优化：以酶用量、酶解时间、酶解温度、酶解pH值的最优水平为基础，根据Box-Benhnken设计原则进行四因素三水平实验设计，以酶用量、酶解pH值、酶解时间和酶解温度为自变量，以艾叶总黄酮产率为响应值，建立艾叶总黄酮产率的多元二次方程；
c、酶解工艺确定：对步骤b建立的多元二次方程进行响应面分析，取艾叶总黄酮产率为最大值，得出最优的酶解工艺条件。
优选地，所述艾叶总黄酮产率的多元二次方程为：Y＝-141.739+33.588A+27.477B+0.087C+2.820D-0.800AB+0.031AC-0.148AD+0.014BC+0.050BD-0.001CD-9.865A2-3.273B2-0.002C2-0.028D2；其中A为酶用量，B为酶解pH值，C为酶解时间，D为酶解温度，想响应值Y为总黄酮产率。
优选地，所述响应面法优化的酶解工艺条件为：酶用量为8～16mg/g、酶解pH值为3.5～5.5、酶解时间为15～75min、酶解温度为40～60℃。
优选地，所述响应面法优化的酶解工艺条件为：酶用量为12mg/g、酶解pH值为4.5、酶解时间为46min、酶解温度为450℃。
优选地，所述步骤(3)，超声提取的工艺条件为：超声功率为200W，15倍量60％乙醇，超声提取20min。
用响应面法优化酶解工艺参数，具体研究过程如下：
1、将艾叶干燥、粉碎至60目，得到艾叶粉末。艾叶粉末用酶解辅助超声法提取，提取液(酶解滤液和醇提取液)浓缩干燥，测定干浸膏的总黄酮含量。其中，所用酶为由纤维素酶和果胶酶(2:1)组成的复合酶；超声提取条件为：超声功率为200W，加入15倍量、60％乙醇，超声提取20min。对酶用量、酶解pH值、酶解时间、酶解温度作为艾叶总黄酮产率影响的四个因素，并将上述四个因素进行单因素试验，确定四个因素在其他因素不变前提下的最优水平，具体单因素试验操作如下步骤：
(1)酶用量单因素试验
以酶解pH 4.5，酶解时间45min，酶解温度50℃，酶用量8mg/g、10mg/g、12mg/g、14mg/g、16mg/g进行酶解辅助超声提取，并测定计算出艾叶总黄酮产率，得出酶用量最优值，其测定结果如图1所示。
从图1可知，在酶解pH值、酶解时间、酶解温度相同的条件下，随着酶用量的增加，当酶用量超过12mg/g时，艾叶总黄酮产率呈下降趋势。因此，酶用量以12mg/g为宜。
(2)酶解pH值单因素试验
以酶用量12mg/g，酶解时间45min，酶解温度50℃，酶解pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5进行酶解辅助超声提取，考察酶解pH值对艾叶总黄酮产率的影响，并测定计算出艾叶总黄酮产率，得到酶解pH值最优值，其结果如图2所示。
从图2可知，在酶解用量、酶解时间、酶解温度相同的条件下，艾叶总黄酮产率随着随着酶解pH值的增大而升高，当酶解pH值超过4.5，艾叶总黄酮产率呈下降趋势。因此，酶解pH值以4.5为宜。
(3)酶解时间单因素试验
以酶用量12mg/g，酶解pH4.5，酶解温度50℃，酶解时间15、30、45、60、75min进行酶解辅助超声提取，考察酶解时间对艾叶总黄酮产率的影响，其结果如图3所示。
从图3可知，在酶用量、酶解pH值、酶解温度相同的条件下，艾叶总黄酮产率随着酶解时间的延长而增加，当酶解时间超过45min时，艾叶总黄酮产率增加趋势趋于平缓。因此，酶解时间以45min为宜。
(4)酶解温度单因素试验
以酶用量12mg/g，酶解pH4.5，酶解时间45min，酶解温度40℃、45℃、50℃、55℃、60℃进行酶解辅助超声提取，考察酶解温度对艾叶总黄酮产率的影响，其结果如图4所示。
从图4可知，在酶用量、酶解pH值、酶解时间相同的条件下，艾叶总黄酮产率随着酶解温度的增大而升高。当酶解温度超过50℃时，艾叶总黄酮产率呈现下降趋势。因此，酶解温度以50℃为宜。
2、在完成以上单因素试验操作处理步骤之后，将上述单因素试验得到的结果拟定为最优水平，并进行响应面优化设计，具体水平设置表为表1：
表1因素水平设置表
Figure BDA0002455217760000051
利用Design-Expert软件根据Box-Benhnken设计原则进行四因素三水平实验设计，试验方案以及响应结果如表2所示：
表2响应面设计方案以及响应值
实验号 A B C D 艾叶总黄酮产率(％)
1 -1 -1 0 0 11.38
2 1 -1 0 0 11.64
3 -1 1 0 0 11.82
4 1 1 0 0 11.76
5 0 0 -1 -1 11.71
6 0 0 1 -1 12.04
7 0 0 -1 1 11.73
8 0 0 1 1 11.76
9 -1 0 0 -1 11.64
10 1 0 0 -1 12.02
11 -1 0 0 1 11.80
12 1 0 0 1 11.59
13 0 -1 -1 0 11.67
14 0 1 -1 0 11.58
15 0 -1 1 0 11.62
16 0 1 1 0 11.96
17 -1 0 -1 0 12.25
18 1 0 -1 0 12.27
19 -1 0 1 0 11.91
20 1 0 1 0 12.30
21 0 -1 0 -1 11.59
22 0 1 0 -1 11.54
23 0 -1 0 1 10.99
24 0 1 0 1 11.44
25 0 0 0 0 12.79
26 0 0 0 0 12.97
27 0 0 0 0 12.89
以酶用量A、酶解pH值B、酶解时间C、酶解温度D为自变量，以艾叶总黄酮产率为响应值Y，建立多元二次方程：
Y＝-141.739+33.588A+27.477B+0.087C+2.820D-0.800AB+0.031AC-0.148AD+0.014BC+0.050BD-0.001CD-9.865A2-3.273B2-0.002C2-0.028D2。
对上述艾叶总黄酮回归方程进行方差分析，其结果如表3所示：
表3艾叶总黄酮回归方程的方差分析
来源 平方和 自由度 方差 F值 P值
模型 5.32 14 0.38 29.35 <0.0001
A-酶用量 0.05 1 0.05 3.91 0.0714
B-酶解pH值 0.12 1 0.12 9.41 0.0097
C-酶解时间 0.01 1 0.01 0.93 0.3543
D-酶解温度 0.13 1 0.13 9.73 0.0089
AB 0.03 1 0.03 1.98 0.1852
AC 0.03 1 0.03 2.64 0.1301
AD 0.09 1 0.09 6.72 0.0236
BC 0.05 1 0.05 3.57 0.0833
BD 0.06 1 0.06 4.82 0.0485
CD 0.02 1 0.02 1.74 0.2122
A<sup>2</sup> 0.83 1 0.83 64.08 <0.0001
B<sup>2</sup> 3.57 1 3.57 275.6 <0.0001
C<sup>2</sup> 0.62 1 0.62 48.16 <0.0001
D<sup>2</sup> 2.69 1 2.69 207.95 <0.0001
残差 0.16 14 0.01
失拟 0.14 10 0.01 1.71 0.4245
纯误差 0.02 2 0.01
总和 5.48 26
3、并利用Design-Expert软件对多元二次回归方程进行响应面分析，得到回归方程各因素相互之间的响应面图，如图5～图10所示。最根据模型分析可知，艾叶总黄酮的酶解辅助超声法提取的优化工艺参数为：酶用量12.20mg/g、酶解pH值4.53、酶解时间46.17min、酶解温度49.59℃。考虑实际操作的局限性，将工艺参数修正为：酶用量12mg/g、酶解pH值4.5、酶解时间46min、酶解温度50℃。在此修正条件下进行了3次平行实验，艾叶总黄酮产率的平均值12.86％，相对误差为0.23％。与理论预测值较为接近，结果较理想。
本发明的有益效果在于：
本发明通过响应面法进行酶解辅助超声法提取艾叶总黄酮的工艺参数进行界定，其能够充分考虑各个因素及两两因素相互作用对得到充分的弥补和完善，避免了单因素试验处理之后的正交设计调整参数存在的片面性和离散型，通过响应面法得到了最佳提取艾叶总黄酮的工艺参数，该工艺高效、可控、稳定、可行。
本发明通过对艾叶进行酶解辅助超声法提取，并对提取过程中的酶用量、酶解pH值、酶解时间、酶解温度等工艺参数进行合理的确定和选择，使得艾叶总黄酮产率高达10.99mg/g以上，超声提取时间为20min。达到了高效提取艾叶总黄酮的目的。
附图说明
图1酶用量对艾叶总黄酮产率的影响图；
图2酶解pH值对艾叶总黄酮产率的影响图；
图3酶解时间对艾叶总黄酮产率的影响图；
图4酶解温度对艾叶总黄酮产率的影响图；
图5酶用量和酶解pH值对艾叶总黄酮产率的影响图；
图6酶用量和酶解时间对艾叶总黄酮产率的影响图；
图7酶用量和酶解温度对艾叶总黄酮产率的影响图；
图8酶解pH值和酶解时间对艾叶总黄酮产率的影响图；
图9酶解pH值与酶解温度对艾叶总黄酮产率的影响图；
图10酶解时间和酶解温度对艾叶总黄酮产率的影响图。
具体实施方式
下面结核具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
将艾叶干燥、烘干，并将其粉碎成60目的颗粒。称取艾叶粉末10.0000g，加入120mg复合酶(纤维素酶：果胶酶＝2:1)，加入150mL醋酸-醋酸钠缓冲液，pH值为4.5，在50℃下酶解45min后，过滤，获得酶解滤液和滤渣；向滤渣中加入60％乙醇150mL，超声提取20min，超声功率为200W，获得醇提取液；将酶解滤液和醇提取液合并，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h，称取并记录艾叶总黄酮粗提物。通过紫外-可见分光光度法测定得到艾叶总黄酮产率为12.79％。
实施例2
将艾叶干燥、烘干，并将其粉碎成60目的颗粒。称取艾叶粉末10.0000g，加入140mg复合酶(纤维素酶：果胶酶＝2:1)，获得酶解滤液和滤渣；加入150mL醋酸-醋酸钠缓冲液，pH值为4.5，在50℃下酶解60min后，过滤，向滤渣中加入60％乙醇150mL，超声提取20min，超声功率为(200W)，获得醇提取液；将酶解滤液和醇提取液合并，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h，称取并记录艾叶总黄酮粗提物。通过紫外-可见分光光度法测定得到艾叶总黄酮产率为12.30％。
实施例3
将艾叶干燥、烘干，并将其粉碎成60目的颗粒。称取艾叶粉末10.0000g，加入100mg复合酶(纤维素酶：果胶酶＝2:1)，加入150mL醋酸-醋酸钠缓冲液，pH值为4.5，在50℃下酶解30min后，过滤，获得酶解滤液和滤渣；向滤渣中加入60％乙醇150mL，超声提取20min，超声功率为(200W)，获得醇提取液；将酶解滤液和醇提取液合并，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h，称取并记录艾叶总黄酮粗提物。通过紫外-可见分光光度法测定得到艾叶总黄酮产率为12.25％
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

Claims (9)

1.一种响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料处理：将艾叶干燥、粉碎，制得艾叶粉末；
(2)酶解：向阿艾叶粉末中加入酶、缓冲液进行酶解，利用响应面法优化的酶解工艺条件，酶解过后，液过滤，获得滤渣和酶解滤液；
(3)提取：滤渣中加入乙醇超声提取，获得醇提取液；
(4)浓缩干燥：将醇提取液和酶解滤液合并，采用旋转蒸发仪浓缩后，真空干燥箱烘干，制得艾叶总黄酮。
2.如权利要求1所述的响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，其特征在于，所述艾叶粉末的粒度为60目。
3.如权利要求1所述的响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，其特征在于，所述复合酶是由纤维素酶和果胶酶按2:1的质量比组成。
4.如权利要求1所述的响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。
5.如权利要求1所述的响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)，利用响应面法优化酶解工艺参数，包括以下步骤：
a、单因素实验：确定艾叶黄酮提取条件：复合酶是由由纤维素酶和果胶酶按2:1的质量比组成，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，超声提提取条件：超声功率为200W、15倍量60％乙醇、超声提取20min；对酶用量、酶解温度、酶解pH值、酶解时间进行单因素实验，以艾叶总黄酮产率为考察指标，确定4个因素在四个因素在其他因素不变前提下的最优水平；
b、响应面法优化：以酶用量、酶解时间、酶解温度、酶解pH值的最优水平为基础，根据Box-Benhnken设计原则进行四因素三水平实验设计，以酶用量、酶解pH值、酶解时间和酶解温度为自变量，以艾叶总黄酮产率为响应值，建立艾叶总黄酮产率的多元二次方程；
c、酶解工艺确定：对步骤b建立的多元二次方程进行响应面分析，取艾叶总黄酮产率为最大值，得出最优的酶解工艺条件。
6.如权利要求5所述的响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，其特征在于，所述艾叶总黄酮产率的多元二次方程为：Y＝-141.739+33.588A+27.477B+0.087C+2.820D-0.800AB+0.031AC-0.148AD+0.014BC+0.050BD-0.001CD-9.865A2-3.273B2-0.002C2-0.028D2；其中A为酶用量，B为酶解pH值，C为酶解时间，D为酶解温度，想响应值Y为总黄酮产率。
7.如权利要求1或5所述的响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，其特征在于，所述响应面法优化的酶解工艺条件为：酶用量为8～16mg/g、酶解pH值为3.5～5.5、酶解时间为15～75min、酶解温度为40～60℃。
8.如权利要求7所述的响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，其特征在于，所述响应面法优化的酶解工艺条件为：酶用量为12mg/g、酶解pH值为4.5、酶解时间为46min、酶解温度为450℃。
9.如权利要求1所述的响面法优化酶解辅助超声提取艾叶总黄酮的方法，其特征在于，所述步骤(3)，超声提取的工艺条件为：超声功率为200W，15倍量60％乙醇，超声提取20min。
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