CN114480542B - 一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其包括：将小麦面筋蛋白加入水中形成悬浮液，之后依次进行脱淀粉、酶解、高温灭酶、乙醇分级萃取、大孔吸附树脂脱盐、葡聚糖凝胶柱分离纯化处理，再收集各峰组分以4000 r/min~6000 r/min的转速进行离心处理，并将收集的上清液进行冷冻干燥，获得所述苦味肽。本发明建立了一种小麦面筋蛋白苦味肽的萃取、分离及鉴定方法，克服了传统方法的复杂性，简单易操作且效果显著，有效地节约了人力与物力，为小麦面筋蛋白酶解物中苦味肽的萃取提供了一个新方法。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法。
背景技术
小麦面筋蛋白酶解液中含有丰富的小肽，具有溶解度高，抗原性低等优点，产生的一系列生物活性肽还具有降血压、抗氧化、抗肥胖、免疫调节、抗糖尿病、降胆固醇、抗癌和抗炎等活性（参阅 Current Protein & Peptide Science, 20(12): 1204-1217, 2019.），它可广泛应用于各种不同类型的食品及非食品领域，有助于增加产品的科技含量，促进蛋白质产业链向高附加值产品延伸，具有很好的应用前景，并蕴含巨大的市场潜力。
小麦面筋蛋白酶解产物具有多种生物活性而备受关注，但酶解过程会伴随着苦味肽的产生，苦味问题是制约其应用的一大瓶颈。苦味肽中的一些疏水性氨基酸同时又是必需氨基酸，营养价值较高，同时苦味肽也是一些小分子肽，具有良好的功能活性，尤其是分子量小于1000 Da的小肽，功能活性更加显著（参阅Journal of Animal Science, 86(9):2135-2155, 2008.）。目前对苦味肽的研究主要集中在脱苦方法上，比较常见的有：选择性分离法（参阅 Journal of the Science of Food and Agriculture, 99, 4651-4658,2019.）、掩盖法（参阅 Food Chemistry, 283, 621-627, 2019.）、类蛋白法（参阅 FoodChem, 345, 128783，2021.）、酶法（参阅 Food Chemistry, 214, 347-353，2017.）等。然而苦味肽的释放机制目前尚不清楚，有效萃取酶解产物中的苦味肽是探究苦味肽释放机理的基础。
目前分离苦味肽的方法主要有大孔树脂、超滤、纳滤、有机试剂萃取、凝胶色谱、离子交换色谱、电泳等（参阅 Food Science, 42(10): 1228-1239, 2006.）。但是存在耗时长、耗费大、操作繁琐、分离出的多肽没有太多种类等缺点。有机试剂萃取法中用异丁醇萃取的方法较多，虽能有效萃取酶解产物中的苦味肽，但是会引进有毒试剂，不利于后续在市场中的大规模应用。因此，有必要研究一种更有利的萃取苦味肽的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，以克服现有技术的不足。
为解决上述技术问题，本发明提供一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其包括：将小麦面筋蛋白加入水中形成悬浮液，之后依次进行脱淀粉、酶解、高温灭酶、乙醇分级萃取、大孔吸附树脂脱盐、葡聚糖凝胶状分离纯化处理，再取所获物料以4000 r/min~6000 r/min 的转速进行离心处理，并将收集的上清液进行冷冻干燥，获得所述苦味肽；
所述酶解处理过程中采用的酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。
优选的，所述的酶解小麦面筋蛋白制备苦味肽的方法包括：将小麦面筋蛋白与水按1:2~1:4的料液比在烧杯中搅拌均匀，升温至50～60℃，加入0.5%~1.5%的α-淀粉酶，在夹层烧杯中调节pH为6.0~7.0反应0.5~1.5 h，冷却至室温。4000 r/min~6000 r/min离心10~30 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。
优选的，所述酶解处理包括：向所述悬浮液内加水至料液比为1:15～1:25，待温度为50～55℃时，加入一种市售较为常见的食品级蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶），在恒温条件下维持反应体系的pH值7.0～8.0，酶解15～600min，之后于90~95℃条件下，灭酶10～20 min。
优选的，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶与小麦面筋蛋白的底物比（E/ S）为1:20～1:100。
优选的，所述高速离心处理包括：以4000～5500 r/min的转速离心15~20 min，之后收集所述的上清液。
优选的，所述乙醇分级萃取处理包括：将经酶解处理后的酶解液冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为15~25%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度为15~25 %，保持温度为25~35℃，水浴震荡20~40 min，以4000～5500 r/min的转速离心15~20min，并向收集的上清液中加入无水乙醇，使乙醇的最终浓度为35~45%，同等条件下水浴震荡、离心。以此类推，在上清液中继续加入无水乙醇，重复操作二次，当上清液中乙醇最终浓度为75~85%时，经水浴震荡、离心后，除去多余的乙醇溶液，将剩余的上清溶液冷冻干燥后，获得所述苦味肽。
优选的，所述大孔吸附树脂其型号为DA201-C，样品浓度为25~35 mg/mL，流速为1~2 mL/min，洗脱液为70~90%浓度的乙醇，每次上样量为25~35 mL。
优选的，所述葡聚糖凝胶为G-25型号，样品浓度为45~55 mg/mL,流速为1~2 mL/min，每次上样量为1~3 mL。
优选的，在所述酶解小麦面筋蛋白制备苦味肽的方法中，可以通过HCl、NaOH等调节物料体系的酸碱度。
优选的，所述苦味肽的含量>8%，苦味值>3.5，苦味肽中疏水氨基酸所占的比例>40%，苦味肽的疏水性>300。
本发明的上述技术方案至少包括以下有益效果：
1、本发明工艺采用的原料系小麦面筋蛋白，其属于纯天然植物蛋白，来源丰富、物美价廉、食用安全，同时，采用的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶均为内切蛋白酶，水解效率高，使苦味肽大量产生并暴露出来，作用效果显著；
2、本发明工艺采用的乙醇分级萃取苦味肽，避免了异丁醇等有毒试剂的引进，更加安全高效，同时，本发明工艺采用非极性的大孔吸附树脂分离纯化含有疏水性氨基酸的苦味肽，提高了产品的纯度。进一步的，本发明还联合葡聚糖凝胶依据相对分子质量的不同把苦味肽分离为几个不同的组分，最后结合感官评价分析出苦味最强的组分。总之，利用乙醇分级沉淀法、大孔吸附树脂色谱、SephadexG-25凝胶层析等技术可以准确、高效的萃取出酶解产物中的苦味肽；
3、本发明分离纯化所采用的乙醇溶剂可以通过旋转蒸发后回收再利用，大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶填料均可循环使用，成本低，且易于操作，为合理利用资源和能源、实现绿色化学提供新思路；
4、对分离纯化得到的苦味肽通过Q规则分析苦味的有无，并采用HPLC-MS/MS 和Byonic软件对苦味肽进行鉴定和序列分析，科学准确的揭示了小麦面筋蛋白中苦味肽的结构及其苦味特性。
附图说明
图1是本发明对照例1-4和实施例1-4中苦味肽的苦味值分布柱状图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一个方面的一些实施例提供了一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其步骤包括：将小麦面筋蛋白加入水中形成悬浮液，之后依次进行脱淀粉、酶解、高温灭酶、乙醇分级萃取、大孔吸附树脂脱盐、葡聚糖凝胶状分离纯化处理，再取所获物料以4000 r/min~6000 r/min 的转速进行离心处理，并将收集的上清液进行冷冻干燥，获得所述苦味肽；
进一步的，所述预处理过程为将小麦面筋蛋白与水按1：2~1：4的料液比在烧杯中搅拌均匀，升温至50～60℃，加入0.5%~1.5%的α-淀粉酶，在夹层烧杯中调节pH为6.0~7.0反应0.5~1.5 h，冷却至室温。4000 r/min~6000 r/min离心10~30 min，沉降蛋白质除上清液，然后取出沉降蛋白质，冷冻干燥后备用。
进一步的，所述酶解过程为加水补足至料液比1:15～25，待温度为50～55℃时，加入一种市售较为常见的食品级蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶），在恒温条件下维持反应体系的pH值=7.0～8.0，酶解15～600min，之后于90~95℃条件下，灭酶10～20 min。进一步的，所述进一步的，所述的所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶与小麦面筋蛋白的底物比（E/ S）为1:20～1:100。
进一步的，乙醇分级萃取处理包括：将经酶解处理后的酶解液冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为15~25%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度为15~25%，保持温度为25~35℃，水浴震荡20~40 min，以4000～5500 r/min的转速离心15~20 min，并向收集的上清液中加入无水乙醇，使乙醇的最终浓度为35~45%，同等条件下水浴震荡、离心。以此类推，在上清液中继续加入无水乙醇，重复操作二次，当上清液中乙醇最终浓度为75~85%时，经水浴震荡、离心后，除去多余的乙醇溶液，将剩余的上清溶液冷冻干燥后，获得所述苦味肽。
进一步的，所述大孔吸附树脂其型号为DA201-C，样品浓度为25~35 mg/mL，流速为1~2 mL/min，洗脱液为70~90%浓度的乙醇，每次上样量为25~35 mL。
进一步的，所述葡聚糖凝胶为G-25型号，样品浓度为45~55 mg/mL,流速为1~2 mL/min，每次上样量为1~3 mL。
进一步的，所述苦味肽所述苦味肽的含量>8%，苦味值>3.5，苦味肽中疏水氨基酸所占的比例>40%，苦味肽的疏水性>300。
本发明提出的一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法采用的是市售较为常见的四种内切蛋白酶，采用乙醇分级沉淀法、凝胶过滤层析法（大孔吸附树脂和葡聚糖）、高效液相色谱法、HPLC-MS/MS技术并结合感官评价及Q规则，建立了一种小麦面筋蛋白苦味肽的提取、分离、鉴定及验证方法，揭示了小麦面筋蛋白中苦味肽的结构及其苦味特性。该方法原料来源丰富、萃取效果显著且萃取过程绿色无污染。
以下结合实施例及对照例对本发明的技术方案作出进一步的解释说明。
实施例1：
将小麦面筋蛋白与水按1:3的料液比在夹层烧杯中搅拌均匀，升温至60℃，加入1%的α-淀粉酶，调节pH为6.5反应1 h，冷却至室温。5000 r/min离心20 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。将脱淀粉后的原料加水补足至料液比1:20，加入5%碱性蛋白酶（按小麦面筋蛋白物料质量计算），恒温水浴，采用NaOH溶液维持反应体系pH=8.0，酶解51 min，95℃灭酶20 min，冷冻干燥备用。
将冻干的小麦面筋蛋白酶解物在5000 r的条件下离心分离20 min，冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为20%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度分别为20%。水浴震荡30 min，保持温度为30℃，以5000 r/min的转速离心20 min，重复三次上述流程，分别调整上清液的乙醇最终浓度为40%、60%和80%，最后剩余的上清液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。将乙醇萃取物采用DA201-C大孔吸附树脂湿法上柱，样品浓度为40 mg/mL，流速为1 mL/min，洗脱液为80%浓度的乙醇，每次上样量为30 mL。最后收集洗脱液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。最后，将大孔吸附树脂洗脱物采用G-25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，样品浓度为4 mg/mL，流速为1 mL/min，每次上样量为1.5 mL。最后收集洗脱液除去多余水溶液后冷冻干燥。
实施例2：
将小麦面筋蛋白与水按1:3的料液比在夹层烧杯中搅拌均匀，升温至60℃，加入1%的α-淀粉酶，调节pH为6.5反应1 h，冷却至室温。5000 r/min离心20 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。将脱淀粉后的原料加水补足至料液比1:20，加入5%胰蛋白酶（按小麦面筋蛋白物料质量计算），恒温水浴，采用NaOH溶液维持反应体系pH=7.0，酶解243 min，95℃灭酶20 min，冷冻干燥备用。
将冻干的小麦面筋蛋白酶解物在5000 r的条件下离心分离20 min，冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为20%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度分别为20%。水浴震荡30 min，保持温度为30℃，以5000 r/min的转速离心20 min，重复三次上述流程，分别调整上清液的乙醇最终浓度为40%、60%和80%，最后剩余的上清液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。将乙醇萃取物采用DA201-C大孔吸附树脂湿法上柱，样品浓度为40 mg/mL，流速为1 mL/min，洗脱液为80%浓度的乙醇，每次上样量为30 mL。最后收集洗脱液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。最后，将大孔吸附树脂洗脱物采用G-25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，样品浓度为4 mg/mL，流速为1 mL/min，每次上样量为1.5 mL。最后收集洗脱液除去多余水溶液后冷冻干燥。
实施例3：
将小麦面筋蛋白与水按1:3的料液比在夹层烧杯中搅拌均匀，升温至60℃，加入1%的α-淀粉酶，调节pH为6.5反应1 h，冷却至室温。5000 r/min离心20 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。将脱淀粉后的原料加水补足至料液比1:20，加入5%碱性蛋白酶（按小麦面筋蛋白物料质量计算），恒温水浴，采用NaOH溶液维持反应体系pH=8.0，酶解271 min，95℃灭酶20 min，冷冻干燥备用。
将冻干的小麦面筋蛋白酶解物在5000 r的条件下离心分离20 min，冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为20%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度分别为20%。水浴震荡30 min，保持温度为30℃，以5000 r/min的转速离心20 min，重复三次上述流程，分别调整上清液的乙醇最终浓度为40%、60%和80%，最后剩余的上清液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。将乙醇萃取物采用DA201-C大孔吸附树脂湿法上柱，样品浓度为40 mg/mL，流速为1 mL/min，洗脱液为80%浓度的乙醇，每次上样量为30 mL。最后收集洗脱液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。最后，将大孔吸附树脂洗脱物采用G-25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，样品浓度为4 mg/mL，流速为1 mL/min，每次上样量为1.5 mL。最后收集洗脱液除去多余水溶液后冷冻干燥。
实施例4：
将小麦面筋蛋白与水按1:3的料液比在夹层烧杯中搅拌均匀，升温至60℃，加入1%的α-淀粉酶，调节pH为6.5反应1 h，冷却至室温。5000 r/min离心20 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。将脱淀粉后的原料加水补足至料液比1:20，加入5%胰蛋白酶（按小麦面筋蛋白物料质量计算），恒温水浴，采用NaOH溶液维持反应体系pH=7.0，酶解572 min，95℃灭酶20 min，冷冻干燥备用。
将冻干的小麦面筋蛋白酶解物在5000 r的条件下离心分离20 min，冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为20%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度分别为20%。水浴震荡30 min，保持温度为30℃，以5000 r/min的转速离心20 min，重复三次上述流程，分别调整上清液的乙醇最终浓度为40%、60%和80%，最后剩余的上清液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。将乙醇萃取物采用DA201-C大孔吸附树脂湿法上柱，样品浓度为40 mg/mL，流速为1 mL/min，洗脱液为80%浓度的乙醇，每次上样量为30 mL。最后收集洗脱液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。最后，将大孔吸附树脂洗脱物采用G-25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，样品浓度为4 mg/mL，流速为1 mL/min，每次上样量为1.5 mL。最后收集洗脱液除去多余水溶液后冷冻干燥。
对照例1：
将小麦面筋蛋白与水按1:2~1:4的料液比在烧杯中搅拌均匀，升温至50～60℃，加入0.5%~1.5%的α-淀粉酶，在夹层烧杯中调节pH为6.0~7.0反应0.5~1.5 h，冷却至室温。4000 r/min~6000 r/min离心10~30 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。将脱淀粉后的原料加水补足至料液比1:20，加入5%碱性蛋白酶（按小麦面筋蛋白物料质量计算），恒温水浴，采用NaOH溶液维持反应体系pH=8.0，酶解15 min，95℃灭酶20min，冷冻干燥备用。
将冻干的小麦面筋蛋白酶解物在5000 r的条件下离心分离20 min，冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为20%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度分别为20%。水浴震荡30 min，保持温度为30℃，以5000 r/min的转速离心20 min，重复三次上述流程，分别调整上清液的乙醇最终浓度为40%、60%和80%，最后剩余的上清液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。将乙醇萃取物采用DA201-C大孔吸附树脂湿法上柱，样品浓度为40 mg/mL，流速为1 mL/min，洗脱液为80%浓度的乙醇，每次上样量为30 mL。最后收集洗脱液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。最后，将大孔吸附树脂洗脱物采用G-25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，样品浓度为4 mg/mL，流速为1 mL/min，每次上样量为1.5 mL。最后收集洗脱液除去多余水溶液后冷冻干燥。
对照例2：
将小麦面筋蛋白与水按1:2~1:4的料液比在烧杯中搅拌均匀，升温至50～60℃，加入0.5%~1.5%的α-淀粉酶，在夹层烧杯中调节pH为6.0~7.0反应0.5~1.5 h，冷却至室温。4000 r/min~6000 r/min离心10~30 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。将脱淀粉后的原料加水补足至料液比1:20，加入5%胰蛋白酶（按小麦面筋蛋白物料质量计算），恒温水浴，采用NaOH溶液维持反应体系pH=7.0，酶解66 min，95℃灭酶20min，冷冻干燥备用。
将冻干的小麦面筋蛋白酶解物在5000 r的条件下离心分离20 min，冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为20%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度分别为20%。水浴震荡30 min，保持温度为30℃，以5000 r/min的转速离心20 min，重复三次上述流程，分别调整上清液的乙醇最终浓度为40%、60%和80%，最后剩余的上清液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。将乙醇萃取物采用DA201-C大孔吸附树脂湿法上柱，样品浓度为40 mg/mL，流速为1 mL/min，洗脱液为80%浓度的乙醇，每次上样量为30 mL。最后收集洗脱液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。最后，将大孔吸附树脂洗脱物采用G-25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，样品浓度为4 mg/mL，流速为1 mL/min，每次上样量为1.5 mL。最后收集洗脱液除去多余水溶液后冷冻干燥。
对照例3：
将小麦面筋蛋白与水按1:2~1:4的料液比在烧杯中搅拌均匀，升温至50～60℃，加入0.5%~1.5%的α-淀粉酶，在夹层烧杯中调节pH为6.0~7.0反应0.5~1.5 h，冷却至室温。4000 r/min~6000 r/min离心10~30 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。将脱淀粉后的原料加水补足至料液比1:20，加入5%中性蛋白酶（按小麦面筋蛋白物料质量计算），恒温水浴，采用NaOH溶液维持反应体系pH=7.0，酶解300 min，95℃灭酶20min，冷冻干燥备用。
将冻干的小麦面筋蛋白酶解物在5000 r的条件下离心分离20 min，冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为20%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度分别为20%。水浴震荡30 min，保持温度为30℃，以5000 r/min的转速离心20 min，重复三次上述流程，分别调整上清液的乙醇最终浓度为40%、60%和80%，最后剩余的上清液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。将乙醇萃取物采用DA201-C大孔吸附树脂湿法上柱，样品浓度为40 mg/mL，流速为1 mL/min，洗脱液为80%浓度的乙醇，每次上样量为30 mL。最后收集洗脱液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。最后，将大孔吸附树脂洗脱物采用G-25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，样品浓度为4 mg/mL，流速为1 mL/min，每次上样量为1.5 mL。最后收集洗脱液除去多余水溶液后冷冻干燥。
对照例4：
将小麦面筋蛋白与水按1:2~1:4的料液比在烧杯中搅拌均匀，升温至50～60℃，加入0.5%~1.5%的α-淀粉酶，在夹层烧杯中调节pH为6.0~7.0反应0.5~1.5 h，冷却至室温。4000 r/min~6000 r/min离心10~30 min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，冷冻干燥后备用。将脱淀粉后的原料加水补足至料液比1:20，加入5%木瓜蛋白酶（按小麦面筋蛋白物料质量计算），恒温水浴，采用NaOH溶液维持反应体系pH=7.0，酶解285 min，95℃灭酶20min，冷冻干燥备用。
将冻干的小麦面筋蛋白酶解物在5000 r的条件下离心分离20 min，冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为20%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度分别为20%。水浴震荡30 min，保持温度为30℃，以5000 r/min的转速离心20 min，重复三次上述流程，分别调整上清液的乙醇最终浓度为40%、60%和80%，最后剩余的上清液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。将乙醇萃取物采用DA201-C大孔吸附树脂湿法上柱，样品浓度为40 mg/mL，流速为1 mL/min，洗脱液为80%浓度的乙醇，每次上样量为30 mL。最后收集洗脱液除去多余乙醇溶液后冷冻干燥。最后，将大孔吸附树脂洗脱物采用G-25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，样品浓度为4 mg/mL，流速为1 mL/min，每次上样量为1.5 mL。最后收集洗脱液除去多余水溶液后冷冻干燥。
表1 对照例1～4与实施例1～4的检测结果对比
。
我采用感官评测的方法分别给对照例1~4和实施例1~4中肽粉的苦味强度进行评分。即将咖啡因配制成不同浓度的溶液，以此为标准进行评分。标准溶液的浓度分别为0.3×10-3、0.8×10-3、1.2×10-3g/mL，对应的分值为2、5、10分。苦味越高，得分越高。将样品与标准溶液在室温下进行对比，并按照标准分值对待测样品进行评分。感官评定小组由10位经过专业训练的风味评定员组成（年龄20～40岁，5男5女），苦味肽的最终苦味值为10位感官评定员打分的平均值，统计结果如图1所示。
采用pH-stat法测定水解度，记录在酶解过程中氢氧化钠的用量，计算样品的水解度。
由图1可知，在同一水解度下，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的样品比加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶的样品，有更低的苦味值；加入同一种蛋白酶时，随着水解度的增大，苦味值也大幅提高。在小麦面筋蛋白酶解过程中，选用不同的蛋白酶，控制样品的水解度，不同酶解产物含有不同种类的苦味肽。本发明依次进行脱淀粉，乙醇分级萃取、大孔吸附树脂脱盐、葡聚糖凝胶柱分离纯化的萃取方法，收集酶解产物中的苦味肽，通过感官评价，清晰的对比出了实施例和对照例中样品的苦味值差异，结果上的显著差异，充分说明了萃取方法的先进性、有效性。
采用凯氏定氮法GB/T 5009.5— 2016《食品中蛋白质的测定》对上述对照例1-4和实施例1-4中小麦面筋蛋白中蛋白质的含量进行测定，并计算出相应的苦味肽含量，统计结果如表1所示。
采用Waters 1525高效液相色谱仪（配2487 紫外检测器和Empower工作站GPC软件）色谱柱为TSK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 nm，按照GB/T 5009.124-2016方法测量对照例1-4和实施例1-4中小麦面筋蛋白酶解产物大孔树脂萃取物的氨基酸组成，并计算总疏水性氨基酸所占的比例，统计结果如表1所示。
采用荧光探针法对上述对照例1-4和实施例1-4中小麦面筋蛋白酶解产物大孔树脂萃取物的表面疏水性进行检测。分别称取0.2 g不同蛋白样品溶于50 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH为7.0)，在10000×g转速下离心20 min去除不溶物。用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白浓度，用上述磷酸盐缓冲液将上清液按梯度稀释至蛋白浓度在0.0005-0.5 mg/mL之间。分别取4 mL不同浓度的样品溶液加入40 uL 8.0 mmo/L的1-苯胺基茶-8-磺酸(ANS，用上述磷酸盐缓冲液配制)溶液，振荡摇匀，采用荧光分光光度计测定荧光强度。以样品的荧光强度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标做图，所得曲线的初始斜率即为蛋白表面疏水性指数，用Ho表示，统计结果如表1所示。
由表1可知，在同一水解度下，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的的样品比加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶的样品，有更低的苦味肽含量、总疏水性氨基酸比例和表面疏水性；当加入同一种蛋白酶时，随着水解度的增大，样品的苦味肽含量、总疏水性氨基酸比例和表面疏水性大幅提高，其中实施例3有最高的苦味肽含量，其表面疏水性和总疏水性氨基酸的比例也最大，这些结果的趋势与感官评价中结果的趋势是一致的。苦味肽含有更高比例的疏水性氨基酸，表面疏水性提高，其苦味强度变高。另外，不同的酶解产物中苦味肽的含量也有差异，苦味较重的样品含有更多的苦味肽。采用本发明提供的萃取技术，能够清晰对比出不同酶解产物中苦味肽的特征性差异，进一步突出了萃取方法的先进性、有效性。
以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：将小麦面筋蛋白加入水中形成悬浮液，之后依次进行脱淀粉、酶解、高温灭酶、乙醇分级萃取、大孔吸附树脂脱盐、葡聚糖凝胶柱分离纯化处理，再收集各峰组分以4000r/min~6000r/min的转速进行离心处理，并将收集的上清液进行冷冻干燥，获得所述苦味肽；
将小麦面筋蛋白与水按1:2~1:4的料液比在烧杯中搅拌均匀，升温至50~60℃，加入0.5%~1.5%的α-淀粉酶，在夹层烧杯中调节pH为6.0~7.0，反应0.5~1.5h，冷却至室温，4000r/min~6000r/min离心10~30min，除去上清液，然后取出沉降下来的蛋白质，脱去淀粉的产物经冷冻干燥后备用；
所述酶解及高温灭酶处理包括：向冷冻干燥后的脱淀粉产物内加水至料液比为1:15~25，待温度为50~55℃时，加入一种食品级蛋白酶，所述食品级蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，在恒温条件下维持反应体系的pH值7.0~8.0，酶解15~600min，之后于90~95℃条件下，灭酶10~20min；
所述乙醇分级萃取处理包括：将经酶解及高温灭酶处理后的酶解液冷冻干燥后加入水中形成悬浮液，调整固形物含量为15~25%，加入食品级无水乙醇使乙醇的最终浓度为15~25%，保持温度为25~35℃，水浴震荡20~40min，以4000~5500r/min的转速离心15~20min，并向收集的上清液中加入无水乙醇，使乙醇的最终浓度为35~45%，同等条件下水浴震荡、离心，再重复操作二次，分别调整上清液的乙醇最终浓度达到55~65%、75~85%时，经水浴震荡、离心后，除去多余的乙醇溶液，将剩余的上清溶液冷冻干燥后，获得乙醇分级萃取物。
2.根据权利要求1所述的一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其特征在于，所述离心处理包括：以4000~5500r/min的转速离心15~20min，之后收集所述的上清液，为所述苦味肽粗液，然后通过感官评定确定各苦味肽组分的苦味值。
3.根据权利要求1所述的一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶与小麦面筋蛋白的底物比（E/S）为1:20~1:100。
4.根据权利要求1所述的一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂其型号为DA201-C，样品浓度为25~35mg/mL，流速为1~2mL/min，每次上样量为25~35mL。
5.根据权利要求1所述的一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶柱其型号为G-25，样品浓度为45~55mg/mL，流速为1~2mL/min，每次上样量为1~3mL。
6.根据权利要求1所述的一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其特征在于，通过HCl、NaOH调节物料体系的酸碱度。
7.根据权利要求1所述的一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法，其特征在于，所述苦味肽的含量>8%，苦味值>3.5，苦味肽中疏水氨基酸所占的比例>40%，苦味肽的疏水性>300。
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| CN202210099508.6A Active CN114480542B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 一种萃取小麦面筋蛋白酶解产物中苦味肽的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN116649556B (zh) * | 2023-05-31 | 2024-03-26 | 南京汇肽生物科技有限公司 | 一种基于苦味肽的苦味复合调味料及其制备方法 |
Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN103981246A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-08-13 | 广东海洋大学 | 一种鱼类蛋白酶解液提取苦味肽的方法 |
| CN105219824A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-01-06 | 广东食品药品职业学院 | 小麦面筋蛋白源呈味肽及其制备方法与应用 |
| CN105558259A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-05-11 | 江南大学 | 酶解小麦面筋蛋白制备低苦味肽粉的方法 |
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| CN111919963A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-11-13 | 青岛农业大学 | 一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含ipp和vpp水解物的方法 |
-
2022
- 2022-01-27 CN CN202210099508.6A patent/CN114480542B/zh active Active
Patent Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN103981246A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-08-13 | 广东海洋大学 | 一种鱼类蛋白酶解液提取苦味肽的方法 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 不同体积分数乙醇对谷朊粉酶解产物中苦味肽的富集研究;李娜娜，等;《粮食与油脂》;20220331;第35卷(第3期);第132-136页 * |
| 乙醇对谷朊粉酶解产物的苦味影响研究;彭晶;郭晓娜;朱科学;;中国粮油学报;20171230;32(12);第56-62页 * |
| 苦味肽的形成机理及脱苦技术研究进展;郭兴峰;魏芳;周祥山;田守生;刘海峰;张建岭;郭晓飞;;食品研究与开发;20171110(21);第207-211页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114480542A (zh) | 2022-05-13 |
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