CN115785201B - 一种豌豆抗氧化肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于活性肽技术领域，具体涉及一种豌豆抗氧化肽及其制备方法和应用。本发明提供了一种豌豆抗氧化肽，包括多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ中的一种或多种；所述多肽Ⅰ的氨基酸序列为YLVN，多肽Ⅱ的氨基酸序列为EEHLCFR，多肽Ⅲ的氨基酸序列为TFY。本发明所述豌豆抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当，可作为包括食品、药品和化妆品在内的具有抗氧化功能产品的添加剂。
Description
技术领域
本发明属于活性肽技术领域，具体涉及一种豌豆抗氧化肽及其制备方法和应用。
背景技术
生物机体内源性和外源性活性氧自由基的水平超出机体自身抗氧化系统的耐受水平时就会产生氧化应激，从而导致过量的活性氧自由基(ROS)攻击细胞蛋白质、脂质和DNA，并引发一系列的病变反应，包括癌症、心脑血管疾病、帕金森、阿尔茨海默症等神经性退行疾病等，这些都与氧化应激息息相关。研究表明通过外源性补充膳食抗氧化剂增强机体自身抗氧化能力，可能是应对氧化应激的一种切实可行的解决途径。
抗氧化肽是一类生物体内源性的或由生物体蛋白质水解后生成的活性寡肽或多肽，具有清除自由基和抑制脂质过氧化的作用。在抗氧化肽的研究领域中，可食性植物源抗氧化肽相比于化学合成的抗氧化剂来源广泛且安全可靠，因此抗氧化肽的生产和应用逐渐拓展成为食品行业的研究热点。
豌豆蛋白是一种优良的植物蛋白，然而由于蛋白质的溶解性和可消化性较差，导致豌豆蛋白不能在人体内充分发挥其生物活性。当前我国豌豆加工的重点主要是对豌豆淀粉的提取利用，残渣中的蛋白质目前绝大部分仅作词料之用，造成了豌豆蛋白资源的极大浪费。
发明内容
本发明的目的在于提供一种豌豆抗氧化肽及其制备方法和应用，所述豌豆抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当。
本发明提供了一种豌豆抗氧化肽，包括多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ中的一种或多种；所述多肽Ⅰ的氨基酸序列为YLVN，多肽Ⅱ的氨基酸序列为EEHLCFR，多肽Ⅲ的氨基酸序列为TFY。
本发明还提供了上述技术方案所述的豌豆抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：以碱性蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解，得到豌豆蛋白酶解液；
对所述豌豆蛋白酶解液进行超滤，所述超滤的截留分子量为3kDa，得到透过液，所述透过液中包括所述豌豆抗氧化肽。
优选的，所述超滤后还包括对所述透过液进行分离纯化，得到所述豌豆抗氧化肽的纯品；
所述分离纯化包括：对所述透过液进行阴离子交换色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到阴离子交换层析液；
对所述离子交换层析液进行凝胶色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到凝胶色谱层析液；
对所述凝胶色谱层析液进行反相色谱分离，得到所述豌豆活性肽的纯品。
优选的，所述阴离子交换色谱分离的离子交换剂为Q-SepharoseTM Fast Flow强阴离子交换剂；
所述凝胶色谱分离的预装柱为SephadexG-25；
包括依次进行第一反相色谱分离、第二反相色谱分离和第三反相色谱分离；第一反相色谱分离的色谱柱为半制备型反相色谱柱；第二反相色谱分离和第三反相色谱分离的色谱柱为分析型反相色谱柱。
优选的，所述半制备型反相色谱柱的柱型为Pronto SIL C18，所述第二反相色谱分离使用的分析型反相色谱柱的柱型为Cosmosil pbr，所述第三反相色谱分离使用的分析型反相色谱柱的柱型为Xselect TMCSH130。
优选的，所述反相色谱分离的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含0.065vol％TFA的2vol％乙腈水溶液，流动相B为含0.05vol％TFA的80vol％乙腈水溶液。
优选的，所述阴离子交换色谱分离的洗脱液为pH7.5的含1mol/mL NaCl的20mmol/L Tris-HCl，流速为2mL/min；
优选的，所述凝胶色谱分离的洗脱液为双蒸水，流速为2mL/min。
优选的，所述碱性蛋白酶的用量为700U/g豌豆蛋白；所述酶解的时间为4h，温度为50℃，pH为8.5。
本发明还提供了上述技术方案所述的豌豆抗氧化肽或上述技术方案所述的制备方法制备得到的豌豆抗氧化肽在制备具有抗氧化功能的产品中的应用；所述产品包括食品、药品和化妆品中的一种或多种。
有益效果：
本发明提供了一种豌豆抗氧化肽，包括多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ中的一种或多种；所述多肽Ⅰ的氨基酸序列为YLVN，多肽Ⅱ的氨基酸序列为EEHLCFR，多肽Ⅲ的氨基酸序列为TFY。本发明所述豌豆抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当，可作为包括食品、药品和化妆品在内的具有抗氧化功能产品的添加剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中豌豆抗氧化肽的制备技术路线图；
图2为本发明实施例中离子交换色谱分离洗脱图谱；
图3为本发明实施例中离子交换色谱分离洗脱峰的DPPH自由基清除结果；
图4为本发明实施例中凝胶色谱分离洗脱图谱；
图5为本发明实施例中凝胶色谱分离洗脱峰的DPPH自由基清除结果；
图6为本发明实施例中半制备型反相色谱洗脱图谱；
图7为本发明实施例中半制备型反相色谱洗脱峰的DPPH自由基清除结果；
图8为本发明实施例中分析型反相色谱洗脱图谱；
图9为本发明实施例中分析型反相色谱洗脱峰的DPPH自由基清除结果；
图10为本发明实施例中分析柱峰3的二次反相色谱柱洗脱图谱；
图11为本发明实施例中分析柱峰5的二次反相色谱柱洗脱图谱；
图12为本发明实施例中分析柱峰7的二次反相色谱柱洗脱图谱；
图13为本发明实施例中多肽Ⅰ(YLVN)的质谱检测图；
图14为本发明实施例中多肽Ⅱ(EEHLCFR)的质谱检测图；
图15为本发明实施例中多肽Ⅲ(TFY)的质谱检测图。
具体实施方式
本发明提供了一种豌豆抗氧化肽，包括多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ中的一种或多种；所述多肽Ⅰ的氨基酸序列为YLVN(SEQ ID NO.1)，多肽Ⅱ的氨基酸序列为EEHLCFR(SEQ IDNO.2)，多肽Ⅲ的氨基酸序列为TFY(SEQ ID NO.3)。
本发明所述豌豆抗氧化肽优选为多肽Ⅰ、多肽Ⅱ或多肽Ⅲ。本发明所述豌豆抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当。在本发明的实施例中，所述豌豆抗氧化肽分离自豌豆蛋白粉。
本发明还提供了上述技术方案所述的豌豆抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：以碱性蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解，得到豌豆蛋白酶解液；
对所述豌豆蛋白酶解液进行超滤，所述超滤的截留分子量为3kDa，得到透过液，所述透过液中包括所述豌豆抗氧化肽。
本发明进行所述酶解前，优选还包括将所述豌豆蛋白粉与水混合配制成悬浊液，所述悬浊液的质量浓度优选为7％(m/v)。本发明对所述豌豆蛋白粉的来源没有特殊限定，采用本领域市售的豌豆蛋白粉即可，如本发明实施例中的豌豆蛋白粉购买于山东健源有限公司。
本发明以碱性蛋白酶对豌豆蛋白粉进行酶解，得到豌豆蛋白酶解液。
以所述豌豆蛋白粉中蛋白质量计，本发明所述碱性蛋白酶的用量优选为700U/g蛋白。本发明所述酶解的温度优选为50℃；所述酶解的时间优选为4h；所述酶解的pH优选8.5。
所述酶解后，本发明优选将获得的酶解体系进行灭酶处理。本发明中，所述灭酶处理钝化了酶解体系中碱性蛋白酶的活力。本发明所述灭酶处理的温度优选为100℃；所述灭酶处理的时间优选10min。
所述灭酶处理后，本发明优选对灭酶后的体系进行离心，得到的上清液为豌豆蛋白酶解液。本发明所述离心的转速优选为4000r/min，所述离心的时间优选为10min。
得到所述豌豆蛋白酶解液后，本发明对所述豌豆蛋白酶解液进行超滤，所述超滤的截留分子量为3kDa，得到透过液，所述透过液中包括所述豌豆抗氧化肽。
所述超滤后，本发明优选还包括对所述透过液进行分离纯化，得到所述豌豆抗氧化肽的纯品。
所述分离纯化包括：对所述透过液进行阴离子交换色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到阴离子交换层析液；
对所述离子交换层析液进行凝胶色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到凝胶色谱层析液；
对所述凝胶色谱层析液进行反相色谱分离，得到所述豌豆活性肽的纯品。本发明优选对所述透过液进行阴离子交换色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到阴离子交换层析液。
进行本发明所述阴离子交换色谱分离前，本发明优选对所述透过液进行离心和微滤。本发明所述离心的转速优选10000r/min，时间优选为15min。本发明优选对离心后的上清液进行微滤，所述微滤使用滤膜的孔径优选0.22μm。
本发明所述阴离子交换色谱分离的离子交换剂优选为Q-SepharoseTM Fast Flow强阴离子交换剂。本发明所述阴离子交换色谱分离的条件包括：起始缓冲液优选为pH为7.5的20mmol/L的Tris-HCl；洗脱液优选为pH 7.5的含1mol NaCl的20mmol/L的Tris-HCl缓冲液；洗脱程序优选为梯度洗脱，梯度洗脱的时间优选为80min，所述梯度洗脱时间内，洗脱液的含量变化为0～100％。洗脱液的流速优选为2mL/min，检测波长为214nm。
得到所述阴离子交换层析液，本发明对所述阴离子交换层析液进行凝胶色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到凝胶色谱层析液。进行所述凝胶色谱分离前，本发明优选对所述阴离子交换层析液冷冻抽干和溶解。本发明对所述冷冻抽干的具体参数没有特殊限定，采用本领域中常规冷冻抽干参数即可。本发明进行所述溶解的溶剂优选为双蒸水。
本发明所述凝胶色谱分离的预装柱优选为SephadexG-25。本发明优选以所述凝胶色谱进行凝胶层析脱盐，所述溶解得到的样本溶液的流速优选为2.0mL/min，检测波长优选为214nm。
得到所述凝胶色谱层析液后，本发明对所述凝胶色谱层析液进行反相色谱分离，分别得到多肽I、多肽II和多肽III。在本发明中，所述反相色谱分离优选包括：依次进行第一反相色谱分离、第二反相色谱分离和第三反相色谱分离。
本发明进行所述第一反相色谱分离前，优选还包括将所述凝胶色谱层析液冻干后溶于乙腈水溶液后过滤。本发明冻干后的凝胶色谱层析液与乙腈水溶液的质量体积比优选为10mg：1mL；所述乙腈水溶液的体积浓度优选为2％。本发明所述过滤使用滤膜的孔径优选为0.22μm。
所述过滤后，本发明优选对所述过滤后得到的混合溶液进行第一反相色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到第一反相色谱分离液。本发明所述第一反相色谱分离优选使用的是半制备型反相色谱柱，所述色谱柱的型号优选为Pronto SIL C18。本发明所述第一反相色谱分离的上样量优选为500μL；流动相优选包括流动相A和流动相B，流动相A优选为含0.065vol％TFA的2vol％乙腈水溶液，流动相B优选为含0.05vol％TFA的80vol％乙腈水溶液，流速优选为1mL/min，柱温优选为30℃。洗脱程序优选为梯度洗脱，所述梯度洗脱的时间优选为70min，梯度洗脱的程序优选如表1所示。
表1半制备型反相色谱梯度洗脱程序
得到第一反相色谱分离液后，本发明优选将所述第一反相色谱分离液溶于体积浓度为2％乙腈水溶液后，进行第二反相色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到第二反相色谱分离液。本发明所述第二反相色谱分离优选使用的是分析型反相色谱柱，所述色谱柱优选为Cosmosil pbr。本发明所述第二反相色谱分离的条件为：上样量优选为10μL；流动相A优选为含0.065vol％TFA的2vol％乙腈水溶液，流动相B优选为含0.05vol％TFA的80vol％乙腈水溶液；洗脱程序优选为梯度洗脱，流速优选优选为1mL/min；所述梯度洗脱程序优选如表2所示：
表2分析型反相色谱梯度洗脱程序
得到所述第二反相色谱分离液后，本发明优选对所述第二反相色谱分离液进行第三反相色谱分离，分别得到多肽I、多肽II和多肽III。本发明所述第三反相色谱分离优选使用的是分析型反相色谱柱，所述色谱柱优选为XselectTM CSH130。本发明所述第三反相色谱分离的条件优选与第二反相色谱分离的条件相同，不再赘述。
本发明优选还包括对所述多肽I、多肽II和多肽III进行质谱测序，得到所述多肽I、多肽II和多肽III的氨基酸序列。在本发明中，所述豌豆活性肽为氨基酸序列为YLVN的多肽Ⅰ，氨基酸序列为EEHLCFR的多肽Ⅱ，和氨基酸序列为的TFY多肽Ⅲ。本发明优选采用LC-MS/MS进行所述质谱测序。本发明对所述质谱测序的过程和步骤没有特殊限定，采用本领域中常规质谱测序的步骤即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的豌豆活性肽或上述技术方案所述的制备方法制备得到的豌豆活性肽在制备具有抗氧化功能的产品中的应用；所述产品包括食品、药品和化妆品中的一种或多种。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种豌豆抗氧化肽，制备步骤如下，技术路线如图1所示，图1中以豌豆蛋白水解液表示豌豆蛋白酶解液。
1、豌豆蛋白酶解液的制备：
取豌豆蛋白与水混合后，配制成底物浓度7％(m/v)的悬浊液，将悬浊液的pH调整到8.5然后加入碱性蛋白酶，以豌豆蛋白粉中的蛋白质量计，加酶量为700U/g蛋白，50℃下充分反应时间4h，酶解结束后酶解液在100℃条件下加热10min以钝化蛋白酶活力。酶解物在4000r/min离心10min弃沉淀，所得上清液为豌豆蛋白酶解液，豌豆蛋白酶解液中含有抗氧化活性肽的混合物。
2、依次采用截断分子量5kDa和3kDa的超滤膜对步骤1中得到的豌豆蛋白酶解液进行超滤处理，获得分子量＞5kDa、3～5kDa和＜3kDa透过液，三种透过液中含有3种不同分子量的豌豆肽组分。通过测定三种透过液的DPPH自由基的清除能力以评价三种透过液的抗氧化活性，选择抗氧化活性相对更高的组分进行分离纯化，DPPH自由基的清除能力的测定方法同步骤7；同时对豌豆蛋白酶解液的可溶性蛋白含量，总蛋白含量以及蛋白回收率进行测定，其中采用BCA蛋白测定法对可溶性蛋白含量进行测定；总蛋白＝可溶性蛋白含量×总体积；蛋白回收率＝超滤后各组分的总蛋白含量/超滤前的总蛋白含量。结果如表3所示：
表3豌豆蛋白酶解液超滤分级结果
由表3中的结果可知：分子量＜3kDa的透过液的DPPH清除率相对更高，且其蛋白回收率更高，因而选择分子量＜3kDa的透过液进行下一步的分离纯化。
3、离子交换色谱分离
将步骤2中所得＜3kDa的透过液10000r/min离心15min后取上清液，过0.22μm的微孔滤膜，将滤液进行Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析起始缓冲液：20mmol/L pH 7.5Tris-HCl缓冲液，洗脱液：含1molNaCl的20mmol/LpH 7.5Tris-HCl缓冲液，梯度洗脱80min，流速：2mL/min，UV280nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活性，测定方法同步骤7，下同。离子交换色谱分离的洗脱图谱以及各峰的DPPH自由基清除结果分别如图2和图3所示，其中在图2中Ⅰ为穿透峰，共3管，Ⅱ为洗脱峰，共12管。
根据图2～3中的结果，收集洗脱峰中抗氧化部分相对较高的组分备用，即组分9。
4、凝胶色谱分离
将步骤4中得到的组分9冷冻抽干后，用双蒸水溶解后进行SephadexG-25凝胶层析脱盐，流速为2.0mL/min，UV214nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活性。凝胶色谱分离的洗脱图谱以及各峰的DPPH自由基清除结果分别如图4和图5所示，其中在图4中的峰1、2和3与图5中的Ⅱ-1、Ⅱ-2和Ⅱ-3进行对应。
根据图4～5中的结果收集抗氧化活性相对更高的部分备用备用，即活性组分Ⅱ-2。
5、反相色谱分离
5.1半制备型反相色谱柱确定抗氧化肽的活性区域
称取10mg步骤4中得到的活性组分Ⅱ-2溶于1mL的2％乙腈水溶液中，用0.22μm微孔滤膜过滤，色谱柱的型号为Pronto SIL C18(10×250mm，10μm)，流速为1mL/min，流动相A为含0.065％TFA的2％乙腈水溶液，流动相B为含0.05％TFA的80％乙腈水溶液，梯度洗脱70min，洗脱程序如上述表1所示，不再赘述。收集出峰的各个组分测定每管样品的抗氧化活性。半制备型反相色谱的洗脱图谱如图6所示，各峰的DPPH自由基清除结果如图7和表4所示，图7中纵坐标表示DPPH清除率％
表4半制备型反相色谱洗脱峰的DPPH自由基清除结果
根据图6～7及表4可以确定抗氧化活性相对更高的活性组分在第6管。
5.2分析型反相色谱柱分离抗氧化活性肽
将步骤5.1中得到的第6管的活性组分溶于2％乙腈水溶液中，进一步用分析柱进行分离纯化，分析柱的柱型为Cosmosil pbr(4.6×250mm，5μm)，检测波长为214nm，流速为1mL/min，上样量为10μL。流动相A为含0.065％TFA的2％乙腈水溶液，流动相B为含0.05％TFA的80％乙腈水溶液，梯度洗脱程序如表2所示，不再赘述。
组分经过分析柱分离后，获得19个豌豆肽，收集每个峰的峰尖部分进行抗氧化活性测定。分析型反相色谱的洗脱图谱如图8所示，各峰的DPPH自由基清除结果如图9和表5所示。
表5分析型反相色谱洗脱峰的DPPH自由基清除结果
由图8～9及表5的结果可以确定峰3、5、7为抗氧化活性相对更高的豌豆抗氧化肽。
5.3二次反相色谱
将步骤5.2中获得的峰3、5、7按照步骤5.2中的色谱条件进行二次反相色谱分析，色谱柱型号为Xselect TM CSH130，分别得到一个单峰，分别如图10～12，冻干备用质谱测序。
6、质谱测序
将步骤5.3中分离得到的活性高的峰3、5、7分别进行质谱测序，获得豌豆活性肽的序列分别为Tyr-Leu-Val-Asn(YLVN)、Glu-Glu-His-Leu-Cys-Phe-Arg(EEHLCFR)和Thr-Phe-Tyr(TFY)，氨基酸个数分别为4、7、3，分子量分别为507.59Da、933.06Da和429.47Da；测定的质谱图如图13～15所示。
制备例
按照实施例1中的质谱测序结果进行化学合成(委托上海强耀生物科技有限公司合成)，测定三种豌豆活性肽对DPPH和ABTS自由基的清除能力，并与现有蛋白数据库比对最终获得三个新的抗氧化活性高的豌豆抗氧化肽。
效果测试1：DPPH自由基清除能力测定方法：
用无水乙醇配制0.2mM的DPPH溶液，取100μL DPPH溶液至96孔板中，加入100μL不同浓度的肽水溶液(0.1～10mg/mL)，振荡混匀后室温下避光孵育30min，对照组用无水乙醇替代肽溶液，酶标仪测定517nm处的吸光度值。
DPPH自由基清除活性计算公式如下：
DPPH清除率(％)＝(Acontrol-Asample)/Acontro×100
式中：Acontrol和Asample分别为对照组和实验组的吸光值
以上述方法对豌豆活性肽和谷光甘肽的DPPH自由基清除能力进行测定，结果表明，多肽Ⅰ(YLVN)、多肽Ⅱ(EEHLCFR)、多肽Ⅲ(TFY)和谷胱甘肽对DPPH自由基清除的IC50值分别为8.933mg/mL、0.027mg/mL、1.492mg/mL和0.081mg/mL。
效果测试2：ABTS自由基清除能力测定方法：
96孔板中加入20μL不同浓度的肽溶液(0.01～1mg/mL)和180μLABTS工作液，室温孵育15min，测定反应体系在734nm处的吸光度值。对照组用PBS代替肽溶液，ABTS自由基清除活性计算公式如下：
ABTS自由基清除率(﹪)＝(1-Asample/Acontrol)×100
其中Asample和Acontrol分别代表是样品组和实验组的吸光度值
ABTS储备液的配制：7mM的ABTS试剂和2.45mM的过硫酸钾按照1：1的体积混合，室温下避光孵育12～16h，制成ABTS储备液溶液
ABTS工作液的配制：用0.01mol/LPBS缓冲液对储备液进行稀释，使其在734nm处的吸光度值为0.70±0.02。
以上述方法对豌豆活性肽和谷光甘肽的ABTS自由基清除能力进行测定，结果表明，多肽Ⅰ(YLVN)、多肽Ⅱ(EEHLCFR)、多肽Ⅲ(TFY)和还原型谷光甘肽的对ABTS自由基清除的IC50值分别为0.002mg/mL、0.019mg/mL、0.006mg/mL和0.007±0.003mg/mLmg/mL。
由以上结果可以得出：本发明所述的单个豌豆活性肽均具备较高的抗氧化活性，尽管多肽Ⅰ(YLVN)的DPPH自由基清除能力相对较低，但是其具有较谷胱甘肽更好的ABTS自由基清除能力，因而，本发明中三个多肽均具有较好的抗氧化能力，其抗氧化效果与同浓度的还原型谷胱甘肽相当。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种豌豆抗氧化肽，其特征在于，选自多肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；所述多肽Ⅰ的氨基酸序列为YLVN，多肽Ⅱ的氨基酸序列为EEHLCFR。
2.权利要求1所述的豌豆抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以碱性蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解，得到豌豆蛋白酶解液；
对所述豌豆蛋白酶解液进行超滤，所述超滤的截留分子量为3kDa，得到透过液，所述透过液中包括所述豌豆抗氧化肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述超滤后还包括对所述透过液进行分离纯化，得到所述豌豆抗氧化肽的纯品；
所述分离纯化包括：对所述透过液进行阴离子交换色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到阴离子交换层析液；
对所述离子交换层析液进行凝胶色谱分离，收集DPPH自由基清除率最高的组分，得到凝胶色谱层析液；
对所述凝胶色谱层析液进行反相色谱分离，得到所述豌豆抗氧化肽的纯品。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子交换色谱分离的离子交换剂为Q-SepharoseTM Fast Flow强阴离子交换剂；
所述凝胶色谱分离的预装柱为SephadexG-25；
所述反相色谱分离包括依次进行第一反相色谱分离、第二反相色谱分离和第三反相色谱分离；所述第一反相色谱分离的色谱柱为半制备型反相色谱柱，所述第二反相色谱分离和第三反相色谱分离的色谱柱为分析型反相色谱柱。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述半制备型反相色谱柱的柱型为Pronto SIL C18，所述第二反相色谱分离使用的分析型反相色谱柱的柱型为Cosmosilpbr，所述第三反相色谱分离使用的分析型反相色谱柱的柱型为Xselect TM CSH130。
6.根据权利要求3~5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反相色谱分离的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含0.065 vol% TFA的2vol%乙腈水溶液，流动相B为含0.05 vol% TFA的80 vol%乙腈水溶液。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子交换色谱分离的洗脱液为pH 7.5的含1mol/mL NaCl的20mmol/L Tris-HCl，流速为2mL/min。
8.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶色谱分离的洗脱液为双蒸水，流速为2mL/min。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的用量为700U/g豌豆蛋白；所述酶解的时间为4h，温度为50℃，pH为8.5。
10.权利要求1所述的豌豆抗氧化肽或权利要求2~9任一项所述的制备方法制备得到的豌豆抗氧化肽在制备具有抗氧化功能的产品中的应用；所述产品包括食品、药品和化妆品中的一种或多种。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105237622A (zh) * | 2015-09-09 | 2016-01-13 | 齐齐哈尔大学 | 玉米抗氧化活性肽及其制备方法 |
| CN106478770A (zh) * | 2016-10-13 | 2017-03-08 | 福州大学 | 一种紫苏籽抗氧化二肽及其制备方法与应用 |
| CN114410723A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-04-29 | 漯河永瑞生物科技有限公司 | 一种具有良好乳化性的豌豆抗氧化肽及其制备方法 |
| WO2023081648A1 (en) * | 2021-11-02 | 2023-05-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aav capsid variants and uses thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103370075A (zh) * | 2011-02-15 | 2013-10-23 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 长效il-1受体拮抗剂 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105237622A (zh) * | 2015-09-09 | 2016-01-13 | 齐齐哈尔大学 | 玉米抗氧化活性肽及其制备方法 |
| CN108456243A (zh) * | 2015-09-09 | 2018-08-28 | 齐齐哈尔大学 | 玉米抗氧化活性肽及其制备方法 |
| CN106478770A (zh) * | 2016-10-13 | 2017-03-08 | 福州大学 | 一种紫苏籽抗氧化二肽及其制备方法与应用 |
| WO2023081648A1 (en) * | 2021-11-02 | 2023-05-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aav capsid variants and uses thereof |
| CN114410723A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-04-29 | 漯河永瑞生物科技有限公司 | 一种具有良好乳化性的豌豆抗氧化肽及其制备方法 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| Identification and Evaluation of Antioxidant Peptides from Pea Protein Hydrolysates;Zhao D.等;《Molecules》;20230325;第28卷(第7期);全文 * |
| 刁静静 ; 于伟 ; 张丽萍 ; .豌豆蛋白水解物的分离及其抗氧化活性的研究.包装与食品机械.2013,(第03期),摘要、第2.3-3节. * |
| 刁静静2013;1;刁静静2013;20220201;第1卷;1 * |
| 含酪氨酸二肽在脂质体体系中的抗氧化活性与供电子能力;陈冲等;《食品科学》;20200924;第42卷(第11期);全文 * |
| 杨雪2018;1;杨雪2018;20220201;第1卷(第1期);1 * |
| 豌豆蛋白及豌豆抗氧化肽研究进展;徐忠;王友健;陈晓明;赵丹;高阳;冯昕宁;;食品工业;20200620(第06期);全文 * |
| 豌豆蛋白水解物的分离及其抗氧化活性的研究;刁静静;于伟;张丽萍;;包装与食品机械;20130630(第03期);摘要、第2.3-3节 * |
| 酶解法制备豌豆抗氧化肽及其稳定性的研究;杨雪;李云亮;王禹程;马海乐;;粮食与油脂;20180110(第01期);第1.3.2节 * |
| 量子化学计算及分子对接技术对豌豆蛋白源抗氧化肽YLVN、TFY的抗氧化作用机制研究;赵丹等;《食品安全质量检测学报》;20230415;第14卷(第7期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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