CN106892965B

CN106892965B - 一种利用复合蛋白酶制备的抗氧化多肽

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Publication number: CN106892965B
Application number: CN201710068503.6A
Authority: CN
Inventors: 汪少芸; 李灵; 胡冬一; 陈旭; 蔡茜茜; 方卫东
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2017-02-08
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2037-02-08
Also published as: CN106892965A

Abstract

本发明提供了一种利用复合蛋白酶制备的抗氧化多肽，该方法以鱼皮鱼鳞蛋白为原料，通过对复合蛋白酶的酶解，分离纯化得到特异性抗氧化多肽，其氨基酸全序列为：FEVGPVCFL。本发明消除了天然抗氧化剂所具有的缺陷并且消除了公众对人工合成抗氧化剂的忧虑，为开发基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定基础。

Description

一种利用复合蛋白酶制备的抗氧化多肽

技术领域

本发明提供了一种利用复合蛋白酶制备的抗氧化多肽，属于生物技术领域。

背景技术

氧化是一个自由基介导的过程，它会对食品和生物系统造成许多不利的影响。在好氧器官内，与动脉硬化、癌症等多中疾病相关的游离自由基会不可避免地随着氧代谢的过程而产生。在食品中，食品营养成分的氧化会产生过氧化物，其不仅会影响食品的营养价值，引起食品品质下降，严重的甚至还会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。由于BHT、TBHQ等化学合成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此其已经被广泛应用于食品行业中。但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官具有蓄积性致癌作用，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始逐渐限制其在食品中的使用。于是人们把目光转向天然抗氧化剂。α-生育酚是一种被最普遍使用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品中油脂的稳定性，但是却不利于食品保存。因此，我们有必要寻找一种其它来源的安全的天然抗氧化剂。

多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，使蛋白质具有一定的生理功能。在人类的生命活动中，肽在体内的消化吸收优于游离的氨基酸，且有着区别于氨基酸的体内输送体系。某些短肽在提供人体生长、发育所必需的营养物质的同时，还能够防病治病，调节人体机能，这些具有生物活性的多肽被称为生物活性肽。鱼肉加工过程产生的下脚料浪费等原因造成资源浪费，甚至是环境污染。鱼皮鱼鳞中含有大量蛋白质，且其组成均衡，利用现代生物技术对蛋白质资源进行深加工，合理的选用酶类等，通过工艺优化将使得抗氧化活性肽的研究具有更广阔的前景。

发明内容

本发明提供了一种利用复合蛋白酶制备的抗氧化多肽，使抗氧化活性得以高效实现。

本发明采用如下技术方案：

一种抗氧化多肽，所述抗氧化多肽的氨基酸序列为：FEVGPVCFL。

一种抗氧化多肽的制备方法，以鱼皮鱼鳞为原料提取蛋白，然后采用复合蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。

所述酶解条件为：pH为8.0、温度50℃、酶解时间为10 h、酶-底物配比为2800U/g；所述酶为复合蛋白酶。

所述分离纯化的手段包括超滤、CM Sepharose C25离子交换色谱、Sephadex G-50分子筛和RP-HPLC反相高效液相色谱。

所述分离纯化的具体步骤为：

（1）酶解产物首先利用膜过滤系统对鱼皮鱼鳞多肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的多肽，包括≥3000 Da、1500-3000 Da、≤1500 Da等组分；

（2）收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用CM Sepharose C25离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以含0～0.50mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；

（3）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；

（4）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm；洗脱液自含体积比为10%乙腈和90%水的混合液开始，至体积比为90%乙腈和10%水的混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为44 %乙腈和56%水处的洗脱峰，得到本发明的高纯度的抗氧化多肽；利用蛋白质固相序列分析仪鉴定多肽的氨基酸序列。

本发明立足于寻找一种天然高效的抗氧化剂，以鱼皮鱼鳞蛋白为出发点，通过复合蛋白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗氧化活性得以高效实现。

本发明改变了现有抗氧化剂的提取与运用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，是一种天然抗氧化剂，可以取代传统的合成抗氧化剂。并且本发明既可解决大量鱼皮鱼鳞资源的高效利用问题，又能解除消费者对抗氧化剂在食品安全方面的顾虑，对科技、经济和食品工业的发展具有深远意义。

附图说明

图1为抗氧化多肽的RP-HPLC图谱。

图2为纯化的抗氧化多肽清除DPPH自由基的“量-效”关系曲线。

图3为纯化的抗氧化多肽清除ABTS自由基的“量-效”关系曲线。

具体实施方式

制备方法如下：

(1)鱼皮鱼鳞蛋白的提取

提取工艺条件为：

将鱼皮鱼鳞清洗3-5次，浸提pH为 7.0，提取温度为40-80 ℃，料液比为1:4-1:8（重量比），提取时间为3-6 h，离心10000g 20分钟，收集上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到鱼皮鱼鳞蛋白。

(2)蛋白的酶解

酶购自上海生物试剂公司（中国·上海）。

采用复合蛋白酶酶解鱼皮鱼鳞蛋白，蛋白浓度为30mg/ml，酶解条件pH为8.0、温度50℃、酶解时间为10 h、酶-底物配比为2800U/g；用2M NaOH调节pH稳定，水解10h后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以8000r/min离心15min，取上清液备用。

（3）酶解产物的浓缩、除杂

利用纳滤系统对蛋白酶解液进行浓缩后，加入4倍体积乙醇沉降大分子蛋白质，12000r/min离心20min得上清液即为鱼皮鱼鳞多肽溶液。

（4）酶解产物的分离

利用膜过滤系统对鱼皮鱼鳞多肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的多肽，包括≥3000 Da、1500-3000 Da、≤1500 Da等组分。

（5）酶解产物的纯化

将得到的酶解产物分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于3000Da的组分、分子量介于1500Da和3000Da的组分、分子量小于1500Da的组分；收集具有最佳抗氧化活性的组分，再经过CM Sepharose C25离子交换色谱（长20cm，直径1.6cm）进行分离，以含0～0.50mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50（长100cm，直径2.6cm）凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集44 %乙腈和56 %水（v/v）处的洗脱峰，得到本发明的高纯度的抗氧化多肽。

（6）抗氧化多肽的氨基酸序列测定

利用蛋白质固相序列分析仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin ElmerCo. MA, U.S.A) 测定本发明的抗氧化多肽的氨基酸全序列为FEVGPVCFL。

（7）抗氧化活性的测试

i.DPPH自由基清除能力的测定

利用DPPH（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）自由基清除率测定法研究抗氧化多肽。配制浓度为1×10^-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。将2mL、 0.1mM 的DPPH无水乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解样品的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517 nm处测定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越强。

清除率(%)=〔1- (A_i- A_j)/A₀〕×100%

式中，A₀为2 mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品溶剂，空白对照；A_i为2mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品；A_j为2mL的无水乙醇+2 mL的样品。

2） ABTS自由基清除活性的测定

以去离子水将ABTS溶解，使ABTS浓度达到7mmol/L，加入过硫酸钾，使过硫酸钾的浓度为2.45 mmol/L。之后将该溶液在室温下置于暗处过夜12～16h。将生成的ABTS自由基溶液用磷酸缓冲液（PBS，0.2 mol/L，pH 7.4）稀释，使其在734nm下的吸光值为0.70。取0.1ml酶解液与2.9ml ABTS自由基液混合，摇匀30s，暗处反应10 min，然后在734nm下测定反应液的吸光值。以蒸馏水代替水解液作空白。

清除率(%)= (A₀- A_j)/A₀×100%

式中，A₀为2.9 mL ABTS试剂与0.1 mL蒸馏水混合液的吸光值；A_j为2.9 mL ABTS试剂与0.1 mL酶解液混合液的吸光值。

为了进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例：

实施例1

称取5.0克鱼皮鱼鳞蛋白用去离子水溶解并定容至250ml，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至8.0。先将该溶液水浴加热到50℃，接着再按照酶-底物配比为2800U/g的比例加入相应量的酶，酶解时间为10 h。接着在沸水浴中灭酶15分钟，冷却后再8000rpm离心15分钟。收集上清液备用。

将上清液利用膜过滤系统对鱼皮鱼鳞多肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的多肽，≥3000 Da、1500-3000 Da、≤1500 Da的组分，并测定其抗氧化活性。分子量小于1500Da的组分具有最好的抗氧化活性。

收集分子量小于1500Da的组分，用CM Sepharose C25离子交换色谱（长20cm，直径1.6cm）进行再进一步的分离，以含0～0.50mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，洗脱峰在225nm下进行测量，收集各峰并测定抗氧化活性。

将分离出来的抗氧化活性最明显的组分峰用Sepadex G-50凝胶过滤色谱（长20cm，直径1.6cm）再进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量。收集各峰并测定抗氧化活性。

将分离出来的最好的抗氧化活性组分利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集44 %乙腈和56%水（v/v）处的洗脱峰，得到本发明的高纯度的特异性抗氧化多肽，如图1所示，S峰为该抗氧化多肽的色谱峰。得到高纯度的抗氧化肽。

纯化后的抗氧化多肽具有很强的抗氧化能力，由图2、图3可以看出，它具有较强的清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力。

利用蛋白质固相测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co.MA, U.S.A) 测定纯化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列为：FEVGPVCFL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种利用复合蛋白酶制备的抗氧化多肽

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Phe Glu Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

1 5

Claims

1.一种抗氧化多肽，其特征在于：所述抗氧化多肽的氨基酸序列为：

FEVGPVCFL，其来源于鱼皮、鱼鳞。