CN107164444B - 具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明根据鱼皮蛋白的特性，以鱼皮为原料，通过对鱼皮进行超声波和高温高压等预处理，利用多种蛋白酶分步酶解技术，通过膜分离、凝胶分离及高效液相色谱分离技术，所得鱼皮蛋白肽粉中序列如SEQ ID NO:1和2所示的鱼皮蛋白肽的含量占鱼皮蛋白肽粉总重的50％以上，建立了一套简单高效的鱼皮抗氧化蛋白肽制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类抗氧化物质及其制备方法和用途，具体地说，涉及一种具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法与应用。
背景技术
蛋白质经过酶解得到多肽，使其蛋白质的结构发生改变，疏水区的活性官能基团暴露，随着肽键的裂解，小分子蛋白肽和氨基酸增加，从而可以提供质子或电子源，保持较高的氧化还原电位，使其具有清除活性自由基的能力。氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类是一个重要的代谢过程，但是它却导致了自由基的形成，活性氧自由基(ROS)被认为能引起氧化应激。在食品体系中，脂类或蛋白质可能会受到ROS的攻击经历氧化过程，从而导致食品产生不愉快味道，颜色发暗，同时也可能产生潜在的毒性终产物。抗氧化多肽的应用能防止食品成分由于捐献电子给活性氧自由基以及中和活性氧自由基的负面作用而变质。抗氧化肽在医学、化妆品、生物、食品领域有着广泛的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法。
本发明的另一目的是提供所述鱼皮蛋白肽在医药、食品及保健品中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
含有上述鱼皮蛋白肽的鱼皮蛋白肽粉可按照如下方法制备，包括以下步骤：
(1)将冷冻鱼皮在8-12℃条件下进行解冻清洗，鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量1.5-2.5倍的水，于120-130℃保温30-60分钟；
(2)将鱼皮蛋白浆的温度下调至60-70℃，进行超声处理(超声处理旨在改变鱼皮蛋白的组织结构)；超声处理在超声波发生器内进行，超声波的频率为50-60kH，处理时间25-35分钟；
(3)将经过超声后鱼皮蛋白浆的温度上调至115-125℃，于115-125℃煮制90-150分钟，然后离心取上清液；
(4)按照鱼皮重量0.15-0.30％的比例向(3)的上清液中加入复合蛋白酶进行分步酶解：第一步向上清液中加入鱼皮重量0.10-0.15％的复合蛋白酶I(由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按质量比1-2:1组成，其中碱性蛋白酶的酶活为70-100万U/g，胰蛋白酶的酶活为40-60万U/g)，于50-55℃酶解0.5-1.0h；第二步向上述酶解体系中加入鱼皮重量0.05-0.15％的复合蛋白酶II(由木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比1-2:1组成，其中木瓜蛋白酶的酶活为30-60万U/g，风味蛋白酶的酶活为50-90万U/g)，于50-60℃酶解0.5-1.0h；然后在95-98℃下保温10-20分钟，冷却至室温，用活性炭过滤，收集上清液；
(5)对步骤(4)所得上清液进行超滤处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的滤膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(6)分子量小于3000的蛋白肽液再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取第7-9分钟收集的肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽粉。
本发明中，RP-HPLC的件为：0-5min，流动相为纯水；流动相B：含0.1％TFA(三氟乙酸)的乙腈，5-10min流动相B，从0％到35％，10-15min，流动相B从65％到95％，15-30min，流动相B从95％到0％，30min停止；所用色谱柱为：Kromasil C18，5μm，4.6×250mm。
本发明所用RP-HPLC色谱柱为：Kromasil C18，5μm，4.6×250mm。
通过LC-MS/MS对鱼皮蛋白肽粉的主要成分进行测定，序列如SEQ ID NO:1和2所示的鱼皮蛋白肽的含量占鱼皮蛋白肽粉总重的50-53％。
本发明所述的鱼皮来自鲢鱼、罗非鱼。
本发明还提供所述鱼皮蛋白肽在药品、保健食品、化妆品和食品添加剂中的应用。
本发明进一步提供含有如SEQ ID NO:1和2所示鱼皮蛋白肽的药品、保健食品、化妆品和食品添加剂。
本发明具有以下优点：
(一)本发明对鱼皮进行打浆处理，然后进行120-130℃处理，再结合特定频率超声波技术处理鱼皮蛋白浆，再进行115-125℃高温处理，直接将可溶性蛋白提取出来。
(二)本发明先将可溶性蛋白提取出来，再利用蛋白酶酶解，蛋白酶的总使用量只为鱼皮重量的0.15-0.30％。
(三)开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶)，在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量大小的鱼皮蛋白肽，无需调节pH值，产物为100％鱼皮蛋白肽。
(四)所得鱼皮蛋白肽中分子量小于1500Da的肽的比例为85％以上。具有较好的抗氧化功能，其10μg/mL条件下DPPH自由基清除能力达到90％以上。
(五)所得鱼皮蛋白肽粉产品中序列如SEQ ID NO:1和2所示的鱼皮蛋白肽的含量占鱼皮蛋白肽粉总重的50％以上。
(六)本发明提供的鱼皮蛋白肽，能广泛作为食品添加剂。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鲢鱼皮100克，在12℃条件下进行解冻清洗，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量1.5倍的水在120℃的条件下保温60分钟。
(2)将鱼皮的温度调整到70℃，于超声波发生器中经超声波(频率为60kH)处理35分钟，改变鱼皮蛋白的组织结构。
(3)然后将鱼皮的温度调整到115℃，在115℃条件下煮制150分钟，通过离心取上清液。
(4)按照鱼皮重量0.15％的比例向(3)的上清液中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步向上清液中加入鱼皮重量0.10％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1，其中碱性蛋白酶的酶活为70万U/g，胰蛋白酶的酶活为40万U/g)，在55℃的条件下进行酶解反应1.0h；然后进行第二步酶解，向上述酶解体系中加入鱼皮重量0.05％复合蛋白酶(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1，其中木瓜蛋白酶的酶活为30万U/g，风味蛋白酶的酶活为50万U/g)，在55℃条件下进行酶解反应1.0h；在95-98℃下保温10分钟，冷却至室温，利用活性炭过滤，收集上清液。
(5)将步骤(4)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的滤膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(6)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取第7-9分钟收集的肽溶液。
(7)将步骤(6)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对鱼皮蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示，两种鱼皮蛋白肽约占鱼皮蛋白肽粉总重的50.5％。其中90％以上鱼皮蛋白肽的分子量小于1500Da。
实施例2 具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻罗非鱼皮500克，在10℃条件下进行解冻清洗，取鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量2.0倍的水在125℃的条件下保温60分钟。
(2)将鱼皮的温度调整到65℃，于超声波发生器中经超声波(频率为55kH)处理35分钟，改变鱼皮蛋白的组织结构。
(3)然后将鱼皮的温度调整到120℃，在120℃条件下煮制120分钟，通过离心取上清液。
(4)按照鱼皮重量0.30％的比例向(3)的上清液中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步向上清液中加入鱼皮重量0.15％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1，其中碱性蛋白酶的酶活为80万U/g，胰蛋白酶的酶活为50万U/g)，在55℃的条件下进行酶解反应0.5h；然后进行第二步酶解，向上述酶解体系中加入鱼皮重量0.15％复合蛋白酶(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1，其中木瓜蛋白酶的酶活为50万U/g，风味蛋白酶的酶活为70万U/g)，在55℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，利用活性炭过滤，收集上清液。
(5)将步骤(4)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的滤膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(6)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取第7-9分钟收集的肽溶液。
(7)将步骤(6)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对鱼皮蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示，两种鱼皮蛋白肽约占鱼皮蛋白肽粉总重的50.2％。其中90％以上鱼皮蛋白肽的分子量小于1500Da。
实施例3 具有具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鲢鱼皮1000克，在8℃条件下进行解冻清洗，取鱼皮，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量2.5倍的水在130℃的条件下保温30分钟。
(2)将鱼皮的温度调整到60℃，于超声波发生器中经超声波(频率为50kH)处理35分钟，改变鱼皮蛋白的组织结构。
(3)然后将鱼皮的温度调整到125℃，在125℃条件下煮制120分钟，通过离心取上清液。
(4)按照鱼皮重量0.20％的比例向(3)的上清液中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步向上清液中加入鱼皮重量0.10％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1，其中碱性蛋白酶的酶活为100万U/g，胰蛋白酶的酶活为60万U/g)，在55℃的条件下进行酶解反应1.0h；然后进行第二步酶解，向上述酶解体系中加入鱼皮重量0.10％复合蛋白酶(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1，其中木瓜蛋白酶的酶活为60万U/g，风味蛋白酶的酶活为90万U/g)，在55℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，利用活性炭过滤，收集上清液。
(5)将步骤(4)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的滤膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(6)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取第7-9分钟收集的肽溶液。
(7)将步骤(6)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对鱼皮蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示，两种鱼皮蛋白肽约占鱼皮蛋白肽粉总重的51.3％。其中90％以上鱼皮蛋白肽的分子量小于1500Da。
实验例本发明鱼皮蛋白肽抗氧化活性的测定试验
试验样品：实施例1-3中制备的鱼皮蛋白抗氧化活性肽。
实验方法如下：
(1)清除DPPH自由基能力：取10μg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)还原力测定：取10μg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
(3)氧化自由基吸收能力(ORAC)：不同浓度的抗氧化活性肽溶液10μL与75mM磷酸盐缓冲液90μL(pH 7.4)及200nM的荧光试剂50μL充分混合，然后在37℃温育15min，再加入80mM的AAPH溶液50μL。用酶标仪每分钟读取荧光值共进行100min。荧光的激发波长和发射波长分别是485nm和538nm。用磷酸缓冲溶液代替样品作为空白。以Trolox作为标准对照，使用的浓度为0，2，4，8，12，16μM，绘制荧光淬灭曲线，并计算荧光淬灭曲线下的积分面积(AUC)。AUC的计算公式如下：
式中：f0是0min时荧光值，fi是第i min时的荧光值。
ORAC值用样品曲线的斜率与Trolox曲线的斜率之比，ORAC值得单位表示为μMTrolox/mg肽。
(4)ABTS·+自由基清除能力：取1mg/mL的样品溶液0.04ml与4ml稀释后的ABTS溶液混合震荡30s后，常温避光放置6min，再在734nm下检测其吸光值，空白用蒸馏水代替样品。清除ABTS·+自由基能力计算公式如下：
ABTS·+自由基清除率％＝(1－A样品/A空白)×100
(5)亚铁离子螯合力的测定：样品配成浓度为1mg/mL的样品溶液，取样品溶液1mL，加入3.7mL乙醇和0.1mL 2mM的FeCl2溶液混合，再加入0.2mL 5mM的菲咯嗪溶液启动反应。在室温下静置10min后，在562nm波长处检测吸光度。空白用蒸馏水代替样品。
亚铁离子螯合能力％＝[(空白吸光值－样品吸光值)/空白吸光值]×100
结果显示，本发明鱼肉抗氧化活性肽具有较好的抗氧化能力，在10μg/mL的条件下，清除DPPH自由基能力达到91％以上，还原力达到0.90以上，ABTS·+自由基清除能力达85％以上，亚铁离子螯合力达90％以上，ORAC值为18.5以上，是一种理想的抗氧化肽(表1)。
表1 本发明鱼皮抗氧化活性肽的抗氧化活性试验结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法与应用
<120> 天津市宽达水产食品有限公司
<130> KHP171112775.2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 鱼
<400> 1
Gly Pro Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 鱼
<400> 2
Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys
1 5
Claims (3)
1.具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽粉，其特征在于，所述鱼皮蛋白肽粉的制备方法包括以下步骤：
(1)将冷冻鱼皮在8-12℃条件下进行解冻清洗，鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量1.5-2.5倍的水，于120-130℃保温30-60分钟；
(2)将鱼皮蛋白浆的温度下调至60-70℃，进行超声处理；超声处理在超声波发生器内进行，超声波的频率为50-60kH，处理时间25-35分钟；
(3)将经过超声后鱼皮蛋白浆的温度上调至115-125℃，于115-125℃煮制90-150分钟，然后离心取上清液；
(4)按照鱼皮重量0.15-0.30％的比例向(3)的上清液中加入复合蛋白酶进行分步酶解：第一步向上清液中加入鱼皮重量0.10-0.15％的复合蛋白酶I，于50-55℃酶解0.5-1.0h；第二步向上述酶解体系中加入鱼皮重量0.05-0.15％的复合蛋白酶II，于50-60℃酶解0.5-1.0h；然后在95-98℃下保温10-20分钟，冷却至室温，用活性炭过滤，收集上清液；
(5)对步骤(4)所得上清液进行超滤处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的滤膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(6)分子量小于3000的蛋白肽液再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取第7-9分钟收集的肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到含有序列如SEQ ID NO:1和2所示的鱼皮蛋白肽的鱼皮蛋白肽粉；SEQ ID NO:1和2所示的鱼皮蛋白肽的含量占鱼皮蛋白肽粉总重的50-53％；
其中，步骤(4)的复合蛋白酶I由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按质量比1-2:1组成，其中碱性蛋白酶的酶活为70-100万U/g，胰蛋白酶的酶活为40-60万U/g；复合蛋白酶II由木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按质量比1-2:1组成，其中木瓜蛋白酶的酶活为30-60万U/g，风味蛋白酶的酶活为50-90万U/g；
所述鱼皮来自鲢鱼、罗非鱼；
步骤(6)RP-HPLC的条件为：0-5min，流动相为纯水；流动相B：含0.1％TFA的乙腈，5-10min流动相B，从0％到35％，10-15min，流动相B从65％到95％，15-30min，流动相B从95％到0％，30min停止；所用色谱柱为：Kromasil C18，5μm，4.6×250mm。
2.权利要求1所述鱼皮蛋白肽粉在制备药品、保健食品、化妆品和食品添加剂中的应用。
3.含有权利要求1所述鱼皮蛋白肽粉的药品、保健食品、化妆品和食品添加剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Fish skin protein peptide with antioxidant function and its preparation and application Effective date of registration: 20221130 Granted publication date: 20201020 Pledgee: Bank of Beijing Limited by Share Ltd. Tianjin branch Pledgor: TIANJIN KUANDA AQUATIC FOOD CO.,LTD. Registration number: Y2022980024412 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |