CN109336953B - 一种苦荞抗氧化肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种苦荞抗氧化肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种苦荞抗氧化肽，数量为3个，分别命名为苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3，氨基酸序列分别为Gly‑Glu‑Val‑Pro‑Trp、Tyr‑Met‑Glu‑Asn‑Phe和Ala‑Phe‑Tyr‑Arg‑Trp，分子量分别为587.0Da、702.8Da和741.8Da。还提供了苦荞抗氧化肽的制备方法，以苦荞粉为原料制备苦荞清蛋白粉末，然后将苦荞清蛋白粉末进行酶解得到苦荞清蛋白酶解肽，苦荞清蛋白酶解肽经分离纯化得到苦荞抗氧化肽。本发明制备的苦荞抗氧化肽消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，开发了苦荞的新用途，具有抑制脂质过氧化和清除自由基的功能,维持人体自由基的平衡的功效，能在食品和药品上应用，苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，可以用于降糖药物的开发利用。

Description

一种苦荞抗氧化肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗氧化肽技术领域，具体涉及一种苦荞抗氧化肽及其制备方法。
背景技术
苦荞是我国药食同源文化的典型体现，与“何首乌、大黄”等同属蓼科，具有很高的食药两用价值，我国是最早种植苦荞的国家，种植面积最大，产品远销日本，美国和欧洲等地区。然而目前，对于苦荞的研究主要在理化性质上，而苦荞蛋白和生物活性肽的研究很少。
活性氧和自由基是人体正常生理过程中产生的物质，可以发挥多种功能，如信号传递作用和预防感染，人体本身具有清除自由基的能力，但是在某些情况下，机体不能及时地清除体内产生的自由基从而导致氧化应激的发生，并且可能会进一步引发一系列慢性疾病，如衰老、癌症、心血管疾病和动脉粥样硬化等其他疾病。目前，人们发现通过补充天然或人工合成的抗氧化剂可作为预防机体因氧化应激所造成的生物大分子的系列损伤，但是人工合成的抗氧化剂却对健康有着潜在风险，使用已经开始受到限制。因此，近年来，从天然源中寻找新的、安全的抗氧化剂化合物，以替代合成抗氧化剂在食品和医药中的应用成为人们关注的热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种苦荞抗氧化肽及其制备方法，本发明消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，所分离得到的抗氧化多肽可以取代传统的合成抗氧化剂，本发明从苦荞粉中提取苦荞清蛋白粉末，再采用酶解、分离纯化的方法得到苦荞抗氧化肽，开发了苦荞的新用途，具有抑制脂质过氧化和清除自由基的功能，维持人体自由基的平衡的功效，本发明的苦荞抗氧化肽能在食品和药品上应用，尤其是苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，可以用于降糖药物的开发利用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种苦荞抗氧化肽，其特征在于，所述苦荞抗氧化肽的数量为3个，分别命名为苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3，苦荞抗氧化肽P1的氨基酸序列为Gly-Glu-Val-Pro-Trp，分子量为587.0Da；苦荞抗氧化肽P2的氨基酸序列为Tyr-Met-Glu-Asn-Phe，分子量为702.8Da；苦荞抗氧化肽P3的氨基酸序列为Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，分子量为741.8Da。
另外本发明还提供了上述的苦荞抗氧化肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、苦荞清蛋白粉末的制备方法
向苦荞粉中加入正己烷搅拌脱脂，脱脂后进行固液分离，重复以上搅拌脱脂和固液分离操作步骤三次，得到脱脂苦荞粉，将脱脂苦荞粉和去离子水按照质量比为1:10的比例混合搅拌，搅拌提取2h后在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心15min，离心后取上清液，用1M的盐酸调节上清液的pH值至4.5，沉淀后得到上清液蛋白，再用去离子水冲洗所述上清液蛋白2次，然后用0.1M的NaOH溶液调节所述上清液蛋白的pH值至7.0，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白粉末；四次搅拌脱脂的时间共48h，所述正己烷的每次的加入体积与所述苦荞粉的质量之比为1mL:1g。
S2、苦荞清蛋白酶解肽的制备方法
将S1得到的苦荞清蛋白粉末和去离子水混合溶解，得到浓度为30mg/mL的苦荞清蛋白溶液，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至9.0，加入碱性蛋白酶，在45℃的恒温震荡水浴锅中酶解4h，置于沸水浴中10min，在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心10min，离心后取上清液，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白酶解肽；所述水浴锅的震荡速率为100rpm；所述碱性蛋白酶的加入量为所述苦荞清蛋白粉末质量的4％。
S3、苦荞抗氧化肽的制备方法
S301、超滤：首先用截留分子量为3kDa和10kDa的超滤管对TBAH；进行超滤分离后，得到MW≤3k Da，10k Da＞MW＞3k Da和MW≥10kDa的三个重均分子量的多肽组分，分别命名为TBAH-Ⅰ、TBAH-Ⅱ和TBAH-Ⅲ均在-20℃的温度条件冷冻干燥；所述MW为重均分子量；
S302、阴离子交换色谱法：在S301中得到的三种不同重均分子量的多肽组分中选取抗氧化活性最佳的多肽组分TBAH-Ⅰ，用去离子水溶解至浓度为50mg/mL，取4mL，用DEAE-52纤维素阴离子交换色谱柱进行分离，依次用去离子水、0.1mol/L、0.5mol/L和1mol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，流速为1.0mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到5个洗脱组分，分别命名为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
S303、葡聚糖凝胶色谱法：在S302得到5个洗脱组分中选取抗氧化活性最佳的洗脱组分Fr.2，用去离子水溶解至浓度为40mg/mL，取1mL，用G15葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，用去离子水进行洗脱，流速为1.0mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到3个洗脱组分，分别命名为Fr.2-1、Fr.2-2和Fr.2-3，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
S304、RP-HPLC反向高效液相色谱法：在S303得到3个洗脱组分中选取S303中抗氧化活性最佳的洗脱组分，采用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，色谱柱为C18柱，流动相为第一混合液+第二混合液，进行线性洗脱，所述第一混合液由水和三氟乙酸混合而成，所述第二混合液由乙腈和三氟乙酸混合而成，所述第一混合液和第二混合液中的三氟乙酸的体积含量均为0.1％；线性洗脱的条件为：洗脱时间30min，自第二混合液占流动相的体积比为0％开始，至60％结束洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为280nm，分离纯化得到苦荞抗氧化肽，即苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3；
S305、利用蛋白质/多肽测序仪对苦荞抗氧化肽的氨基酸测序，利用电喷雾电离源耦合的质谱仪对苦荞抗氧化肽的分子量检测。
上述的方法，其特征在于，S302-S304中所述抗氧化活性的测定方法为羟基自由基清除活性测定。
优选地，将苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3应用于食品和医药中，尤其苦荞抗氧化肽P3具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性应用于降糖药物中。
羟基自由基是最主要的活性氧，它能与细胞中几乎所有的物质发生反应，对细胞造成严重的损伤。因此，羟基自由基被认为是所有自由基中的典型代表，被广泛用于监测和评价蛋白质水解物、组分和肽的抗氧化能力，本发明的苦荞清蛋白酶解肽经分离纯化得到苦荞抗氧化肽的过程中，用羟基自由基清除活性测定作为抗氧化性活性的测定方法。
本发明改变了现有抗氧化剂的提取与运用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，所分离得到的抗氧化多肽可以取代传统的合成抗氧化剂。
苦荞被誉为“五谷之王”，能够降血压，降血糖，降血脂。苦荞营养丰富，药用特性好，本发明开发了苦荞的新用途，从苦荞粉中提取苦荞清蛋白粉末，再采用酶解、分离纯化的方法得到苦荞抗氧化肽，具有抑制脂质过氧化和清除自由基的功能,维持人体自由基的平衡的功效，开拓了苦荞的新应用领域，本发明用苦荞粉为原料有较高的食药两用价值，本发明的苦荞抗氧化肽能在食品和药品上应用，尤其是苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，可以用于降糖药物的开发利用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明改变了现有抗氧化剂的提取与运用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，所分离得到的抗氧化多肽可以取代传统的合成抗氧化剂。
2、苦荞被誉为“五谷之王”，能够降血压，降血糖，降血脂。苦荞营养丰富，药用特性好，本发明开发了苦荞的新用途，从苦荞粉中提取苦荞清蛋白粉末，再采用酶解、分离纯化的方法得到苦荞抗氧化肽，具有抑制脂质过氧化和清除自由基的功能,维持人体自由基的平衡的功效，开拓了苦荞的新应用领域，本发明用苦荞粉为原料有较高的食药两用价值，本发明的苦荞抗氧化肽能在食品和药品上应用，尤其是苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，可以用于降糖药物的开发利用。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1的S301中经过超滤得到的三个重均分子量的多肽组分的羟基自由基清除活性示意图。
图2是本发明实施例1的S302中经过阴离子交换色谱法合并收集得到的5个洗脱组分的离子交换色谱图。
图3是本发明实施例1的S302中经过阴离子交换色谱法合并收集得到的5个洗脱组分的羟基自由基清除活性示意图。
图4是本发明实施例1的S303中经过葡聚糖凝胶色谱法合并收集得到的3个洗脱组分的凝胶色谱图。
图5是本发明实施例1的S303中经过葡聚糖凝胶色谱法合并收集得到的3个洗脱组分的羟基自由基清除活性示意图。
图6是本发明实施例1的S304中经过RP-HPLC反向高效液相色谱法分离纯化得到的苦荞抗氧化肽的高效液相色谱图。
图7是本发明实施例1的苦荞抗氧化肽P1的质谱图。
图8是本发明实施例1的苦荞抗氧化肽P2的质谱图。
图9是本发明实施例1的苦荞抗氧化肽P3的质谱图。
图10是本发明实施例1的不同浓度的苦荞抗氧化肽3个多肽苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的还原力示意图。
图11是本发明实施例1中的不同时间的苦荞抗氧化肽3个多肽苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的体外脂质过氧化抑制情况示意图。
图12为本发明实施例1中的苦荞抗氧化肽P3在不同浓度下的α葡萄糖苷酶抑制率曲线图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的苦荞抗氧化肽，所述苦荞抗氧化肽的数量为3个，分别命名为苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3，苦荞抗氧化肽P1的氨基酸序列为Gly-Glu-Val-Pro-Trp，分子量为587.0Da；苦荞抗氧化肽P2的氨基酸序列为Tyr-Met-Glu-Asn-Phe，分子量为702.8Da；苦荞抗氧化肽P3的氨基酸序列为Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，分子量为741.8Da。
本实施例还提供了上述的苦荞清蛋白粉末的制备制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、苦荞清蛋白粉末的制备方法
向苦荞粉中加入正己烷搅拌脱脂，脱脂后进行固液分离，重复以上搅拌脱脂和固液分离操作步骤三次，得到脱脂苦荞粉，将脱脂苦荞粉和去离子水按照质量比为1:10的比例混合搅拌，搅拌提取2h后在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心15min，离心后取上清液，用1M的盐酸调节上清液的pH值至4.5，沉淀后得到上清液蛋白，再用去离子水冲洗所述上清液蛋白2次，然后用0.1M的NaOH溶液调节所述上清液蛋白的pH值至7.0，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白粉末；四次搅拌脱脂的时间共48h，所述正己烷的每次的加入体积与所述苦荞粉的质量之比为1mL:1g。
S2、苦荞清蛋白酶解肽的制备方法
将S1得到的苦荞清蛋白粉末和去离子水混合溶解，得到浓度为30mg/mL的苦荞清蛋白溶液，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至9.0，加入碱性蛋白酶，在45℃的恒温震荡水浴锅中酶解4h，置于沸水浴中10min，在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心10min，离心后取上清液，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白酶解肽，命名为TBAH；所述水浴锅的震荡速率为100rpm；所述碱性蛋白酶的加入量为所述苦荞清蛋白粉末质量的4％。
S3、苦荞抗氧化肽的制备方法
S301、超滤：首先用截留分子量为3kDa和10kDa的超滤管对TBAH进行超滤分离后，得到MW≤3k Da，10k Da＞MW＞3k Da和MW≥10kDa的三个重均分子量的多肽组分，分别命名为TBAH-Ⅰ、TBAH-Ⅱ和TBAH-Ⅲ，均在-20℃的温度条件冷冻干燥；所述MW为重均分子量；
S302、阴离子交换色谱法：在S301中得到的三个重均分子量的多肽组分中选取抗氧化活性最佳的多肽组分TBAH-Ⅰ，用去离子水溶解至浓度为50mg/mL，取4mL，用DEAE-52纤维素阴离子交换色谱柱进行分离，依次用去离子水、0.1mol/L、0.5mol/L和1mol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，流速为1.0mL/min，收集到120管洗脱液，每管收集3mL洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到5个洗脱组分，分别命名为Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
S303、葡聚糖凝胶色谱法：在S302得到5个洗脱组分中选取抗氧化活性最佳的洗脱组分Fr.2，用去离子水溶解至浓度为40mg/mL，取1mL，用G15葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，用去离子水进行洗脱，流速为1.0mL/min，收集到60管洗脱液，每管收集3mL洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到3个洗脱组分，分别命名为Fr.2-1、Fr.2-2和Fr.2-3，在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
S304、RP-HPLC反向高效液相色谱法：在S303得到3个洗脱组分中选取S303中抗氧化活性最佳的洗脱组分Fr.2-2，采用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，色谱柱为C18柱，流动相为第一混合液+第二混合液，进行线性洗脱，所述第一混合液由水和三氟乙酸混合而成，所述第二混合液由乙腈和三氟乙酸混合而成，所述第一混合液和第二混合液中的三氟乙酸的体积含量均为0.1％；线性洗脱的条件为：洗脱时间30min，自第二混合液占流动相的体积比为0％开始，至60％结束洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为280nm，分离纯化得到苦荞抗氧化肽，即苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3；
S305、利用蛋白质/多肽测序仪对苦荞抗氧化肽的氨基酸测序，利用电喷雾电离源耦合的质谱仪对苦荞抗氧化肽的分子量检测；苦荞抗氧化肽P1的氨基酸序列为Gly-Glu-Val-Pro-Trp，分子量为587.0Da；苦荞抗氧化肽P2的氨基酸序列为Tyr-Met-Glu-Asn-Phe，分子量为702.8Da；苦荞抗氧化肽P3的氨基酸序列为Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，分子量为741.8Da。
上述的方法，S302-S304中所述抗氧化活性的测定方法为羟基自由基清除活性测定。
羟基自由基是最主要的活性氧，它能与细胞中几乎所有的物质发生反应，对细胞造成严重的损伤。因此，羟基自由基被认为是所有自由基中的典型代表，被广泛用于监测和评价蛋白质水解物、组分和肽的抗氧化能力，本发明的苦荞清蛋白酶解肽经分离纯化得到苦荞抗氧化肽的过程中，用羟基自由基清除活性测定作为抗氧化性活性的测定方法。
本发明的苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3能应用于食品和医药中，尤其苦荞抗氧化肽P3具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性能应用于降糖药物中。
图1是本实施例的S301中经过超滤得到的三个重均分子量的多肽组分的羟基自由基清除活性示意图，由图1可知，TBAH-Ⅰ(MW<3kDa)的羟自由基清除率为61.52％，显著强于TBAH、TBAH-ⅡⅠ和TBAH-Ⅲ，说明经超滤分离得到的低分子量的多肽组分在清除自由基方面要比高分子量的肽好，多肽的分子量大小在肽的生物活性中起着很重要的作用，通常在蛋白水解液中，分子量较小的肽段往往要比分子量较大的肽段的抗氧化能力强。
图2是本实施例的S302中经过阴离子交换色谱法合并收集得到的5个洗脱组分的离子交换色谱图，图3是本实施例的S302中经过阴离子交换色谱法合并收集得到的5个洗脱组分的羟基自由基清除活性示意图，由图2和图3可知，TBAH-Ⅲ经DEAE-52纤维素阴离子交换色谱柱分离得到5个组分，其中Fr.2的羟自由基清除率为65.48％，显著高于TBAH-ⅡⅠ、Fr.1、Fr.3、Fr.4和Fr.5，所以将Fr.2进行下一步的纯化。
图4本实施例的S303中经过葡聚糖凝胶色谱法合并收集得到的3个洗脱组分的凝胶色谱图，图5是本实施例的S303中经过葡聚糖凝胶色谱法合并收集得到的3个洗脱组分的羟基自由基清除活性示意图，由图4和图5可知，Fr.2经G15葡聚糖凝胶色谱柱分离得到3个组分，其中Fr.2-2的羟自由基清除率为73.17％，显著高于Fr.2-1和Fr.2-3，所以将Fr.2-2进行下一步的纯化。
图6是本实施例的S304中经过RP-HPLC反向高效液相色谱法分离纯化得到的苦荞抗氧化肽的高效液相色谱图，由图6可知，分离得到3个苦荞抗氧化肽，即苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3。
利用蛋白质/多肽测序仪对苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的氨基酸测序，氨基酸序列分别为Gly-Glu-Val-Pro-Trp、Tyr-Met-Glu-Asn-Phe和Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，根据氨基酸序列得到苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的分子量理论值分别为586.65Da,702.79Da和741.85Da。
图7-图9是本实施例的苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的质谱图，由图7-图9可知3个苦荞抗氧化肽的分子量分别为587.0Da、702.8Da和741.8Da，与根据苦荞抗氧化肽的氨基酸序列分子量理论值一致。
目前使用的抗氧化测定的方法非常多，根据抗氧化剂的作用原理主要分为两类：基于H原子转移的方法(HAT)和基于电子转移的方法(SET)(Prior,Wu,&Schaich,2005)。抗氧化活性主要表现在清除自由基、抑制脂质氧化降解、抑制促氧化剂和还原力等方面。然而由于生物体系统中存在多种复杂的抗氧化系统，目前还没有一种方法能够完全地评价一个物质的抗氧化性。因此，在评价本发明的抗氧化肽的抗氧化性，需要根据不同的抗氧化原理去选择合适的方法。
抗氧化活性的测定方法有五种：包括羟基自由基清除活性测定、DPPH自由基清除活性测定、还原力测定、脂质过氧化抑制试验和α葡萄糖苷酶体外抑制实验。
S4、羟基自由基清除活性测定
采用南京建成的羟基自由基试剂盒测定样品的羟基自由基清除活性。按照试剂盒的说明书进行操作，抗坏血酸用作阳性对照。通过以下公式计算羟基自由基清除活性：
羟基自由基清除活性＝(A0-A1)/A0×100％
其中A0是空白的吸光度，A1是样品溶液的吸光度。
S5、DPPH自由基清除活性测定
根据(Liu，Jin，Lin，Jones，&Chen，2015)描述的方法测量DPPH自由基清除活性，并进行一些修改。用95％乙醇溶液制备0.1mM的DPPH溶液。将100μL样品和100μL DPPH溶液在96孔板中混合。将混合物在黑暗中静置30分钟。通过uQuant Bio-Tek酶标仪在波长为517nm的条件下测量吸光度。使用乙醇做空白。抗坏血酸用作阳性对照。DPPH自由基清除活性通过以下公式计算：
DPPH自由基清除活性＝(A2-A3)/A2×100％
其中A2是空白的吸光度，A3是样品溶液的吸光度。
S6、还原力测定
根据(Jin，Liu，Zheng，Wang，&He，2016)的方法测定还原力。将2mL样品与2mL的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.6)和2mL 10mg/mL的铁氰化钾溶液混合，得到混合物1，将混合物1置于50℃水浴中20min，然后向混合物1中加入2mL 100mg/mL的三氯乙酸溶液，并以4000r/min的速率离心10min，取2mL上清液与2mL去离子水和0.4mL 1mg/mL的三氯化铁溶液溶液混合，得到混合物2，剧烈摇动后，将摇动后的混合物2置于50℃水浴中10min后，在波长为700nm的条件下测量吸光度，吸光度用于表征蛋白肽的还原力。使用等体积的蒸馏水作为空白。GSH用作阳性对照。
S7、脂质过氧化抑制试验
根据(Chi，Wang，Wang，Zhang，&Deng，2015)的方法测定脂质过氧化抑制活性。将5.0mg样品溶于10mL 50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，再加入0.13mL亚油酸和10mL99.5％的乙醇溶液，用去离子水将总体积调节至25mL，得到混合物3，将混合物3置于40℃的暗室中7d，并通过测量硫氰酸铁的值来评估亚油酸的氧化程度，将100μL的在亚油酸模型系统中温育的暗室处理后的混合物3与4.7mL质量分数为75％乙醇溶液，0.1mL质量分数为30％的硫氰酸铵溶液和0.1mL 20mmol/L的氯化亚铁溶液(氯化亚铁溶液中含质量分数为3.5％的盐酸溶液)混合搅拌3min后，在波长为500nm的条件下测定吸光度。
S8、α葡萄糖苷酶体外抑制实验
使用的α葡萄糖苷酶浓度为0.8u/mL。设置空白组、对照组、样品空白组、样品组，检测在96孔板中进行。按照下表1添剂量和顺序添加，0.2mol/L的碳酸钠溶液终止反应后，在波长为405nm的条件下测定吸光度。每个体系重复三次，取平均值。按照下面的计算公式求出抑制率。
抑制率＝1-(样品组-样品空白组)/(对照组-空白组)×100％
表1各反应物体添加剂量和顺序
Figure BDA0001879282130000121
本发明改变了现有抗氧化剂的提取与运用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，所分离得到的抗氧化多肽可以取代传统的合成抗氧化剂。
将本实施例的苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3分别用上述的抗氧化测定的方法进行测定。
表2苦荞抗氧化肽的羟基自由基，DPPH自由基清除活性
Figure BDA0001879282130000122
羟基自由基是人体内存在的自由基，也是体内活性最强的自由基。由表2可知，三个苦荞抗氧化肽的羟基自由基清除能力均弱于阳性对照(抗坏血酸)，苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的清除羟基自由基的IC50分别为2.21mmol/L、1.56mmol/L和0.65mmol/L，其中苦荞抗氧化肽P3的活性最高。
DPPH自由基是人工合成的自由基，可以通过接受质子来清除，苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的的IC50分别为1.20mmol/L、2.91mmol/L和0.64mmol/L。苦荞抗氧化肽P3表现出最强的清除活性。
以上结果表明苦荞抗氧化肽(尤其是苦荞抗氧化肽P3)在羟基自由基和DPPH自由基两个方面均表现出较好的自由基清除活性，说明其可以作为食品和生物系统中自由基氧化损伤的保护剂。
图10是本实施例的不同浓度的苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3还原力，由图10可知，在0-4mg/mL的浓度范围内抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的吸光度均随着浓度增加而逐渐增大，呈现一定的浓度依赖性，在浓度为4mg/mL时，苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3的吸光度依次为0.702，0.554，0.927。采用吸光度表征抗氧化肽的还原力，结果表明苦荞抗氧化肽P3的还原力最强，可以被用作电子供体。
脂质过氧化是一个复杂的过程，涉及到脂质自由基和脂质过氧化的形成和传播，它们是在氧存在下形成的初级氧化产物，图11是本实施例的苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3不同时间的体外脂质过氧化抑制情况，从图11可以看出，在7天的时间里，空白(未加抗氧化剂)的吸光度一直处于最高，说明氧化程度最高，与空白相比，苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3都能很显著的抑制脂质过氧化，其中苦荞抗氧化肽P2的抑制能力最强，和GSH(阳性对照)相近。
多肽的活性取决于其分子大小、氨基酸组成和序列，特别是分子量较低的生物活性肽(2-10个氨基酸残基)更容易通过肠道屏障，发挥生物效应。本发明中的苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3分子大小均属于这个范围内，同时苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3均表现出较好的抗氧化活性。此外，肽段的氨基酸组成和末端氨基酸的种类在抗氧化活性上起着重要作用。含有芳香氨基酸残基的肽以及含有Tyr、His、Pro、Trp和Met的肽具有较高的抗氧化能力。当肽的N端或C端是疏水氨基酸，如Trp、Pro、Tyr、Lys、Leu、Val和His时，可以通过与脂质分子相互作用，将质子注入自由基来清除自由基，从而提高抗氧化肽的活性,含有Tyr的肽序列具有较强的抗氧化活性，特别是当Tyr存在于肽序列的末端时，其抗氧化活性可能与酚类基团作为供氢体的特殊能力有关，这是抑制自由基介导的过氧化链式反应的一种机制。因此，可以推断苦荞抗氧化肽P1的氨基酸序列中的Pro和末端的Trp，苦荞抗氧化肽P2的氨基酸序列中的Met和末端的Typ，苦荞抗氧化肽P3的氨基酸序列中的Tyr和末端的Trp都有利于它们的抗氧化活性。
表3苦荞抗氧化肽P3的α葡萄糖苷酶体外抑制实验结果
Figure BDA0001879282130000141
苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，表3为苦荞抗氧化肽P3的α葡萄糖苷酶体外抑制实验结果，图12为本实施例中的苦荞抗氧化肽P3在不同浓度下的α葡萄糖苷酶抑制率曲线图，由表3和图12可知，说明随着浓度的增加，苦荞抗氧化肽P3对α葡萄糖苷酶抑制率增加，当浓度为1mg/mL时，苦荞抗氧化肽P3抑制α葡萄糖苷酶的IC50为0.4mg/mL，抑制率为64.13％，后随着浓度的增加苦荞抗氧化肽P3对α葡萄糖苷酶抑制率趋于平缓，说明P3可以用于降糖药物的开发利用。
综上所述，本实施例的苦荞抗氧化肽在食品和药品方面具有应用前景，除此之外，苦荞抗氧化肽中的苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，可以用于降糖药物的开发利用。
苦荞被誉为“五谷之王”，能够降血压，降血糖，降血脂。苦荞营养丰富，药用特性好，本发明开发了苦荞的新用途，从苦荞粉中提取苦荞清蛋白粉末，再采用酶解、分离纯化的方法得到苦荞抗氧化肽，具有抑制脂质过氧化和清除自由基的功能，维持人体自由基的平衡的功效，开拓了苦荞的新应用领域，本发明用苦荞粉为原料有较高的食药两用价值，本发明的苦荞抗氧化肽能在食品和药品上应用，尤其是苦荞抗氧化肽P3还具有体外抑制α葡萄糖苷酶的活性，可以用于降糖药物的开发利用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (2)

1.一种制备苦荞抗氧化肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、苦荞清蛋白粉末的制备方法
向苦荞粉中加入正己烷搅拌脱脂，脱脂后进行固液分离，重复以上搅拌脱脂和固液分离操作步骤三次，得到脱脂苦荞粉，将脱脂苦荞粉和去离子水按照质量比为1:10的比例混合搅拌，搅拌提取2h后在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心15 min，离心后取上清液，用1M 的盐酸调节上清液的pH值至4.5，沉淀后得到上清液蛋白，再用去离子水冲洗所述上清液蛋白2次，然后用0.1M的NaOH溶液调节所述上清液蛋白的pH值至7.0，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白粉末；四次搅拌脱脂的时间共48h，所述正己烷的每次的加入体积与所述苦荞粉的质量之比为1mL: 1 g；
S2、苦荞清蛋白酶解肽的制备方法
将S1得到的苦荞清蛋白粉末和去离子水混合溶解，得到浓度为30mg/mL的苦荞清蛋白溶液，用1mol/L的 NaOH溶液调节pH值至9.0，加入碱性蛋白酶，在45℃的恒温震荡水浴锅中酶解4h，置于沸水浴中10min，在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心10 min，离心后取上清液，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白酶解肽，命名为TBAH；所述水浴锅的震荡速率为100rpm；所述碱性蛋白酶的加入量为所述苦荞清蛋白粉末质量的4%；
S3、苦荞抗氧化肽的制备方法
S301、超滤：首先用截留分子量为3kDa和10kDa的超滤管对TBAH进行超滤分离后，得到MW≤3k Da，10k Da＞MW＞3k Da和MW≥10kDa的三个重均分子量的多肽组分，分别命名为TBAH-Ⅰ、TBAH-Ⅱ和TBAH-Ⅲ均在-20℃的温度条件冷冻干燥；所述MW为重均分子量；
S302、阴离子交换色谱法：在S301中得到的三种不同重均分子量的多肽组分中选取抗氧化活性最佳的多肽组分TBAH-Ⅰ，用去离子水溶解至浓度为50mg/mL，取4mL，用DEAE-52纤维素阴离子交换色谱柱进行分离，依次用去离子水、0.1mol/L、0.5mol/L和1mol/L的 NaCl溶液进行阶段洗脱，流速为1.0 mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到5个洗脱组分，分别命名为Fr.1、Fr.2、Fr.3、 Fr.4 和Fr.5，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
S303、葡聚糖凝胶色谱法：在S302中得到5个洗脱组分中选取抗氧化活性最佳的洗脱组分Fr.2，用去离子水溶解至浓度为40mg/mL，取1mL，用G15葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，用去离子水进行洗脱，流速为1.0 mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到3个洗脱组分，分别命名为Fr.2-1、Fr.2-2 和 Fr.2-3，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；
S304、RP-HPLC反向高效液相色谱法：在S303得到3个洗脱组分中选取S303中抗氧化活性最佳的洗脱组分，采用RP-HPLC 反相高效液相色谱进行分离，色谱柱为C18柱，流动相为第一混合液+第二混合液，进行线性洗脱，所述第一混合液由水和三氟乙酸混合而成，所述第二混合液由乙腈和三氟乙酸混合而成，所述第一混合液和第二混合液中的三氟乙酸的体积含量均为0.1%；线性洗脱的条件为：洗脱时间30min，自第二混合液占流动相的体积比为0%开始，至60%结束洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为280nm，分离纯化得到苦荞抗氧化肽，即苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3；
S305、利用蛋白质/多肽测序仪对苦荞抗氧化肽的氨基酸测序，利用电喷雾电离源耦合的质谱仪对苦荞抗氧化肽的分子量检测；
所述苦荞抗氧化肽的数量为3个，分别命名为苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3，所述苦荞抗氧化肽P1的氨基酸序列为Gly-Glu-Val-Pro-Trp，分子量为587.0Da；所述苦荞抗氧化肽P2的氨基酸序列为Tyr-Met-Glu-Asn-Phe，分子量为702.8Da；所述苦荞抗氧化肽P3的氨基酸序列为Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，分子量为741.8Da。
2.根据权利要求1所述的一种制备苦荞抗氧化肽的方法，其特征在于，S302-S304中所述抗氧化活性的测定方法为羟基自由基清除活性测定。
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