CN110240630B - 一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽 - Google Patents

一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽 Download PDF

Info

Publication number
CN110240630B
CN110240630B CN201910604780.3A CN201910604780A CN110240630B CN 110240630 B CN110240630 B CN 110240630B CN 201910604780 A CN201910604780 A CN 201910604780A CN 110240630 B CN110240630 B CN 110240630B
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligopeptide
moringa seed
moringa
amino acid
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910604780.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110240630A (zh
Inventor
孙坤来
梁丽丽
王斌
陈荫
赵玉勤
蔡诗颖
初雪梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changsheng Wuji Beijing Biological Science Research Institute Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Ocean University ZJOU filed Critical Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority to CN201910604780.3A priority Critical patent/CN110240630B/zh
Publication of CN110240630A publication Critical patent/CN110240630A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110240630B publication Critical patent/CN110240630B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C07K5/06069—Ser-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

本发明提供一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽，属于辣木籽深加工领域，该寡肽分离自辣木籽蛋白水解物，氨基酸序列为Ser‑Phe，分子量为252.17Da。该寡肽的制备方法包括辣木籽蛋白质的提取，用风味蛋白酶对辣木籽蛋白水解，超滤，阴离子交换色谱法，凝胶过滤层析，反相高效液相色谱法，氨基酸序列及其分子质量的测定。还公开了该寡肽在研究治疗糖尿病、心脏病药物中的用途。本发明提供的寡肽具有较高的肝细胞氧化损伤保护作用，提供的制备方法获得目的肽的得率较高。

Description

一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽
技术领域
本发明属于辣木籽深加工领域，具体涉及一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽。
背景技术
活性氧(ROS)包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧和过氧化氢，是人类细胞正常代谢的副产物，在细胞信号转导和增殖中发挥重要作用。过量的ROS会导致氧化和抗氧化作用失衡，超过细胞在体内的有效抗氧化反应能力时，会在体内引发氧化应激反应。氧化应激可引起蛋白质交联、脂质过氧化、DNA和RNA损伤等氧化损伤，进而导致糖尿病、心血管疾病、类风湿关节炎、癌症、帕金森病等一系列疾病。为了减少或抑制自由基的产生，常见的人工抗氧化剂叔丁基对苯二酚、二叔丁基对甲酚和丁茴香醚已经广泛应用于食品保鲜，但其肝损伤和致癌性的缺陷对人类健康造成潜在的巨大的威胁，从而限制了他们的使用范围和用量。因此，寻找天然、高效、无毒的抗氧化剂作为合成抗氧化剂的替代品，一直是人们的主要兴趣。近年来，抗氧化肽因其来源广泛、抗氧化活性强而受到广泛关注。辣木属辣木科多年生木本植物，原产于热带或南亚热带干旱或半干旱地区。一系列研究发现，辣木叶、种子和根的提取物对人类有很多好处，如抗糖尿病和保护肝脏，抗尿石性能，以及改善肝纤维化。我们之前的研究表明，FM3(辣木籽蛋白水解物的分子量小于3.5kDa)能有效地清除DPPH·(EC50 4.0mg/mL)，HO·(EC50 4.2mg/mL)，O2-·(EC50 4.3mg/mL)和ABTS·+(EC505.3mg/mL)。
现有技术如授权公告号为CN 103275180 B的中国发明专利，公开了一种马面鲀鱼蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途，该抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr(LSHGPY)，ESI-MS定分子量为672Da。该发明制备工艺科学合理，酶解过程易监控，制得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽，该寡肽分子量小，容易穿过屏障，靠近缺电子基团，肽序列中的芳香族氨基酸残基Phe的芳环可以促进对氧化金属离子的螯合作用，抗氧化活性强；能够掩盖Akt磷酸化位点Ser473，抑制Akt的活性，激活FOXO3a的转录活性，从而促进谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px和超氧化物歧化酶SOD的表达。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种辣木籽寡肽，其氨基酸序列为Ser-Phe，分子量为252.17Da。肽的抗氧化活性与其氨基酸的组成及排列顺序、疏水性、空间体积大小及酸碱性等有关。辣木籽蛋白含有较丰富的具有供质子或供电子能力的氨基酸，包括Tyr、Met、Cys，较丰富的疏水性氨基酸包括Leu、Pro、Phe、Val以及丰富的酸性氨基酸Glu。因此，对辣木籽蛋白进行水解可以制备得到具有强抗氧化活性的辣木籽肽。一般来说，低分子量、疏水性和芳香氨基酸的多肽具有较高的抗氧化活性。含2-10个氨基酸的短肽具有较强的自由基清除活性，能有效抑制脂质过氧化，可以穿过膜屏蔽并在组织水平上发挥多种生物活性，分子质量越小越容易穿过屏障，靠近缺电子基团，增强肽的活性；较大分子质量的多肽与自由基反应时存在空间位阻，导致多肽的抗氧化活性下降。肽序列中芳香族氨基酸残基Phe的芳环可以促进对氧化金属离子的螯合作用，对该寡肽的抗氧化活性的贡献较大。
作为优选，辣木籽寡肽具有肝细胞氧化损伤保护作用。
作为优选，辣木籽寡肽能够提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。细胞受到氧化损伤时，细胞内的活性氧会大量增加，过量的活性氧(ROS)会引发体内氧化应激反应，造成蛋白质交联、脂肪氧化、DNA和RNA损坏等，在生物体中，有酶和非酶的抗氧化系统来保护自己免受活性氧损伤。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是人体天然的抗氧化酶，可将氧自由基最终转化为水进入人体，本发明提供的天然寡肽通过提高抗氧化酶的活性促进将氧自由基转化为水，对细胞氧化损伤进行保护。
作为优选，辣木籽寡肽对DPPH自由基的半数有效浓度为0.79mg/mL，对ABTS自由基的半数有效浓度为0.32mg/mL。DPPH自由基是一种很稳定的自由基，用于评估抗氧化物捕捉自由基的能力，本发明提供的寡肽对DPPH自由基的半数有效浓度较低，有着较强的捕捉自由基的能力，抗氧化活性强。而ABTS自由基在水及醇溶剂中具有良好的溶解性，用于评价水溶性及脂溶性天然产物的抗氧化活性，主要是测定抗氧化剂保持氧化还原状态的能力，本发明提供的寡肽对ABTS自由基的半数有效浓度较低，保持氧化还原状态的能力强，有较高的抗氧化活性。
本发明还提供一种上述辣木籽寡肽的制备方法，该方法能够减弱氨肽酶对由C端疏水性氨基酸形成的肽键的水解活性和/或羧肽酶对由芳香族形成的羧基末端的水解活性，增加氨基酸序列为Ser-Phe的寡肽的收率。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
具有肝细胞氧化损伤保护作用的寡肽的制备方法，包括以下步骤：
a、辣木籽蛋白质的提取；
b、辣木籽蛋白水解；
c、超滤；
d、阴离子交换色谱法；
e、凝胶过滤层析；
f、反相高效液相色谱法；
g、氨基酸序列及其分子质量的测定；
其中，辣木籽蛋白水解采用风味蛋白酶进行酶解。目前抗氧化肽的提取主要有酶解法和发酵法，酶促反应具有高效性和安全性，蛋白质经过酶解后都可得到抗氧化肽，风味蛋白酶对辣木籽蛋白的水解度较高，能够获得分子量较小，抗氧化活性强的短肽；酶解过程中产生了大量相对分子质量相近的肽段，且酶解物系蛋白质、肽和氨基酸的混合体系，本发明提供的寡肽分子量较小，单一的分离方法不能满足分离纯化的要求，因此，本发明对蛋白水解物超滤后，再通过阴离子交换色谱法、凝胶过滤层析、反相高效液相色谱法，得到11个二、三肽，对11个小肽进行分析后，得到目标寡肽。
作为优选，上述辣木籽蛋白质的提取步骤包括：首先将粉碎的辣木籽与乙酸乙酯混合2-3天；自然干燥后，与pH在87-8.9，浓度为1.5mol/L Tris-HCL按质量体积比为1:37-39的比例在41-43℃下混合，90-110min后离心取上清；加入4.2-4.3mol/L硫酸铵，24-26℃下沉淀蛋白质，蛋白质析出后用透析袋透析脱盐。辣木籽富含油脂，通常与蛋白质构成复合体，因此对辣木籽蛋白进行脱脂处理，释放其中的油脂，所得蛋白质品质高，本发操作简单，反应条件温和，提取率高，不会使蛋白质发生不可逆的变性，从而避免蛋白质溶解度的降低及酶解后的生物活性肽失活。
更为优选，辣木籽与乙酸乙酯的质量体积比为1:5.5-6.5(g/mL)。
作为优选，上述风味蛋白酶用葡萄糖乙酸酯进行修饰。风味蛋白酶包含了内切肽酶与外切肽酶两种活性，因此对蛋白质有较高的水解活性。内切酶作用肽链内的肽键，其产物为胨、高肽、低肽；外切酶则从肽链的氨基或羧基一端开始，作用后的产物为单个氨基酸。风味蛋白酶中的外切肽酶为从肽链的N端水解多肽的氨肽酶和/或从C端水解多肽的羧肽酶，羧肽酶A是水解由芳香族和中性脂肪族氨基酸形成的羧基末端，如酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。氨肽酶对疏水性氨基酸有极强的专一性，不仅肽键的N端氨基酸的疏水性会增加氨肽酶的作用效果而且肽键的C端氨基酸的疏水性也会增加氨肽酶的作用效果。本发明提供的天然寡肽的氨基酸序列为Ser-Phe，Phe为芳香族氨基酸和疏水性氨基酸，与Ser形成的肽键容易外切肽酶被水解，用葡萄糖乙酸酯对风味蛋白酶进行处理，葡萄糖乙酸酯能够与组氨酸残基上的咪唑环结合，并且能与氨基形成酰胺键，使氨肽酶和/或羧肽酶的侧链基团发生改变，从而改变了氨肽酶和/或羧肽酶的特性，减弱了氨肽酶对由羧基端疏水性氨基酸形成的肽键的水解活性和/或羧肽酶对由芳香族形成的羧基末端的水解活性，增加氨基酸序列为Ser-Phe的寡肽的收率。更为优选，风味蛋白酶用葡萄糖乙酸酯进行修饰的方法为：将含有风味蛋白酶的磷酸盐缓冲液中加入葡萄糖乙酸酯溶液，充分混合后，室温下放置18-24h，透析处理去除溶剂，冻干。进一步优选，修饰方法为：取22-24mg风味蛋白酶在3-5mLpH6-8的磷酸盐缓冲液中溶解，加入3-4mL 30-40mmol/L葡萄糖乙酸酯溶液，充分混合后，室温下放置18-24h，透析处理去除溶剂，冻干。
作为优选，上述步骤b至步骤f所得物质进行冻干处理。多肽稳定性较差，多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相，另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。
本发明还提供上述辣木籽寡肽在制备用于预防和/或治疗糖尿病和/或心脏病药物中的用途。当细胞受到氧化损伤时，细胞内的活性氧会大量增加，过量的活性氧超过细胞有效的抗氧化应答能力时，会导致体内氧化与抗氧化作用失衡从而引发体内氧化应激反应，造成蛋白质交联、脂肪氧化、DNA和RNA损坏等，从而引发一系列疾病，如心脏病，糖尿病。因此，本发明提供的天然来源的具有细胞氧化损伤保护作用的寡肽安全无毒副作用，对研究治疗心脏病、糖尿病的药物具有重要意义。
本发明的有益效果为：
1)本发明通过对辣木籽蛋白水解物进行分离纯化得到氨基酸序列为Ser-Phe，分子量为252.17Da的天然寡肽，该寡肽能够提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，降低氧化应激细胞内丙二醛的含量，对细胞氧化损伤具有保护作用；
2)本发明通过对天然寡肽进行修饰，增加寡肽和稳定性和生物活性，掩盖Akt磷酸化位点Ser473掩盖住，抑制Akt的活性，促进细胞谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px，超氧化物歧化酶SOD的表达；
3)本发明通过对风味蛋白酶进行修饰，改变了风味蛋白酶中氨肽酶和/或羧肽酶的特性，减弱了氨肽酶对由C端疏水性氨基酸形成的肽键的水解活性和/或羧肽酶对由芳香族形成的羧基末端的水解活性，增加氨基酸序列为Ser-Phe的寡肽的收率。
附图说明
图1为本发明实施例1的反高效液相色谱示意图；
图2为本发明的试验例1的示意图；
图3为本发明的试验例2的示意图。
具体实施方式
除非另外说明，本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以整体援引的方式并入本文中，如同将其全文进行阐述。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在相抵触的情况下，则以本说明书中的定义为准。
当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或其他数值或参数时，应理解其具体公开了由任何较大的范围限制或优选值和任何较小的范围限制或优选值的任何一对数值所形成的所有范围，而无论这些范围是否分别被公开。例如，当描述“1至5”的范围时，所描述的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
除非另有说明，在本文描述数值范围之处，所述的范围意图包括范围端值和范围内的所有整数和分数。
另外，在本发明的要素或组分之前的词语“一”和“一种”意图表示对于该要素或组分的出现(即发生)次数没有限制性。因此，“一”或“一种”应理解为包括一种或至少一种，除非明确表示数量为单数，否则单数形式的所述要素或组分也包括复数的情况。
本发明的实施方案，包括在发明内容部分中所述本发明的实施方案以及本文下述的任何其他的实施方案，均可任意地进行组合。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽的制备方法，包括：
1)辣木籽蛋白水解物的制备：首先将粉碎的辣木籽与乙酸乙酯按质量体积比为1:6的比例混合2天；将辣木籽在空气中自然干燥，将干燥后的辣木籽与pH8.8，1.5mol/L的Tris-HCL按质量体积比为1:38的比例在42℃下混合，100min后离心，取上清；在上清液中加入4.25mol/L硫酸铵，25℃下沉淀蛋白质，析出的辣木籽蛋白质用透析袋透析脱盐，然后冻干；制备质量体积比为5％的辣木籽蛋白悬浮液，取100mL蛋白悬浮液，然后调节pH至6.7，加入修饰后的风味蛋白酶，总加酶量为5％，50℃下酶解300min。
2)分离纯化：
超滤：对酶解后的产物采用截留分子量3.5kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量<3.5kDa的超滤酶解物FM3，。
阴离子交换色谱法：取5mL 60mg/L的FM3溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤后，上样到阴离子交换色谱柱QFF(1.6×80cm)上分离纯化，分别用0.1M NaCl Tris-HCl缓冲液、0.25M NaCl Tris-HCl缓冲液、0.5M NaCl Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为2.0mL/min，收集器每个试管收集的馏出体积为6mL，检测波长为280nm，最后在色谱峰上收集到F-I，F-II，F-III三个组分，进行冻干处理。
凝胶过滤层析：取1mL 5mg/mL的F-I溶液，上样到Sephadex G15柱(3.6×150cm)上分离纯化，用超纯水洗脱，流速为0.6mL/min，收集器每个试管收集的馏出体积为1.8mL，检测波长为280nm，最后在色谱峰上收集到F-I-I，F-I-II，F-I-III三个组分，进行冻干处理。
反相高效液相色谱法：取10μL 1mg/mL的F-I-I溶液，上样到4.6×250mm Zorbax300SB-C18柱上分离纯化，流动相为A相-B相，A相为含0.05-0.07％三氟乙酸的超纯水，B相为含0.04-0.06％三氟乙酸的甲醇，洗脱程序为：在0-2min内采用的流动相中B的体积百分比为0-2％；在2-4min内采用的流动相中B的体积百分比为2-30％；在4-27min内采用的流动相中B的体积百分比为30-60％，在27-30min内采用的流动相中B的体积百分比为60-100％，30-35min内采用的流动相中B的体积百分比为95％，流速为1mL/min，检测波长为280nm。反相高效液相色谱结果见图1，最后在色谱峰上收集到11个组分(LM1-LM11)，进行冻干处理，称重，测定各个组分。
氨基酸序列及其分子质量的测定：采用494蛋白质序列测序系统测定LM1至LM11的N端氨基酸序列，埃德曼降解按照测序系统提供的标准程序性进行。采用电喷雾串联质谱法(ESI-Q-TOF)对LM1-LM11的分子量进行精确测定，电离是在毛细管电压为3500V的阳性模式下进行的。氮气在雾化过程中保持在40强度，在350℃下的蒸发过程中保持9L/min。以质心控制模式分析质子数/电荷数的比值。测得LM9组分的基酸序列为Ser-Phe的寡肽，并测得其分子量为252.17Da。序列为Ser-Phe的寡肽的得率计算公式为：
得率(％)＝目标产物冻干粉的质量(g)/蛋白质冻干粉的质量(g)
测得目标寡肽的得率为1.72％。
实施例2：
风味蛋白酶使用前进行修饰，选用的风味蛋白酶的外切肽酶包括氨肽酶和羧肽酶，取23mg风味蛋白酶在4.5mL pH7.5的磷酸盐缓冲液中溶解，加入3mL35mmol/L葡萄糖乙酸酯溶液，充分混合后，室温下放置22h，透析处理去除溶剂，冻干。
其余部分和实施例1完全一致。测得序列为Ser-Phe的寡肽的得率为2.03％。
实施例2中目标寡肽的得率高于实施例1，这说明，对风味蛋白酶进行修饰后，改变了氨肽酶和羧肽酶的特性，减弱了氨肽酶对由羧基端疏水性氨基酸形成的肽键的水解活性和羧肽酶对由芳香族形成的羧基末端的水解活性，增加氨基酸序列为Ser-Phe的寡肽的得率。
实施例3：
为了进一步提高辣木籽寡肽对肝细胞氧化损伤的保护作用，本实施例还采取如下措施：
将实施例1所得辣木籽寡肽用柠檬酸锶进行修饰。FOXO3a被激活后可诱导下游靶基因表达，FOXO3a的靶基因包括抗氧化基因、细胞凋亡和细胞周期阻滞基因等。PI3K-Ak/PKB信号通路通过调节FOXO3a的活性来增加过氧化物酶的表达，过氧化物酶比过氧化氢酶有更高的亲和性，在低水平的过氧化氢时也能产生同样的效果。Akt/PKB由N末端的调节区、中间酶活性区、C末端的调节区和连接PH区与激酶活性区的铰链区四部分组成，C末端有一个富含脯氨酸的疏水结构域(HM)，其中含有Akt完全活化所必需的第二个磷酸化位点Ser473，用柠檬酸锶对寡肽Ser-Phe进行处理，柠檬酸锶上的羧基可与Ser的侧链的脂肪族羟基反应，连接在寡肽上，可以增加寡肽和稳定性和生物活性，同时柠檬酸锶上的羟基可对Akt疏水结构域HM中脯氨酸侧链上四氢吡咯酸的环形结构进行修饰，从而与脯氨酸相连，在疏水结构域形成交错的网状结构，将Akt磷酸化位点Ser473掩盖住，不利于PDK2对Akt的Ser473位点的磷酸化，从而抑制Akt的活性，此时，Akt对FOXO3a的磷酸化减少，激活FOXO3a的转录活性，促进细胞中谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px，超氧化物歧化酶SOD的表达，进一步提高寡肽Ser-Phe的抗氧化能力。具体修饰方法包括：按体积比1:3-4的比例，取3-4mg/mL柠檬酸锶和2-3mg/mL寡肽混合放入试管中，调节pH至7-8，反应体系总体积为10-15mL，将试管置于60-70℃下20-30min后，冰浴冷却，用截留分子量为300Da的超滤膜处理，收集滤液，冻干。
本实施例的修饰方法为：按体积比1:3的比例，取4mg/mL柠檬酸锶和3mg/mL实施例1得到的目标寡肽混合放入试管中，调节pH至7.8，反应体系总体积为10mL，将试管置于65℃下25min后，冰浴冷却，用截留分子量为300Da的超滤膜处理，收集滤液，冻干。
试验例1：
细胞内GSH-Px、SOD、CAT和MDA水平的测定：
将细胞按照3.5×105个细胞/孔接种到6孔板中，并在1.6mL培养基中孵育24h。将实施例1所得的寡肽制成500μmol/L的样本溶液，在样本组中加入200μL样本溶液培养3h。在模型组和对照组中，用PBS代替200μL样本溶液。3h后，将200μL终浓度为300μmol/L的H2O2分别加入模型组，样本组和阳性对照组中，并温育2h。将200μL RPMI-1640培养基代替H2O2加入对照组。然后，除去培养基，用PBS洗涤细胞，重复三次。最后根据GSH-Px、SOD、CAT和MDA检测试剂盒的说明测量GSH-Px、SOD、CAT和MDA的水平。对GSH-Px、SOD、CAT和MDA的水平的测定结果见图2。
试验例2：
对过氧化氢诱导的肝细胞氧化损伤保护能力的测定：
将长肝细胞按每孔1.2×104个细胞，接种到96孔板中，在160μL培养基中孵育24h；将20μL 500μM寡肽溶液加入样品组，培养3h，而在模型组和对照组中各加入20μL PBS溶液；3h后，将20μL终浓度为300μM的H2O2分别加入模型组和样品组中，孵育2h，将20μL RPMI-1640培养基代替H2O2加入对照组中；用MTT法测量细胞活力。用倒置显微镜对细胞进行形态观察。细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率(％)＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100％
式中As、Ac、Ab分别为样本组、模型组、对照组的吸光度。细胞存活率测定结果见图3。
由图2可以看出，实施例3中的GSH-Px活力和SOD活力均明显高于实施例1，且MDA的含量明显低于对比例，这说明：用柠檬酸锶对目标寡肽修饰后，抑制了Akt的活性，激活了FOXO3a的转录活性，促进细胞中谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px，超氧化物歧化酶SOD的表达，提高了寡肽的抗氧化能力。
由图3可以看出，实施例1和实施例3与模型组相比，细胞存活率明显提高，这说明从辣木籽蛋白水解物获得的目标寡肽对氧化损伤的长肝细胞有明显的保护作用，实施例3的细胞存活率高于实施例1，这说明，修饰后的寡肽抗氧化能力增强，提高了对细胞氧化损伤的保护作用。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (2)

1.一种辣木籽寡肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、辣木籽蛋白质的提取；
b、辣木籽蛋白水解；
c、超滤；
d、阴离子交换色谱法；
e、凝胶过滤层析；
f、反相高效液相色谱法；
g、氨基酸序列及其分子质量的测定；
所述辣木籽寡肽的氨基酸序列为Ser-Phe，分子量为252.17Da；
所述步骤b采用风味蛋白酶进行酶解；
所述步骤a具体包括：首先将粉碎的辣木籽与乙酸乙酯混合2-3天；自然干燥后，与pH在87-8.9、浓度为1.5mol/L Tris-HCL按质量体积比为1:37-39的比例在41-43℃下混合，90-110min后离心取上清；加入4.2-4.3mol/L硫酸铵，24-26℃下沉淀蛋白质，蛋白质析出后用透析袋透析脱盐；
所述辣木籽与乙酸乙酯的质量体积比为1:5.5-6.5(g/mL)；
所述风味蛋白酶用葡萄糖乙酸酯进行修饰；
所述风味蛋白酶用葡萄糖乙酸酯进行修饰的方法为：将含有风味蛋白酶的磷酸盐缓冲液中加入葡萄糖乙酸酯溶液，充分混合后，室温下放置18-24h，透析处理去除溶剂，冻干；
所述辣木籽寡肽的制备方法还包括对得到的辣木籽寡肽用柠檬酸锶进行处理，具体方法包括：按体积比1:3-4的比例，取3-4mg/mL柠檬酸锶和2-3mg/mL寡肽混合放入试管中，调节pH至7-8，反应体系总体积为10-15mL，将试管置于60-70℃下20-30min后，冰浴冷却，用截留分子量为300Da的超滤膜处理，收集滤液，冻干。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤b至步骤f所得物质均进行冻干处理。
CN201910604780.3A 2019-07-05 2019-07-05 一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽 Active CN110240630B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910604780.3A CN110240630B (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910604780.3A CN110240630B (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110240630A CN110240630A (zh) 2019-09-17
CN110240630B true CN110240630B (zh) 2021-08-10

Family

ID=67891157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910604780.3A Active CN110240630B (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110240630B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112675084B (zh) * 2020-12-23 2022-11-25 昆明颜臻青生物科技有限公司 一种促胶原蛋白分泌的辣木提取液及其用途
CN114478692B (zh) * 2021-12-24 2023-03-21 华南农业大学 一种高抗氧化活性富硒肽及其应用
CN114591402B (zh) * 2022-04-06 2023-12-22 云南农业大学 一种辣木抗氧化肽及其制备方法和应用
CN114835774B (zh) * 2022-06-29 2022-09-27 中国农业大学 辣椒籽分离的寡肽msl及其在预防或治疗癌症中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104418729A (zh) * 2013-08-26 2015-03-18 刘瑞宁 一种可溶柠檬酸盐的制备方法
CN109486889A (zh) * 2018-12-29 2019-03-19 武汉天天好生物制品有限公司 一种辣木籽小分子多肽及其制备工艺

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2266584T3 (pl) * 2003-05-07 2013-02-28 Osteologix As Kompozycja ze strontem i witaminą D do profilaktyki i/lub leczenia chorób chrząstki i/lub kości
US20070292529A1 (en) * 2006-06-19 2007-12-20 Tabbiner Philip S Strontium compositions and methods of treating osteoporotic conditions

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104418729A (zh) * 2013-08-26 2015-03-18 刘瑞宁 一种可溶柠檬酸盐的制备方法
CN109486889A (zh) * 2018-12-29 2019-03-19 武汉天天好生物制品有限公司 一种辣木籽小分子多肽及其制备工艺

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Alice B. Nongonierma等.Inhibition of dipeptidyl peptidase IV and xanthine oxidase by amino acids and dipeptides.《Food Chemistry》.2013, *
Lili Liang等.Nutritional compositions of Indian Moringa oleifera seed and antioxidant activity of its polypeptides.《Food Sci Nutr.》.2019, *
Li-li Liang等.Purification of antioxidant peptides of Moringa oleifera seeds and their protective effects on H2O2 oxidative damaged Chang liver cells.《Journal of Functional Foods》.2019, *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110240630A (zh) 2019-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110240630B (zh) 一种具有肝细胞氧化损伤保护作用的天然寡肽
Yu et al. Purification and identification of antioxidant peptides from enzymatic hydrolysate of Spirulina platensis
Jiang et al. Contribution of specific amino acid and secondary structure to the antioxidant property of corn gluten proteins
CN108998488B (zh) 一种活性蜂王浆oco多肽冻干粉及其制备方法
Xia et al. Optimization and identification of antioxidant peptide from underutilized Dunaliella salina protein: Extraction, in vitro gastrointestinal digestion, and fractionation
KR101147847B1 (ko) 패류 유래 기능성 펩티드의 분리 정제 방법 및 기능성 펩티드의 용도
KR20090024891A (ko) 트랜스 글루타민나제를 이용한 기능성 굴 효소 가수분해물및 그의 제조방법
KR20070073873A (ko) 플루케네티아 볼루빌리스 속에 속하는 식물의 추출물 및그의 미용 용도
Jeampakdee et al. The apoptotic and free radical–scavenging abilities of the protein hydrolysate obtained from chicken feather meal
CN109336953B (zh) 一种苦荞抗氧化肽及其制备方法和应用
Ni et al. Isolation and identification of an Angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptide from yeast (Saccharomyces cerevisiae)
KR101314899B1 (ko) 콜라겐 또는 히알루론산 생성을 증가시키는 펩티드
CN111518164A (zh) Ace抑制肽p2、其应用及其制备方法
CN112245342B (zh) 一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用
KR101751718B1 (ko) 항주름 효능을 가지는 저분자 말태반 효소가수분해물의 제조방법
CN101092448A (zh) 人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法
CN110283230B (zh) 一种抗氧化肽及其应用
Xiao et al. Nutritional evaluation, characterization and antioxidant activity of Radix Isatidis protein hydrolysates under simulated gastrointestinal digestion
CN104758925A (zh) 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的铁螯合用途
KR20160074796A (ko) 곤충 엔-글라이칸 및 이의 용도
JP2007297324A (ja) ペプチド及びその製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤
CN110218717B (zh) 一种灵芝多糖的制备方法及其对超氧化物歧化酶干燥失活的保护作用
CN110256528A (zh) 一种能够显著清除活性氧（ros）的天然寡肽
KR100580332B1 (ko) 민태 껍질로부터 유래한 항산화 펩티드를 유효성분으로함유하는 항산화제 조성물
KR100787949B1 (ko) 대두 발효 조성물의 제조방법 및 이 조성물로부터 유래된펩타이드

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221102

Address after: 710000 No. B49, Xinda Zhongchuang space, 26th Street, block C, No. 2 Trading Plaza, South China City, international port district, Xi'an, Shaanxi Province

Patentee after: Xi'an Huaqi Zhongxin Technology Development Co.,Ltd.

Address before: 316100 plot C2-10, Xiaohui Industrial Zone, Putuo exhibition, Putuo marine science and Technology Industrial Park, Putuo District, Zhoushan City, Zhejiang Province

Patentee before: Zhejiang Ocean University

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230419

Address after: No. 1219, Building 1, No. 7 Shixing Street, Shijingshan District, Beijing, 100000

Patentee after: Changsheng Wuji (Beijing) Biological Science Research Institute Co.,Ltd.

Address before: 710000 No. B49, Xinda Zhongchuang space, 26th Street, block C, No. 2 Trading Plaza, South China City, international port district, Xi'an, Shaanxi Province

Patentee before: Xi'an Huaqi Zhongxin Technology Development Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right