CN111518164A - Ace抑制肽p2、其应用及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ACE抑制肽P2其氨基酸序列为：WFRDGQELR，本发明还公开了ACE抑制肽P2在辅助降血压药物或辅助降血压功能食品中的应用，以及ACE抑制肽P2的制备方法。本发明得到的ACE抑制肽P2从河鲀鱼皮中提取得到，与ACE酶的结合能力强、活性高，可以有效地用于降血压药物或功能食品中，以辅助降血压，具有特异性高、毒副作用小的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种ACE抑制肽P2。本发明还涉及了此ACE抑制肽P2的应用及其制备方法。
背景技术
人体的血压调节主要是受到血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)和激肽系统(kallikrein kinin system，KKS)控制，而血管紧张素转化酶(Angiotensinconverting enzyme，ACE)在这两个系统中起着关键作用。ACE是一种羧基二肽酶，广泛分布于哺乳动物的组织中，主要以膜结合胞外酶的形式存在于血管上皮细胞。在RAS系统中，ACE能够使没有生理活性的血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)转化为具有升压活性的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)。在KKS系统中，ACE可将血管舒缓激肽降解为失活片段，导致血管收缩，引起血压升高。目前高血压的药物治疗主要是对ACE进行抑制,相关研究表明一些从动物、植物以及乳制品中分离得到的天然生物活性肽具有抑制ACE活性、降低血压的作用。相比传统降压药物这些天然活性肽具有特异性高、毒副作用小、疗效好、可用药剂量更大等优点。
对酶解制备ACE抑制肽的研究，有以牛奶、乳酪、大豆、蔬菜、小麦等食物性蛋白为原料，经蛋白酶酶解产生能较好抑制ACE活性的抑制肽制备方法。EIJI etal(Angiotensinconverting enzy me inhibitory activity of the short chain peptides derivedfrom various food pro-teins[J].Nippon Shkuhin Kagaku KogakuKaishi,1996,43(7):
839-840.)水解了12种食物蛋白后发现，从鱼、虾和蟹等水产动物蛋白中酶解制得的ACE抑制肽，其降压活性优于其他食物性蛋白。
ACE抑制肽在母体蛋白中没有活性，但能通过酶水解方法从母体蛋白中释放出。由于ACE抑制肽氨基酸组成和结构差别很大，没有固定或统一氨基酸组成，且食物中蛋白酶解产物成分相当复杂，这样就大大增加对其分离提取难度。
ACE抑制肽活性检测方法主要有体内检测和体外实验二种。体外检测一般使用IC50表示ACE抑制剂抑制活性，抑制物IC50越小，其活性越高。
孙美玲等在文章《海参水煮液中ACE抑制肽的分离纯化》(《大连工业大学学报》2019年1月)中采用大孔树吸附的方法对海参水煮液酶解物多肽进行分离，并应用p18反相硅胶柱和LH-20葡聚糖凝胶柱对活性最高的组分进行ACE抑制肽分离纯化,得到2种多肽单体,ACE抑制活性的IC50分别为0.74和1.77mg/mL。
公开号为CN108129561A的专利中公开了一种ACE抑制肽，将大黄鱼肌动蛋白进行虚拟酶切，得到一定量的肽序列，筛选其中未被报道的三肽序列进行毒性、水溶性和ADMET性质的预测，并利用Discoverystudio软件进行分子对接，最终筛选得到三肽His-Glu-Arg(HER)。利用RP-HPLC法进行三肽HER体外ACE抑制活性的鉴定。结果显示HER具有良好ACE抑制活性，IC50值为1.82±0.06mM。
河鲀为硬骨鱼纲鲀科鱼类的统称，随着河鲀鱼加工利用市场的开放及发展，大量河鲀鱼加工利用后的副产物(如鱼皮、鱼头、鱼内脏等)则作为废弃物丢弃或者加工成动物饲料，不仅将会给将会给环境带来巨大的压力，给社会带来负面效应也是对鱼皮资源极大的浪费。因此，充分利用河鲀鱼中的营养成分，开发高附加值的各类产品，将会对整个河鲀鱼市场带来新的良性发展。有研究表明鱼皮的蛋白质较于肌肉高，鱼皮中的胶原含量最高可占其蛋白质总量的80％多，且鱼皮的蛋白质除了主要为纤维状的胶原外，还含有少量白蛋白、粘性蛋白、球蛋白、粘蛋白。目前尚未见从河鲀中提取ACE抑制肽的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从河鲀鱼皮中提取得到的ACE抑制肽P2，与ACE酶的结合能力强、活性高，可以应用于辅助降血压药物或功能食品中。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明公开了ACE抑制肽P2，其氨基酸序列为：WFRDGQELR。
进一步地，其分子量为1206.32Da，IC50为0.71μM。
本发明公开了上述ACE抑制肽P2在辅助降血压药物或辅助降血压功能食品中的应用。
本发明还公开了ACE抑制肽P2的制备方法，包括如下步骤：
S1.取河鲀鱼皮，加入蛋白酶进行酶解，酶解温度控制为50℃～60℃，酶底比为2％～4％，pH为11～12，酶解时间为5h～7h。
S2.对酶解产物进行初步过滤，去除残渣得到澄清的多肽酶解液。
S3.选择聚醚砜超滤膜对多肽酶解液进行超滤分离，将胶原酶解多肽分为若干超滤组分，冻干不同分子量分布的多肽液，得到多肽冻干粉。
S4.称取适量的不同分子量的多肽冻干粉，分别配制成多肽溶液，测定其对ACE抑制率的大小，筛选得到对ACE抑制活性最强的多肽冻干粉。
S5.将筛选得到的多肽冻干粉采用LC-MS/MS进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得若干多肽序列。
S6.通过软件将多肽序列与ACE蛋白进行分子对接，在对接之前通过能量最小化将多肽的2D结构转换为3D结构，筛选得到与ACE蛋白的结合能力强的多肽序列。
S7.将筛选得到的多肽序列进行固相合成，筛选活性高的多肽序列，即得到ACE抑制肽P2。
其中，步骤S1中酶解温度为55℃，酶底比为2％，pH为12，酶解时间为6h。
优选地，步骤S3中选择截留量为1kDa和5kDa的聚醚砜超滤膜对多肽酶解液进行超滤分离，将胶原酶解多肽分为Mw<1kDa，1kDa<Mw<5kDa和Mw>5kDa的三个超滤组分，冻干以上三个不同分子量分布的多肽液，得到多肽冻干粉。
优选地，步骤S5中质谱测定条件为：色谱柱为PepMap RPLC C18，阳离子模式，扫描范围：m/z 300–1500Da，发射极喷雾电压2kV。
本发明具有如下有益效果：本发明方法制备得到的ACE抑制肽P2与ACE酶的亲和力好，活性较高，IC50值为0.71μM，可应用于开发辅助降血压的治疗药物或功能食品中。且由于本发明ACE抑制肽P2是从河鲀鱼皮中提取得到，相比传统降压药物具有特异性高、毒副作用小的优点。
附图说明
图1为不同酶解温度对ACE抑制率的影响。
图2为不同酶解时间对ACE抑制率的影响。
图3为不同酶底比对ACE抑制率的影响。
图4为不同pH对ACE抑制率的影响。
图5为不同分子量大小的多肽组分对ACE抑制率的影响。
图6为不同分子量大小的多肽组分的IC50值。
图7为本发明多肽WFRDGQELR的液相色谱图。
图8为本发明多肽WFRDGQELR的质谱图。
图9为WFRDGQELR与ACE的结合模式示意图。
图10为图9的局部放大示意图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
本发明公开了一种ACE抑制肽P2，其氨基酸序列为：WFRDGQELR。
ACE抑制肽P2的制备方法，包括如下步骤：
S1.取河鲀鱼皮，加入蛋白酶进行酶解，酶解温度控制为50℃～60℃，酶底比为2％～4％，pH为11～12，酶解时间为5h～7h。优选为：酶解温度为55℃，酶底比为2％，pH为12，酶解时间为6h。
本发明以ACE抑制率为考核指标，根据选用的蛋白酶在不同的酶解时间、酶解温度、pH和酶添加量的条件下进行试验，考察各因素对ACE抑制率的影响。具体实验结果如下详述。
(1)不同酶解温度对ACE抑制率活性的影响
如图1所示，随着酶解温度的提高，胶原酶解产物对ACE抑制活性呈现先增加后下降的趋势，当温度达到65℃时，胶原酶解产物对ACE抑制活性急剧下降，可能是由于温度过高使得蛋白酶失活，造成酶活力的下降，导致水解效果下降，从而降低了其对DPPH的清除率。因此，确定55℃为酶解反应最佳温度。
(2)不同酶解时间对ACE抑制率活性的影响
如图2所示，随着酶解时间的增加，胶原酶解产物对ACE抑制活性的影响也是呈现先增加后降低的趋势，酶解时间过长有活性的肽段可能会被持续酶解，从而使得抑制活性下降。因此，最适宜的酶解时间为6h。
(3)不同酶底比对ACE抑制率活性的影响
如图3可知，随着酶浓度的增加，胶原酶解产物对ACE抑制率呈现为先快速增加而后缓慢增加，在酶底比为4％时达到最高，但其抑制率比2％和3％增加不明显。随着进一步增加酶量，ACE抑制率反而下降，当酶被底物饱和的时候，反应达到平衡。综合考虑经济成本及酶解效果，酶底比为2％较佳。
(4)不同pH对ACE抑制率活性的影响
如图4所示，随着pH的升高，胶原酶解产物对ACE抑制活性的影响也是呈现先增加后降低的趋势，这表明pH过高或过低均会抑制蛋白酶的活性，从而使得酶解效率下降，表现为ACE抑制率下降。因此，选择pH＝12为适宜的pH。
S2.对酶解产物进行初步过滤，去除残渣得到澄清的多肽酶解液。初步过滤可以采用八层纱布进行过滤。
S3.选择截留量为1kDa和5kDa的聚醚砜超滤膜对多肽酶解液进行超滤分离，将胶原酶解多肽分为Mw<1kDa，1kDa<Mw<5kDa和Mw>5kDa的三个超滤组分，冻干以上三个不同分子量分布的多肽液，得到多肽冻干粉。
S4.称取适量的不同分子量的多肽冻干粉，分别配制成1mg/mL的多肽溶液，测定其对ACE抑制率的大小，筛选得到对ACE抑制活性最强的多肽冻干粉。
ACE抑制率的测试方法为：将100μL样品多肽溶液与50μL的50mU/mL的ACE(ACE溶于5000μL含有0.3mol/L氯化钠的0.1mol/L硼酸盐缓冲液，pH 8.3)，37℃水浴10min。然后加入150μL5mM HHL(用含0.3mol/L氯化钠，pH值8.3的0.1mol/L硼酸盐缓冲液配制)，37℃水浴30min，结束加入200μL 1.0mol/L HCl终止反应，蒸馏水作为空白样品。在此过程中，ACE酶解HHL释放出马尿酸，马尿酸的浓度可通过高效液相色谱UV检测器228nm处进行检测。其中ACE抑制率公式为：
其中，ACK为空白样品马尿酸的峰面积，AS为酶解产物的马尿酸的峰面积。
由图5、图6的结果可知，Mw<1kDa的抑制率最佳，1kDa<Mw<5kDa的次之，Mw>5kDa对ACE的抑制率最弱。
S5.将筛选得到的Mw<1kDa的组分多肽冻干粉采用LC-MS/MS进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得若干多肽序列。
质谱测定条件为：色谱柱为PepMap RPLC C18，阳离子模式，扫描范围：m/z 300–1500Da，发射极喷雾电压2kV。质谱检测的结果采用PEAKS STUDIO软件分析，获得多肽序列82条。
S6.通过MOE软件将多肽序列与ACE蛋白进行分子对接，在对接之前通过能量最小化将多肽的2D结构转换为3D结构，筛选得到与ACE蛋白的结合能力强的多肽序列。
蛋白质ACE的3D结构可从RCSB蛋白质数据库(PDB ID：1O8A)下载。分子对接的结果如下表1所示，对接分值的数值越小(绝对值越大)表明多肽与ACE酶的结合能力越强，也最越有可能抑制ACE酶的活性。
表1不同多肽序列与ACE酶的分子亲和力大小
S7.将筛选得到的多肽序列进行固相合成，筛选活性高的多肽序列，即得到ACE抑制肽P2。
将表1的多肽序列固相合成，筛选得到活性较高的多肽序列，即上表中的1，氨基酸序列号为WFRDGQELR，即得到本发明ACE抑制肽P2。对ACE抑制肽P2进行液相和质谱的测定，如图7、图8所示，分子量为1206.32Da，IC50值为0.71μM。ACE抑制肽P2可溶解于超纯水、PBS和DMSO，如表2所示。
表2.ACE抑制肽P2的溶解性测试
| 溶剂 | 溶解性 | 多肽浓度 |
| 超纯水 | 可溶 | ≦10mg/ml |
| 1X DPBS*(pH 7.1±0.1) | 可溶 | ≦10mg/ml |
| DMSO | 可溶 | ≦10mg/ml |
将本发明的多肽通过MOE软件与ACE蛋白进行分子对接模拟实验，可得本发明ACE抑制肽P2与ACE的结合方式如图9、图10所示。ACE中E162羧基的氧原子与P2中的Q6酰胺基的氮原子形成一个氢键。ACE中N277的酰胺基的氮原子与P2中R9骨架的氧原子形成一个氢键。ACE中A354骨架的氧原子与P2中G5骨架的碳原子形成一个氢键。ACE中S355的羟基的氧原子与P2中R3的胍基的氮原子形成一个氢键。ACE中C370骨架的氧原子与P2中R9的胍基的氮原子形成一个氢键。ACE中R384的羧基氧原子与P2中D4的羧基氧原子形成一个氢键。ACE中Y523的酚羟基与P2中G5骨架的氧原子形成一个氢键。ACE中E162的羧基氧原子与P2中R9的胍基的氮原子形成盐桥；ACE中D377的羧基氧原子与P9中R9的胍基的氮原子形成盐桥。ACE中的Zn2+与D4的羧基氧原子以及P2的主链G5的氧原子形成离子键。
对接模拟结果表明，ACE中的Glu162，Asn277，Ala354，Ser355，Cys370，Glu384，Asp377各氨基酸残基和Zn2+与P2的氨基酸残基Q6，R9，G5，R3，D4和G5的结合，形成氢键，离子接触及盐桥的相互作用。如下表3所示。
表3.ACE抑制肽P2与ACE活性接触列表
| 链A | 残基 | 链B | 残基 | 相互作用类型 |
| ACE | Glu162 | P2 | Q6 | 氢键相互作用 |
| ACE | Asn277 | P2 | R9 | 氢键相互作用 |
| ACE | Ala354 | P2 | G5 | 氢键相互作用 |
| ACE | Ser355 | P2 | R3 | 氢键相互作用 |
| ACE | Cys370 | P2 | R9 | 氢键相互作用 |
| ACE | Glu384 | P2 | D4 | 氢键相互作用 |
| ACE | Tyr523 | P2 | G5 | 氢键相互作用 |
| ACE | Zn | P2 | D4 | 离子接触 |
| ACE | Zn | P2 | G5 | 离子接触 |
| ACE | Glu162 | P2 | R9 | 盐桥 |
| ACE | Asp377 | P2 | R9 | 盐桥 |
综上，通过本发明方法制备得到的ACE抑制肽P2与ACE酶的相互作用强，活性高，可以应用于辅助降血压药物或辅助降血压功能食品中。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
<120> ACE抑制肽P2、其应用及其制备方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> P2
<211> 9
<212> PRT
<213> 河鲀
<400> 1
Trp Phe Arg Asp Gly Gln Glu Leu Arg
1 5
Claims (7)
1.ACE抑制肽P2，其特征在于，其氨基酸序列为：WFRDGQELR。
2.如权利要求1所述的ACE抑制肽P2，其特征在于，其分子量为1206.32Da，IC50为0.71μM。
3.权利要求1所述的ACE抑制肽P2在辅助降血压药物或辅助降血压功能食品中的应用。
4.权利要求1所述的ACE抑制肽P2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.取河鲀鱼皮，加入蛋白酶进行酶解，酶解温度控制为50℃～60℃，酶底比为2％～4％，pH为11～12，酶解时间为5h～7h；
S2.对酶解产物进行初步过滤，去除残渣得到澄清的多肽酶解液；
S3.选择聚醚砜超滤膜对多肽酶解液进行超滤分离，将胶原酶解多肽分为若干超滤组分，冻干不同分子量分布的多肽液，得到多肽冻干粉；
S4.称取适量的不同分子量的多肽冻干粉，分别配制成多肽溶液，测定其对ACE抑制率的大小，筛选得到对ACE抑制活性最强的多肽冻干粉；
S5.将筛选得到的多肽冻干粉采用LC-MS/MS进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得若干多肽序列；
S6.通过软件将多肽序列与ACE蛋白进行分子对接，在对接之前通过能量最小化将多肽的2D结构转换为3D结构，筛选得到与ACE蛋白的结合能力强的多肽序列；
S7.将筛选得到的多肽序列进行固相合成，筛选活性高的多肽序列，即得到ACE抑制肽P2。
5.如权利要求4所述的ACE抑制肽P2的制备方法，其特征在于，步骤S1中酶解温度为55℃，酶底比为2％，pH为12，酶解时间为6h。
6.如权利要求4所述的ACE抑制肽P2的制备方法，其特征在于，步骤S3中选择截留量为1kDa和5kDa的聚醚砜超滤膜对多肽酶解液进行超滤分离，将胶原酶解多肽分为Mw<1kDa，1kDa<Mw<5kDa和Mw>5kDa的三个超滤组分，冻干以上三个不同分子量分布的多肽液，得到多肽冻干粉。
7.如权利要求4所述的ACE抑制肽P2的制备方法，其特征在于，步骤S5中质谱测定条件为：色谱柱为PepMap RPLC C18，阳离子模式，扫描范围：m/z 300–1500Da，发射极喷雾电压2kV。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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