CN101240016A

CN101240016A - 鲨鱼蛋白降压肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101240016A
Application number: CNA200810014406XA
Authority: CN
Inventors: 张玉忠; 吴昊; 何海伦; 陈秀兰; 周百成
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2008-02-28
Filing date: 2008-02-28
Publication date: 2008-08-13

Abstract

鲨鱼蛋白降压肽及其制备方法与应用，属于海洋生物技术领域。从鲨鱼的蛋白酶解产物中分离纯化出新的具有两个氨基酸的降压肽，具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。制备步骤包括酶解鲨鱼蛋白制备酶解液、从酶解液中分离纯化降压肽和降压肽的序列测定。本发明降压肽可应用于制备降压药物。本发明将微生物酶工程技术应用于鲨鱼的深层次开发利用，得到的具有新序列短肽，具有高的ACE抑制活力。

Description

鲨鱼蛋白降压肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种从鲨鱼肉的酶解产物中分离纯化出的具有新的氨基酸序列的降压肽及其制备方法与应用，属于海洋生物技术领域。

背景技术

由食物蛋白经过部分酶解所得的短肽越来越引起食物学家的重视。这些短肽具有各种活性，比如：提高免疫力，提高营养吸收率，抗高血压活性。具有这些活性的蛋白已经从食物蛋白酶解物中纯化出来，这些肽在蛋白质序列内是没有活性的，只有通过酶解或食物加工从蛋白中释放出来才具有活性。

血管紧张素转化酶(ACE)是一种能够催化血管紧张素1转化成血管紧张素2的羧肽酶，能够导致血压升高，因此抑制ACE活性，可以导致血液中的血管紧张素2的浓度降低，从而导致血压降低。虽然人工合成的ACE抑制剂具有明显的降血压效果，但是副作用太大，因此现在必须找到更安全、新颖、高效的治疗高血压的药物。现在从不同的蛋白中通过不同的酶进行酶解，在其酶解物中发现了许多ACE抑制短肽，这些蛋白资源包括牛奶蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、鸡肉蛋白、海洋鱼类蛋白、藻类等，到现在为止已有两百多种具有ACE抑制活性的酶解活性肽被报道，但是现在报道的ACE抑制短肽主要来源于陆地蛋白的酶解物，来源于海洋蛋白酶解物的报道较少，因此，今后，海洋生物蛋白酶解物将成为今后筛选新的ACE抑制肽的重要来源。

鲨鱼本身对外界致癌物质和微生物、病毒等具有极强的免疫力，鲨鱼抗癌防病的机理一直尚未研究清楚。目前对鲨鱼的研究和应用只限于鲨鱼鱼肝油和鲨鱼软骨提取物，但是鲨鱼鱼肝油和鲨鱼软骨仅仅只是鲨鱼身体的一小部分，对除了鲨鱼鱼肝油和鲨鱼软骨之外的大部分鲨鱼材料的研究和应用尚停留在初级阶段。鲨鱼蛋白用于酶解分离降高血压肽的好原料。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鲨鱼蛋白降压肽及其制备方法与应用。

一种鲨鱼蛋白降压肽，其特征在于，是如下短肽之一或组合：

Cys-Phe 肽1，

Glu-Tyr 肽2，

Phe-Glu 肽3。

本发明所述的鲨鱼蛋白降压肽具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性，为白色粉末状，易溶于水，其中，Cys-Phe降压肽的IC₅₀值0.523mg/ml对应为1.96μM，Glu-Tyr降压肽的IC₅₀值0.824mg/ml对应为2.68μM，Phe-Glu降压肽的IC₅₀值0.426mg/ml对应为1.45μM。

本发明上述鲨鱼蛋白降压肽的制备方法，包括酶解鲨鱼蛋白制备酶解液、从酶解液中分离纯化降压肽和降压肽的序列测定。具体步骤如下：

(一)酶解鲨鱼蛋白制备酶解液

按鲜重称取鲨鱼肉45～50重量份原料，打浆，然后加入45～50重量份的蛋白酶制剂，调pH值到6.8～7.3，温度45～50℃，搅拌酶解5.5小时，酶解完毕后，离心，取上清液，即得酶解液。

(二)从酶解液中分离纯化降压肽

用3000Da的超滤膜将酶解液超滤，将超滤小于3000Da的超滤液过Sephadex G-15柱(1.6×80cm，medium Pharmacia)，用蛋白核酸检测仪，在214nm处进行检测，根据从色谱柱分离得到的色谱峰分别收集，收集的洗脱液冻干称重后，测定ACE抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用高压液相色谱分离；PDA检测器检测波长为220nm，然后根据所得的肽的谱图将肽峰分别收集浓缩，测定ACE抑制活性，得到具有高的ACE抑制活力的肽。

进一步优选的，所述的高压液相色谱柱为反相C18柱。

(三)降压肽的序列测定

将分离纯化得到的具有高的ACE抑制活力的肽，用氨基酸自动测序仪测定氨基酸组成，再通过液质连用仪(PE SCIEX API 4000 LC/MS-MS systems，Applied Biosystems，USA)，分析肽的分子量和肽段的分布，然后进行肽的氨基酸序列分析。

进一步优选的，所述的肽的氨基酸序列分析是将肽用6N的HCl在115℃全水解22小时，通过氨基酸自动测序仪进行测定。

优选的，所述的(一)酶解鲨鱼蛋白制备酶解液的步骤中的蛋白酶制剂通过如下方法制得，所述组份的量均为重量份：

(1)液体种子制备

培养基：饼粉2～3份、玉米粉2～3份、麸皮1～1.5份、Na₂HPO₄ 0.4～0.5份、KH₂PO₄ 0.03～0.04份、水100份，灭菌，冷却，接种枯草芽孢杆菌SM98011(Bacillus.Subtilis SM98011)的茄子瓶菌种的菌悬液5～10份，通风搅拌，培养15～18小时，作为液体种子待用。

(2)液体深层发酵制备蛋白酶制剂

培养基：豆饼粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麸皮2.0～2.5份、Na₂HPO₄0.4～0.5份、KH₂PO₄ 0.03～0.04份、水100份，灭菌，接种上述步骤(1)的液体种子，接种量为培养基重量的5～7％，通风搅拌，控温，发酵37～40小时，得蛋白酶制剂，酶活为4000U/ml。该步骤(2)的培养基中还可加入豆油0.3～0.35重量份作消泡剂。

所述的(二)从酶解液中分离纯化降压肽步骤中测定肽的ACE抑制活性方法可用传统方法如分光光度法或高压液相色谱法，也可用毛细管电泳法。优选的，毛细管电泳法具体步骤如下：

将10μl含有1mM底物Hip-His-Leu和0.8mU的血管紧张素转化酶(ACE)的系列样品反应液分别和若干10μl的0.03～40mg/ml酶解液混合为若干组样品。所述系列样品反应液和酶解液都用100mM的硼酸缓冲液(包含0.3M NaCl，pH 8.3)配制。反应液在37℃反应30min，然后用0.1％三氟乙酸TFA(10μl)中止反应。血管紧张素转化酶抑制反应产物直接在毛细管电泳仪上进行检测。毛细管电泳仪为BeckmanCoulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)装置，配备有PDA(photodiode array)检测器，数据采集、分析、系统控制用P/ACE MDQ软件，该软件来自Beckman Coulter(Fullerton，CA)。中止反应后的混合物样品直接用毛细管电泳进行检测，上样压力为1psi，时间为5秒，电泳电压20kV，紫外吸收为228nm，电泳时间5分钟，电泳缓冲液为20mM的硼酸缓冲液(pH 9.18)。每测定一个样品之后用缓冲液冲洗毛细管1分钟。底物和产物马尿酸分别在2.5分钟和3.5分钟出峰，根据上述软件计算马尿酸的峰面积。

ACE抑制活性的计算(IC₅₀值的计算)：

马尿酸配制成不同浓度0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM，1.2mM，2mM，4mM，6mM，通过毛细管电泳测定其峰面积与马尿酸浓度的线性关系。

峰面积＝K×Chip+N

ACE活力(umol/min)＝V×Chip÷t

V：反应体积，t：反应时间，K：根据峰面积和马尿酸浓度求出的曲线常数，Chip：马尿酸浓度，N：马尿酸浓度曲线与Y轴的交点。

通过血管紧张素转化酶作用，不含任何抑制肽，从底物Hip-His-Leu释放出来的马尿酸HA的量被定义为100％ACE活力。抑制50％的ACE活力的海洋蛋白酶解产物的量被定义为酶解产物的抑制活力。IC₅₀值的计算采用线性对数法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))对Log(水解产物浓度mg/ml)作图，所得直线与X轴的交点对应的值为M，10^M为酶解产物抑制ACE活力的IC₅₀值。

上述反应试剂和实验操作，如未作特别说明的，均为本领域常规反应试剂及实验操作。

本发明鲨鱼蛋白降压肽在制备降压药物中的应用。本发明鲨鱼蛋白降压肽具有较高的ACE抑制活性，降血压效果好。本发明所得的短肽产品干燥处理后为白色粉末，易溶于水，可用于制备降压药物。

本发明的优良效果在于将陆地微生物酶工程技术应用于鲨鱼的深层次开发利用。具体体现在1、用鲨鱼作为酶解原料2、从酶解液通过色谱方法分离纯化具有降血压功能的肽3、用ACE反应来检测各步产物的降压活性4、并对得到的具有新序列的具有较高ACE抑制活力的肽，IC₅₀值分别为1.96μM，2.68μM和1.45μM。

附图说明

图1是实施例1步骤(3)经过3000Da的膜超滤的鲨鱼酶解液经过Sephadex G-15柱分离的色谱图。

图2是Sephadex G-15柱分离的D组分样品在高压液相的反相C18柱上分离得到的色谱峰。

图3、图4和图5分别是C18柱上分离得到的色谱峰中的e、h、q号样品的IC₅₀值的线性对数图，证明e、h、q号样品是具有高的ACE抑制活力的纯肽，它们分别是分离纯化的3条肽：Cys-Phe，Glu-Tyr和Phe-Glu。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步阐述，但不限于此。

实施例1.从鲨鱼酶解物中分离纯化得到三条肽Cys-Phe、Glu-Tyr和Phe-Glu。

(1)蛋白酶制剂的制备

种子培养基：以重量份牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、琼脂2份、NaCl 0.5份为培养基，水98份，pH为7.1，灭菌，划线接枯草芽孢杆菌SM98011(Bacillus.SubtilisSM98011)菌种，30℃培养，培养20小时。

发酵培养基：豆饼粉3份、玉米粉2份、麸皮1份、Na2HPO4 0.4份、KH2PO40.04份、水100份，加豆油0.3份作消泡剂。120℃灭菌30分钟，冷却后，接上种子的菌悬液10份，150升发酵罐中，装样量70升，于30℃下，通风量(V_风/V_液·时间)1∶0.6，搅拌330转/分钟，培养36小时。此时pH7.0。

(2)酶解短肽的制备

首先称取50份(鲜重)的鲨鱼肉，打浆。然后加入50份(液体重量)的蛋白酶制剂，调pH值到7.2，50℃，搅拌酶解5小时，酶解完毕，5000rpm离心，上清为酶解短肽液。

(3)降压肽的分离纯化

将上清液用3000Da的膜超滤，然后将超滤液上Sephadex G-15柱，分离得到6个峰，分别收集，测定ACE抑制活力，得到第D号峰具有较高的ACE抑制活力(见图1)，反复收集，上高压液相色谱，将D号样品进一步分离，得到17个色谱峰(见图2)，其中有3个峰具有较高的ACE抑制活力，这3个峰对应的肽分别为：Cys-Phe，Glu-Tyr和Phe-Glu。

(4)降压肽的序列测定

将步骤(3)得到的具有较高ACE抑制活力3个纯肽用6N的HCl全水解，用氨基酸自动测序仪测定氨基酸组成，然后用液质连用仪分析3条肽的分子量和肽段的分布，分析出3条肽的氨基酸序列为：Cys-Phe，Glu-Tyr和Phe-Glu。毛细管电泳法测定IC₅₀值分别为为1.96，2.68和1.45μM。如图3，图4和图5所示。根据现有技术具有酶解ACE抑制肽的IC₅₀值为0.2μM-600μM，IC₅₀值越小，说明对ACE的抑制作用越强，降血压效果越好。由此证明，从鲨鱼酶解物中分离纯化的三条肽具有较高的ACE抑制活性。

本实施例所得的短肽产品干燥处理后为白色粉末，易溶于水。

实施例2：如实施例1所述，所不同的是原料鲨鱼的用量不一样，取45份(鲜重)的鲨鱼肉，打浆。然后加入50份(液体重量)的蛋白酶制剂。

本发明的短肽具有较高的ACE抑制活性，因为本发明的三条肽均为二肽，因此，在消化道内，很难被进一步的酶解，可被直接吸收利用，因此，推测在体内也会发挥较好的降血压活性。本发明的特点在于：集酶工程技术和肽纯化鉴定技术于一体，对对鲨鱼至今未被有效利用的蛋白部分进行了深入的开发利用，发现了有新的氨基酸序列组成的ACE抑制肽并保证了在体内的功能性，为以后降压药物的开发奠定了基础。

Claims

1.一种鲨鱼蛋白降压肽，其特征在于，是如下短肽之一或组合：

Cys-Phe 肽1，

Glu-Tyr 肽2，

Phe-Glu 肽3。

2.如权利要求1所述的鲨鱼蛋白降压肽，其特征在于，所述的鲨鱼蛋白降压肽具有较高的血管紧张素转化酶抑制活性，为白色粉末状，易溶于水，其中，Cys-Phe降压肽的IC₅₀值为0.523mg/ml对应为1.96μM，Glu-Tyr降压肽的IC₅₀值为0.824mg/ml对应为2.68μM，Phe-Glu降压肽的IC₅₀值为0.426mg/ml对应为1.45μM。

3.一种权利要求1所述的鲨鱼蛋白降压肽的制备方法，具体步骤如下：

(1)酶解鲨鱼蛋白制备酶解液

按鲜重称取鲨鱼肉45～50重量份原料，打浆，然后加入45～50重量份的蛋白酶制剂，调pH值到6.8～7.3，温度45～50℃，搅拌酶解5.5小时，酶解完毕后，离心，取上清液，即得酶解液；

(2)从酶解液中分离纯化降压肽

用3000Da的超滤膜将酶解液超滤，将超滤小于3000Da的超滤液过Sephadex G-15柱(1.6×80cm，medium Pharmacia)，用蛋白核酸检测仪，在214nm处进行检测，根据从色谱柱分离得到的色谱峰分别收集，收集的洗脱液冻干称重后，测定ACE抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用高压液相色谱分离；PDA检测器检测波长为220nm，然后根据所得的肽的谱图将肽峰分别收集浓缩，测定ACE抑制活性，得到具有高的ACE抑制活力的肽；

(3)降压肽的序列测定

4.如权利要求3所述的鲨鱼蛋白降压肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所用高压液相色谱柱为反相C18柱。

5.如权利要求3所述的鲨鱼蛋白降压肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的肽的氨基酸序列分析是将肽用6N的HCl在115℃全水解22小时，通过氨基酸自动测序仪进行测定。

6.如权利要求3所述的鲨鱼蛋白降压肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的所述的蛋白酶制剂通过如下方法制得，均为重量份：

液体种子制备：

培养基：饼粉2～3份、玉米粉2～3份、麸皮1～1.5份、Na₂HPO₄ 0.4～0.5份、KH₂PO₄ 0.03～0.04份、水100份，灭菌，冷却，接种枯草芽孢杆菌SM98011(Bacillus.Subtilis SM98011)的茄子瓶菌种的菌悬液5～10份，通风搅拌，培养15～18小时，作为液体种子待用；

液体深层发酵制备蛋白酶制剂：

培养基：豆饼粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麸皮2.0～2.5份、Na₂HPO₄0.4～0.5份、KH₂PO₄ 0.03～0.04份、水100份，灭菌，接种上述的液体种子，接种量为培养基重量的5～7％，通风搅拌，控温，发酵37～40小时，得蛋白酶制剂。

7.如权利要求6所述的鲨鱼蛋白降压肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶制剂的制备步骤中的培养基中加豆油0.3～0.35重量份作消泡剂。

8.如权利要求3所述的鲨鱼蛋白降压肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中测定肽的ACE抑制活性方法是毛细管电泳法。

9.权利要求1所述的鲨鱼蛋白降压肽在制备降压药物中的应用。