CN104263789B

CN104263789B - 体外模拟胃肠消化制备绿鳍马面鲀鱼皮抗氧化肽液的方法

Info

Publication number: CN104263789B
Application number: CN201410515066.4A
Authority: CN
Inventors: 周存山; 马海乐; 余筱洁; 何荣海; 秦晓佩; 胡佳丽
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2034-09-29
Also published as: CN104263789A

Abstract

本发明涉及体外模拟胃肠消化制备绿鳍马面鲀鱼皮抗氧化肽液的方法，属于食品加工技术和蛋白利用技术领域。采用的制备工艺以绿鳍马面鲀鱼皮为原料，经剪切、烘干、粉碎等预处理后，使用体外模拟胃肠消化技术，由含胃蛋白酶、胰蛋白酶构建的双酶模拟胃肠消化体系，沸水浴灭酶、调节pH法集成2次离心手段制备鱼皮蛋白抗氧化肽液。本发明的制备方法采用双酶酶解反应体系，极大地提高了鱼皮蛋白的水解效率，使原料得以充分利用；体外模拟胃肠消化过程，在37℃水浴中进行，酶解条件温和，与人体相近，能更好地反映人体的消化过程。

Description

体外模拟胃肠消化制备绿鳍马面鲀鱼皮抗氧化肽液的方法

技术领域

本发明属于食品加工技术和蛋白利用技术领域，具体涉及利用体外模拟胃肠消化制备鱼皮蛋白抗氧化肽液的方法。

背景技术

绿鳍马面鲀，亦称马面鲀、马面鱼，因皮较厚且硬，少部分用于制造饲料鱼粉，而大部分在加工过程中被剥除丢弃，这不仅严重污染了环境，而且还造成资源的极大浪费。马面鱼皮中粗蛋白含量一般在40%以上，其氨基酸组成丰富。之前有报道称马面鱼皮不能食用，目前对马面鱼皮的开发利用主要有提取氨基酸、制胶、制革、提取食用水溶性蛋白质，提取鱼皮胶原蛋白及其特性的研究。因此，研究马面鱼皮蛋白的抗氧化多肽具有可观的现实意义和经济意义。

多肽是α-氨基酸以肽键连接而成的化合物，也是蛋白质分解的中间体，通常分子量在200Da到10000Da之间，能透过半透膜，不能被三氯乙酸及硫酸铵等沉淀。随着人们发现某些蛋白质具有清除生物体内过量游离基，抑制脂质氧化作用后，肽的抗氧化性成为一大热点。抗氧化肽的制取方法主要有直接提取法、酸碱水解法、酶水解法、发酵法、化学合成法和基因重组法。针对鱼皮蛋白的结构特性而言，现有的生产工艺、方法依照设计流程主要可分为两类：

（1）将鱼皮干燥、粉碎，采用蛋白酶水解制得蛋白多肽酶解液，最后进行冷冻干燥获得多肽粉。直接相关的研究结果很少，就相关技术而言，例如：中国专利CN103431154A，CN102676621B中，直接以菜籽粕或者菜籽分离蛋白质为原料，通过中性蛋白酶或碱性蛋白酶法水解，获得功能多肽。

（2）对鱼皮进行预处理，再接种微生物菌种，进行发酵获得多肽产品。类似的相关技术有：CN103436581A，CN101654696B中，采用湿法球磨（250-400r/min）联合纤维素酶（5-10μg）预处理1-3h，接着中性蛋白酶酶解，得到粗制多肽溶液；另外有将菜籽粕粉与营养液混合制备液态发酵培养基，微生物接入液态发酵培养基发酵，固液分离，得到多肽的粗提液。

长期以来，传统的蛋白酶解法（中性蛋白酶或碱性蛋白酶）和微生物发酵法在制备鱼皮胶原蛋白多肽的工业生产实践中发挥了很大作用。但由于单一酶酶解效率低，且为维持最适酶解pH需在酶解过程中不断添加碱液以维持恒定pH，酶解产物中存在大量钠盐，从而不利于高血压人群使用等缺点，使该方法存在一定的安全隐患。另外，微生物发酵法，主要采用黑曲霉、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或橙黄红酵母等具有较高蛋白酶酶解活力、脂肪酶酶解活力、产酸能力的菌株进行发酵生产多肽。该方法中，由于接种微生物的不稳定性和其他微生物的影响使得到的产品难以达到所需的功能性要求；另一方面，从发酵液中分离多肽能耗高，废液量大，产物复杂，安全性不高等缺点也使微生物发酵法不能得以很好利用。

随着对环境保护，生产监控及产品稳定性等日趋规范及对蛋白资源利用水平要求认识的不断重新定义和逐步提高，以上两种方法的主要不足使得蛋白酶解工艺、方法在工业生产中的应用前景不佳，将逐步被新的技术和理念所替代。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中由于单酶酶解效率不高，酶解反应中不断调节pH而大量使用NaOH，增大盐浓度，酶解产物活性和多肽分子量关联特征不够清晰等问题，提供一种基于模拟人体胃肠消化体系，构建极为安全的鱼皮蛋白多肽制备方法。

本发明的技术工艺与科学原理如下：

随着马面鱼资源的积极开发，它已成为我国主要的海产经济鱼类，鱼皮资源相当丰富，使得多肽增值化利用成为其极有前途的方向，基于高效安全的胃肠消化模式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶双酶模拟胃肠消化体系，制备具有抗氧化特性且分子量分布明确的鱼皮蛋白多肽；本发明中的胃液消化体系和十二指肠液消化体系是模拟人体消化原理所构筑的双酶分步反应体系，模拟胃消化结束时未进行灭酶处理，直接进行模拟十二指肠液消化，有利于充分酶解消化反应；此外，消化结束时，进行沸水浴终止反应，离心获取上清液后，调节pH去除大分子蛋白，进行二次离心，获得精制的鱼皮蛋白抗氧化肽液。其优点是：双酶作用位点更多，使得酶解效率更高；沸水浴和调节pH，2次离心能有效去除少量未被酶解的大分子蛋白，使得所制备的多肽纯度更高。

本发明的技术构思是创新性地采用双酶体外模拟胃肠消化技术，提高酶解效率，采用沸水浴变性蛋白酶和pH等电点沉淀蛋白技术，高效安全的酶解手段和简单可行的多肽纯化精制工艺集成创新，因此本发明中的方法较传统方法更适合于大规模开发鱼皮蛋白抗氧化肽液。

本发明体外模拟胃肠消化制备鱼皮蛋白抗氧化肽液的方法，实施流程图如图1所示，按照下述步骤进行：

（1）取烘干的鱼皮，粉碎，获得粗蛋白质量百分含量为40%的鱼皮蛋白原料。

（2）模拟胃肠消化体系：

模拟胃液（称取0.20g NaCl，0.32g胃蛋白酶，7 mL 蒸馏水，0.7 mL 3mol/L盐酸,盐酸调pH至1.2±0.1，蒸馏水定容至100 mL。），

模拟十二指肠液（称取0.70g磷酸二氢钾溶于25 mL蒸馏水中，振荡使之完全溶解，加入19 mL 0.2mol/L NaOH和40 mL蒸馏水，加入1.0g胰蛋白酶，用0.2mol/L NaOH调pH至6.4±0.1，蒸馏水定容至100 mL。）温度37℃，消化时间1 h。

（3）在100 mL锥形瓶中加入25 mL模拟胃液，37℃恒温水浴5min。加入一定质量的鱼皮粉4-8%，迅速涡旋震荡并快速置于37℃水浴，搅拌酶解4h。然后加入37℃恒温水浴5min的模拟十二指肠液175mL，调节pH至6.4，37℃恒温条件下酶解1h。

（4）沸水浴10 min终止反应；4500r/min离心10min，取上清液调节pH至4.2，4500r/min离心30min去除大分子蛋白，获得鱼皮蛋白抗氧化肽液。

其中步骤（1）中的鱼皮原料是指经烘干、剪切、粉碎后的鱼粉，且蛋白含量40%以上。

其中步骤（3）中模拟胃液和模拟十二指肠液消化反应前都进行了37℃恒温水浴5min预热处理。

其中步骤（3）中模拟胃液消化4h后，未进行胃蛋白酶灭酶处理，直接进行模拟十二指肠液消化1h。

其中步骤（4）进行了沸水浴和调节pH两种方法结合变性法和等电法沉淀蛋白，集成2次离心法脱除大分子蛋白。

其中步骤（4）中所得的鱼皮蛋白多肽中含有分子量为2152Da、1352Da的多肽，两者可能与抗氧化活性相关。

本发明的有益效果如下：

（1）本发明的制备方法采用胃蛋白酶、胰蛋白酶双酶酶解反应体系，极大地提高鱼皮蛋白水解效率，充分利用原料，使得废弃液中的蛋白更少。

（2）本发明的制备方法是模拟胃肠消化过程，温度在37℃，条件温和，并未进行常规酶解中不断添加NaOH维持反应在最适pH进行，反应过程更加绿色；另外，由于模拟最完美的人体胃肠消化手段，在潜在食品安全方面，较微生物发酵更有优势。

（3）本发明的制备方法中沸水浴变性去蛋白和pH等电点沉淀蛋白技术，结合2次离心分离手段，使得所制备的多肽含量更高，精制过程更加低碳节能、简便易行。

附图说明

图1是体外模拟胃肠消化制备鱼皮蛋白抗氧化肽液的工艺流程图。

图2是标准分子量蛋白和多肽对照品色谱图(A)，其中1-67000Da；2-12500Da；3-204Da；

鱼皮抗氧化肽液多肽分子量分布色谱图（B），1-2152Da；2-1352Da；3-190Da。

图3是游离氨基酸标准品(A)分析测试色谱图，鱼皮原料(B)和鱼皮蛋白抗氧化肽液(C)中游离氨基酸测试色谱图。

具体实施方式

本发明采用液相色谱法、氨基酸分析仪、DPPH清除率、O₂ ^-·（超氧自由基）清除率分别测定多肽液中肽分子量分布、游离氨基酸组成及含量、DPPH清除能力和O₂ ^-·（超氧自由基）清除能力。

（1）肽分子量分布

色谱柱：TSKgel-G2000 SW_XL(7.8mm×30cm，Tosoh)；流动相：0.1mol/L Na₂SO₄+0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.7）；柱温30℃；检测波长：220 nm；流速：0.5 mL/min；进样量：10μL。1260型安捷伦液相色谱仪（安捷伦科技贸易公司）

（2）游离氨基酸组成及含量

通过全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸组分和含量。吸取不同消化时间的酶解液0.1 mL于1.5 mL离心管中，加入0.9 mL 1%的磺基水杨酸，沉淀2h，10000rpm/min离心15min，取上清液，用0.22μm微膜（水膜）过滤至样品瓶中，供上机测定，德国Sykam-433D全自动氨基酸分析仪（SYKAM公司）。

（3）DPPH清除能力

2 mL DPPH溶液（在95％乙醇中的浓度为0.1mmol/L）与2 mL样品溶液混合。混合物在室温下避光静置30min，用VIS-7220N型可见分光光度计在517nm处测定吸光度。使用蒸馏水代替样品作为对照。DPPH·清除率计算公式如下

（式1）

式（1）中

A _{517 sample}—样品溶液在517nm处的吸光度

A _{517 control}—空白对照蒸馏水在517nm处的吸光度。

（4）O₂ ^-·（超氧自由基）清除能力

采用邻苯三酚自氧化法测定，取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=8.2）4.5 mL，置于25℃水浴中保温20min，分别加入1 mL样品溶液和0.4 mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1 mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度A _x。空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品，测定吸光度A ₀。每个试样做3个平行样，取平均值，按下式计算O₂ ^-·清除率

（式2）

式（2）中

A ₀—空白对照液吸光度

A _x—样品溶液吸光度

以上均为常规的液相色谱仪、氨基酸分析仪及抗氧化活性测定方式。

实施例1

在100 mL锥形瓶中加入25 mL模拟胃液，37℃恒温水浴5min。加入鱼皮粉8%，迅速涡旋震荡并快速置于37℃水浴，搅拌酶解4h。然后加入模拟肠液175mL，调节pH至6.4，37℃恒温条件下酶解1h。沸水浴10 min终止反应；4500r/min离心10min，取上清液调节pH至4.2，4500r/min离心30min去除大分子蛋白，即得鱼皮蛋白抗氧化肽液。DPPH清除率84.65±0.34%，O₂ ^-·（超氧自由基）清除率27.55±0.23%。肽液中分子量分布为190-5000Da的多肽占总多肽含量的79.89%，其中主要多肽的分子量为2152Da、1352Da。

标准分子量蛋白和多肽对照品高效液相色谱图和本发明的新工艺制得的鱼皮蛋白抗氧化肽液分子量分布高效液相色谱图如图2所示。

游离氨基酸标准品分析测试氨基酸分析仪色谱图和本发明的新工艺制得的鱼皮蛋白抗氧化肽液游离氨基酸的氨基酸分析仪色谱图如图3，结果见表1所示。

实施例2

在100 mL锥形瓶中加入25 mL模拟胃液，37℃恒温水浴5min。加入鱼皮粉6%，迅速涡旋震荡并快速置于37℃水浴，搅拌酶解4h。然后加入模拟肠液175mL，调节pH至6.4，37℃恒温条件下酶解1h。沸水浴10 min终止反应；4500r/min离心10min，取上清液调节pH至4.2，4500r/min离心30min去除大分子蛋白，即得鱼皮蛋白抗氧化肽液。DPPH清除率78.14±0.38%，O₂ ^-·（超氧自由基）清除率25.63±0.35%。

实施例3

在100 mL锥形瓶中加入25 mL模拟胃液，37℃恒温水浴5min。加入一定质量的鱼皮粉4%，迅速涡旋震荡并快速置于37℃水浴，搅拌酶解4h。然后加入模拟肠液175mL，调节pH至6.4，37℃恒温条件下酶解1h。沸水浴10 min终止反应；4500r/min离心10min，取上清液调节pH至4.2，4500r/min离心30min去除大分子蛋白，即得鱼皮蛋白抗氧化肽液。DPPH清除率77.23±0.35%，O₂ ^-·（超氧自由基）清除率24.93±0.40%。

表1 鱼皮原料和鱼皮蛋白抗氧化肽液中游离氨基酸的组成和含量（μg/100mg）

游离氨基酸	原料	肽液
			磷酸丝氨酸（Pser）	6.04	64.90
牛磺酸（Tau）	7.87	0.000
			天冬氨酸（Asp）	0.000	0.000
苏氨酸（Thr）	0.000	0.000
			丝氨酸（Ser）	0.000	18.70
天冬酰胺（Asn）	0.000	0.000
			谷氨酸（Glu）	0.000	0.000
α-氨基己二酸（α-Aaa）	0.000	0.000
			脯氨酸（Pro）	0.000	0.000
甘氨酸（Gly）	6.45	14.50
			丙氨酸（Ala）	3.54	31.80
瓜氨酸（Cit）	0.000	0.000
			α-氨基丁酸（α-Aba）	0.000	0.000
缬氨酸（Val）	0.000	25.50
			胱氨酸（Cys）	0.000	0.000
甲硫氨酸（Met）	0.000	32.00
			异亮氨酸（Ile）	16.80	115.80
亮氨酸（Leu）	21.42	168.20
			酪氨酸（Tyr）	0.000	0.000
苯丙氨酸（Phe）	0.000	79.20
			β-丙氨酸（β-Ala）	0.000	152.00
β-氨基异丁酸（β-Aiba）	0.000	402.90
			γ-氨基丁酸（γ-Aba）	0.59	95.40
组氨酸（His）	0.84	18.7
			肌肽（Carnosine）	0.000	105.40
色氨酸（Trp）	0.000	130.6
			鸟氨酸（Orn）	26.42	144.80
赖氨酸（Lys）	17.63	89.10
			精氨酸（Arg）	9.20	19.50

Claims

1.体外模拟胃肠消化制备绿鳍马面鲀鱼皮蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）取烘干的鱼皮，粉碎，获得粗蛋白质量百分含量为40%的鱼皮蛋白原料；

（2）模拟胃肠消化体系：

模拟胃液按照下述步骤制备：称取0.20g NaCl，0.32g胃蛋白酶，7 mL 蒸馏水，0.7 mL3mol/L盐酸, 盐酸调pH至1.2±0.1，蒸馏水定容至100 mL；

模拟十二指肠液按照下述步骤制备：称取0.70g磷酸二氢钾溶于25 mL蒸馏水中，振荡使之完全溶解，加入19 mL 0.2mol/L NaOH和40 mL蒸馏水，加入1.0g胰蛋白酶，用0.2mol/LNaOH调pH至6.4±0.1，蒸馏水定容至100 mL；温度37℃，消化时间1 h；

（3）在100 mL锥形瓶中加入25 mL模拟胃液，37℃恒温水浴5min；

加入占总质量4-8%的鱼皮粉，迅速涡旋震荡并快速置于37℃水浴，搅拌酶解4h；

然后加入37℃恒温水浴5min的模拟十二指肠液175mL，调节pH至6.4，37℃恒温条件下酶解1h；

2.根据权利要求1所述的体外模拟胃肠消化制备绿鳍马面鲀鱼皮蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在于其中步骤（4）中所得的鱼皮蛋白多肽中含有分子量为2152Da、1352Da的多肽。