CN111154826A - 东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法及筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,包括以下步骤:步骤1、将新鲜东亚飞蝗低温烘干至恒重然后进行微细粉碎处理,得到东亚飞蝗粉;步骤2、向所述东亚飞蝗粉中加入水及蛋白酶,在pH 7.0~9.0,温度45~65℃的条件下酶解2~6h后,得酶解液;对所述酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤;步骤3、对超滤后的酶解液进行喷雾干燥,得到东亚飞蝗抗氧化肽。本发明提供的一种东亚飞蝗抗氧化肽的筛选方法。本发明提供的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法及筛选方法为利用东亚飞蝗开发具有高附加值的生物制品奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于抗氧化肽制备领域,具体涉及一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法及筛选方法。
背景技术
抗氧化肽活性强、相对分子质量小、易吸收,能捕捉和消除生物体内多余自由基、延缓脂质过氧化,已成为国内外研究较多的一种生物活性肽。抗氧化肽的来源目前大多集中于大黄鱼、蚕蛹蛋白、蛋清、猪皮、牡丹籽、乳清蛋白等。
东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis),又名飞蝗,昆虫纲,直翅目,蝗科。虽然东亚飞蝗是小麦、玉米、水稻等主要农作物的害虫,但它也是一种宝贵的生物资源。东亚飞蝗体内含有丰富的蛋白质,其蛋白质含量占其自身体质量的25%(鲜虫),干虫则占到65%以上。同时,东亚飞蝗含有大量的优质蛋白,其体内必需氨基酸含量总和高于FAO/WHO标准模式中必需氨基酸总量,极具开发潜力。东亚飞蝗种群繁殖强、可培养的特点,我国蝗虫年产量达几百吨,产量巨大。东亚飞蝗抗氧化肽的研制不仅丰富东亚飞蝗产品种类、发展东亚飞蝗精深加工产业链,还可以开发东亚飞蝗中的抗氧化肽资源,运用到医药、功能性食品、化妆品等的生产中可以大幅度提高产品的附加值,从而增加农民养殖东亚飞蝗的积极性。而实际中,东亚飞蝗常被作为食品资源,对其抗氧化肽产品开发极少。
综上所述,一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法及筛选方法亟待开发。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法;
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种东亚飞蝗抗氧化肽的筛选方法。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,包括以下步骤,
步骤1、将新鲜东亚飞蝗低温烘干至恒重然后进行微细粉碎处理,得到东亚飞蝗粉;
步骤2、向所述东亚飞蝗粉中加入水及蛋白酶,在pH 7.0~9.0,温度45~65℃的条件下酶解2~6h后,得酶解液;对所述酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤;
步骤3、对超滤后的酶解液进行喷雾干燥,得到东亚飞蝗抗氧化肽。
优选的,步骤1中,低温烘干温度为35~45℃,烘干时间是24~48h。
优选的,所述微细粉碎处理是采用高精密微细粉碎机进行粉碎,功率为18.5kW,转速为9000r/min。
优选的,步骤2中,东亚飞蝗粉与水的质量比为1:10~1:35。
优选的,步骤2中,所述蛋白酶为碱性蛋白酶;蛋白酶添加量为东亚飞蝗粉和水总质量的1~5%。
优选的,灭酶时需将酶解液升温至90~99℃,灭酶5~20min。
优选的,对酶解液进行离心时,离心速度是5000~10000rpm,离心15~5min;进行喷雾干燥时,喷雾干燥机进口温度为150~170℃,喷雾干燥机出口温度为60~80℃。
优选的,步骤2,向所述东亚飞蝗粉中加入水、蛋白酶、皂土及石油醚,超声振荡,固液分离,提取液体,在pH 7.0~9.0,温度45~65℃的条件下酶解2~6h后,得酶解液;对所述酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤;其中皂土与石油醚的质量比为1:1,皂土添加量为东亚飞蝗粉和水总质量的1~5%。
采用上述制备方法制得的东亚飞蝗抗氧化肽的筛选方法,对离心后的酶解液上清液进行超滤,采用截留分子量不同规格的超滤膜纯化及浓缩,所述超滤膜膜压力采用0.1~1.0Mpa,流速0.1~1mL/s,处理温度为10~30℃,制得含有不同分子量肽段的浓缩纯化酶解液,对其通过检测不同分子量肽段的超氧阴离子和过氧化氢清除能力,筛选清除能力最强的肽段;将含有筛选出的肽段的浓缩纯化酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤后,进行喷雾干燥,得到东亚飞蝗抗氧化肽。
优选的,
超氧阴离子清除能力的测定:
取适量样品液浓缩纯化酶解液加入到离心管中,加入适量468μM还原型辅酶Ⅰ,接着加入适量300μM氮四唑蓝,混匀,立即加入60μM 5-甲基吩嗪硫酸甲酯,涡漩混匀并在室温下反应5min,在560nm下测定吸光度为As;空白组:用pH=8.0的Tris-HCl溶液代替所述样品液浓缩纯化酶解液和还原型辅酶Ⅰ,调零;对照组:用Tris-HCl代替样品液浓缩纯化酶解液,测定吸光值为Ac;其中,清除率计算采用以下公式:
过氧化氢清除能力的测定:
取117μL酶解液与30μL H2O2溶液混合均匀,10min后在230nm处测定吸光值为A样品,用PBS溶液作为空白对照测定吸光值为A空白。
本案给出的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法具有以下有益效果:
1)本发明使用的原料东亚飞蝗繁殖能力强易于养殖,其蛋白质含量高达25%(鲜虫)并含有大量的优质蛋白;
2)以东亚飞蝗为原料制备抗氧化肽,为利用东亚飞蝗开发具有高附加值的生物制品奠定了基础;
3)步骤2中增加皂土及石油醚,有利于降低东亚飞蝗抗氧化肽的降解速度,可长期保持其活性。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
本发明提供一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,包括以下步骤,
步骤1、将新鲜东亚飞蝗低温烘干至恒重然后进行微细粉碎处理,得到东亚飞蝗粉;
步骤2、向所述东亚飞蝗粉中加入水及蛋白酶,在pH 7.0~9.0,温度45~65℃的条件下酶解2~6h后,得酶解液;对所述酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤;
步骤3、对超滤后的酶解液进行喷雾干燥,得到东亚飞蝗抗氧化肽。其中,步骤1中,低温烘干温度为35~45℃,烘干时间是24~48h;所述微细粉碎处理是采用高精密微细粉碎机进行粉碎,功率为18.5kW,转速为9000r/min;步骤2中,东亚飞蝗粉与水的质量比为1:10~1:35;步骤2中,所述蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶;蛋白酶添加量为东亚飞蝗粉和水总质量的1~5%;灭酶时需将酶解液升温至90~99℃,灭酶5~20min;对酶解液进行离心时,离心速度是5000~10000rpm,离心15~5min;进行喷雾干燥时,喷雾干燥机进口温度为150~170℃,喷雾干燥机出口温度为60~80℃;
步骤2,向所述东亚飞蝗粉中加入水、蛋白酶、皂土及石油醚,超声振荡,固液分离,提取液体,在pH 7.0~9.0,温度45~65℃的条件下酶解2~6h后,得酶解液;对所述酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤;其中皂土与石油醚的质量比为1:1,皂土添加量为东亚飞蝗粉和水总质量的1~5%。
一种采用上述制备方法制得的东亚飞蝗抗氧化肽的筛选方法,对离心后的酶解液上清液进行超滤,采用截留分子量不同规格的超滤膜纯化及浓缩,所述超滤膜膜压力采用0.1~1.0Mpa,流速0.1~1mL/s,处理温度为10~30℃,制得含有不同分子量肽段的浓缩纯化酶解液,对其通过检测不同分子量肽段的超氧阴离子和过氧化氢清除能力,筛选清除能力最强的肽段;将含有筛选出的肽段的浓缩纯化酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤后,进行喷雾干燥,得到东亚飞蝗抗氧化肽。其中,
超氧阴离子清除能力的测定:
取适量样品液浓缩纯化酶解液加入到离心管中,加入适量468μM还原型辅酶Ⅰ,接着加入适量300μM氮四唑蓝,混匀,立即加入60μM 5-甲基吩嗪硫酸甲酯,涡漩混匀并在室温下反应5min,在560nm下测定吸光度为As;空白组:用pH=8.0的Tris-HCl溶液代替所述样品液浓缩纯化酶解液和还原型辅酶Ⅰ,调零;对照组:用Tris-HCl代替样品液浓缩纯化酶解液,测定吸光值为Ac;其中,清除率计算采用以下公式:
过氧化氢清除能力的测定:
取117μL酶解液与30μL H2O2(40mM,溶解在pH为7.4的PBS溶液中)溶液混合均匀,10min后在230nm处测定吸光值为A样品,用PBS溶液作为空白对照测定吸光值为A空白。
实施例1:
一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、将新鲜东亚飞蝗放入35℃烘干48h,采用高精密微细粉碎机进行粉碎至粒径为15~20μm的微细颗粒,功率为18.5kW,转速为9000r/min,得到东亚飞蝗粉;
步骤2、取步骤1中所得东亚飞蝗粉10g,然后向其中加入100g蒸馏水,升温至55℃,采用NaOH水溶液调节pH至7.5,加入3.3g诺维信Alcalase碱性蛋白酶,酶解3h,得酶解液;升温至95℃,灭酶10min,冷却至室温后离心得酶解上清液,对离心后的酶解液上清液进行超滤,采用截留分子量不同规格的超滤膜纯化及浓缩,所述超滤膜膜压力为0.2Mpa,流速为0.1ml/s,处理温度为22℃,制得含有不同分子量肽段的浓缩纯化酶解液,对其通过检测不同分子量肽段的超氧阴离子和过氧化氢清除能力,筛选清除能力最强的分子量小于等于3kDa的肽段;
步骤3、将含有步骤2筛选出的肽段的浓缩纯化酶解液酶解液经喷雾干燥将东亚飞蝗抗氧化肽干燥,喷雾干燥机进口温度控制160℃,出口温度控制80℃,制得东亚飞蝗抗氧化肽。
此法制备的东亚飞蝗抗氧化肽超氧阴离子清除率为71.8%,过氧化氢清除率为89.2%。
实施例2:
一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、将新鲜东亚飞蝗放入45℃烘干24h,采用高精密微细粉碎机进行粉碎至粒径为15~20μm的微细颗粒,功率为18.5kW,转速为9000r/min,得到东亚飞蝗粉;
步骤2、取步骤1中所得东亚飞蝗粉10g,然后向其中加入150g蒸馏水,升温至55℃,采用NaOH水溶液调节pH至7.5,加入8.0g诺维信Alcalase碱性蛋白酶,酶解4h,然后升温至95℃,灭酶8min,冷却至室温后离心得酶解上清液,对离心后的酶解液上清液进行超滤,采用截留分子量不同规格的超滤膜纯化及浓缩,所述超滤膜膜压力0.2Mpa,流速为0.2ml/s,处理温度为25℃,制得含有不同分子量肽段的浓缩纯化酶解液,对其通过检测不同分子量肽段的超氧阴离子和过氧化氢清除能力,筛选清除能力最强的分子量小于等于3kDa的肽段;
步骤3、将含有步骤2筛选出的肽段的浓缩纯化酶解液酶解液经喷雾干燥将东亚飞蝗抗氧化肽干燥,喷雾干燥机进口温度控制170℃,出口温度控制75℃,制得东亚飞蝗抗氧化肽。
此法制备的东亚飞蝗抗氧化肽超氧阴离子清除率为73.5%,过氧化氢清除率为85.8%。
实施例3:
一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、将新鲜东亚飞蝗放入45℃烘干24h,采用高精密微细粉碎机进行粉碎至粒径为15~20μm的微细颗粒,功率为18.5kW,转速为9000r/min,得到东亚飞蝗粉;
步骤2、取步骤1中所得东亚飞蝗粉10g,然后向其中加入350g蒸馏水,升温至55℃,采用NaOH水溶液调节pH至7.5,加入18g诺维信Alcalase碱性蛋白酶,酶解6h,然后升温至95℃,灭酶20min,冷却至室温后离心得酶解上清液;对离心后的酶解液上清液进行超滤,采用截留分子量不同规格的超滤膜纯化及浓缩,所述超滤膜膜压力0.2Mpa,流速为0.2ml/s,处理温度为25℃,制得含有不同分子量肽段的浓缩纯化酶解液,对其通过检测不同分子量肽段的超氧阴离子和过氧化氢清除能力,筛选清除能力最强的分子量小于等于3kDa的肽段;
步骤3、将含有步骤2筛选出的肽段的浓缩纯化酶解液酶解液经喷雾干燥将东亚飞蝗抗氧化肽干燥,喷雾干燥机进口温度控制170℃,出口温度控制75℃,制得东亚飞蝗抗氧化肽。
此法制备的东亚飞蝗抗氧化肽超氧阴离子清除率为73.2%,过氧化氢清除率为84.9%。
实施例4:
一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、将新鲜东亚飞蝗放入45℃烘干24h,采用高精密微细粉碎机进行粉碎至粒径为15~20μm的微细颗粒,功率为18.5kW,转速为9000r/min,得到东亚飞蝗粉;
步骤2、取步骤1中所得东亚飞蝗粉10g,然后向其中加入150g蒸馏水,皂土32g及石油醚32g,超声振荡,固液分离,升温至55℃,采用NaOH水溶液调节pH至7.5,加入8.0g诺维信Alcalase碱性蛋白酶,酶解4h,然后升温至95℃,灭酶8min,冷却至室温后离心得酶解上清液,对离心后的酶解液上清液进行超滤,采用截留分子量不同规格的超滤膜纯化及浓缩,所述超滤膜膜压力0.2Mpa,流速为0.2ml/s,处理温度为25℃,制得含有不同分子量肽段的浓缩纯化酶解液,对其通过检测不同分子量肽段的超氧阴离子和过氧化氢清除能力,筛选清除能力最强的分子量小于等于3kDa的肽段;
步骤3、将含有步骤2筛选出的肽段的浓缩纯化酶解液酶解液经喷雾干燥将东亚飞蝗抗氧化肽干燥,喷雾干燥机进口温度控制170℃,出口温度控制75℃,制得东亚飞蝗抗氧化肽。
此法制备的东亚飞蝗抗氧化肽超氧阴离子清除率为73.5%,过氧化氢清除率为85.8%。
将实施例1~4制得的东亚飞蝗抗氧化肽放置0个月,1个月,3个月,6个月后分别加入适量去离子水,测试其超氧阴离子和过氧化氢清除能力:
表1超氧阴离子的清除能力对比:
0个月 | 1个月 | 3个月 | 6个月 | |
实施例1 | 71.8% | 69.8% | 55.3% | 29.7% |
实施例2 | 73.5% | 70.6% | 57.8% | 31.3% |
实施例3 | 73.2% | 69.9% | 58.1% | 30.8% |
实施例4 | 72.9% | 72.4% | 70.8% | 65.2% |
表2过氧化氢清除能力:
0个月 | 1个月 | 3个月 | 6个月 | |
实施例1 | 89.2% | 81.1% | 75.7% | 49.3% |
实施例2 | 85.8% | 79.6% | 69.4% | 46.7% |
实施例3 | 84.9% | 77.2% | 66.8% | 44.2% |
实施例4 | 85.3% | 83.5% | 82.9% | 78.2% |
由上述两表可见,实施例4中的东亚飞蝗抗氧化肽比实施例1~3中的东亚飞蝗抗氧化肽的抗氧化性要强很多。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤,
步骤1、将新鲜东亚飞蝗低温烘干至恒重然后进行微细粉碎处理,得到东亚飞蝗粉;
步骤2、向所述东亚飞蝗粉中加入水及蛋白酶,在pH 7.0~9.0,温度45~65℃的条件下酶解2~6h后,得酶解液;对所述酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤;
步骤3、对超滤后的酶解液进行喷雾干燥,得到东亚飞蝗抗氧化肽。
2.根据权利要求1所述的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,其特征在于,步骤1中,低温烘干温度为35~45℃,烘干时间是24~48h。
3.根据权利要求2所述的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,其特征在于,所述微细粉碎处理是采用高精密微细粉碎机进行粉碎,功率为18.5kW,转速为9000r/min。
4.根据权利要求1、2或3所述的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,其特征在于,步骤2中,东亚飞蝗粉与水的质量比为1:10~1:35。
5.根据权利要求4所述的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,其特征在于,步骤2中,所述蛋白酶为碱性蛋白酶;蛋白酶添加量为东亚飞蝗粉和水总质量的1~5%。
6.根据权利要求5所述的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,其特征在于,灭酶时需将酶解液升温至90~99℃,灭酶5~20min。
7.根据权利要求6所述的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,其特征在于,对酶解液进行离心时,离心速度是5000~10000rpm,离心15~5min;进行喷雾干燥时,喷雾干燥机进口温度为150~170℃,喷雾干燥机出口温度为60~80℃。
8.根据权利要求7所述的东亚飞蝗抗氧化肽的制备方法,其特征在于,步骤2,向所述东亚飞蝗粉中加入水、蛋白酶、皂土及石油醚,超声振荡,固液分离,提取液体,在pH 7.0~9.0,温度45~65℃的条件下酶解2~6h后,得酶解液;对所述酶解液进行灭酶、静置、冷却、离心及超滤;其中皂土与石油醚的质量比为1:1,皂土添加量为东亚飞蝗粉和水总质量的1~5%。
9.一种采用权利要求8所述制备方法制得的东亚飞蝗抗氧化肽的筛选方法,其特征在于,对离心后的酶解液上清液进行超滤,采用截留分子量不同规格的超滤膜纯化及浓缩,所述超滤膜膜压力采用0.1~1.0Mpa,流速0.1~1mL/s,处理温度为10~30℃,制得含有不同分子量肽段的浓缩纯化酶解液,对其通过检测不同分子量肽段的超氧阴离子和过氧化氢清除能力,筛选清除能力最强的肽段;将含有筛选出的肽段的浓缩纯化酶解液经喷雾干燥将东亚飞蝗抗氧化肽干燥,得到东亚飞蝗抗氧化肽。
10.根据权利要求9所述东亚飞蝗抗氧化肽的筛选方法,其特征在于,
超氧阴离子清除能力的测定:
取适量样品液浓缩纯化酶解液加入到离心管中,加入适量468μM还原型辅酶Ⅰ,接着加入适量300μM氮四唑蓝,混匀,立即加入60μM 5-甲基吩嗪硫酸甲酯,涡漩混匀并在室温下反应5min,在560nm下测定吸光度为As;空白组:用pH=8.0的Tris-HCl溶液代替所述样品液浓缩纯化酶解液和还原型辅酶Ⅰ,调零;对照组:用Tris-HCl代替样品液浓缩纯化酶解液,测定吸光值为Ac;其中,清除率计算采用以下公式:
过氧化氢清除能力的测定:
取117μL酶解液与30μL H2O2溶液混合均匀,10min后在230nm处测定吸光值为A样品,用PBS溶液作为空白对照测定吸光值为A空白。
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段玉峰: "蝗虫营养价值与生物学功能研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)》 * |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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